專利名稱：一種蘇云金芽孢桿菌及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物農藥技術領域，具體涉及一種蘇云金芽孢桿菌，更涉及一種蘇云金芽孢桿菌的制備方法，還涉及一種蘇云金芽孢桿菌在殺蟲劑發酵液制備中的應用。
背景技術：
為了擴大蘇云金芽孢桿菌的殺蟲譜和提高殺蟲活性，目前國內外均致力于新菌株的分離鑒定和新的殺蟲基因的開發。在蘇云金芽孢桿菌菌株的分離鑒定、篩選方面， 文獻“三亞地區蘇云金芽孢桿菌的篩選與生物活性測定(安徽農業科學，2009，37 (28) 13660-13661)”、“大茂山地區蘇云金芽孢桿菌分布與多樣性研究(中國農學通報，2011， 27(01) :166-169) ”、“桂林喀斯特地貌分布區蘇云金芽抱桿菌菌株的分離鑒定(中國生物防治，2009，25 (2) :138-142) ”、“河北省果園蘇云金芽孢桿菌菌株的分離鑒定(華北農學報，2010，25 (4) :201-205) ”、及“黑龍江涼水自然保護區蘇云金芽孢桿菌的收集與鑒定(基因組學與應用生物學，2009，284 (4) :685-690) ”等對我國蘇云金芽孢桿菌的分離、鑒定、分布特點、晶體蛋白質形態、殺蟲特性等進行了研究。在高效、特異性菌株的篩選方面，文獻“I 株對多種害蟲高活性的蘇云金桿菌BtCYZ-4(東北林業大學學報，2009，37 (9) =104-105) ”、 “一株對煙草甲高毒力的蘇云金芽孢桿菌的分離與鑒定(化學與生物工程，2009, 26 (5) 42-45) ”、“對美國白蛾高毒力蘇云金桿菌菌株的篩選(河北農業大學學報,2009, 32 (2) 89-92) ”、“對甜菜夜蛾高毒力蘇云金桿菌的分離及生物測定(延邊大學農學學報，2010, 34(2) :238-242) ”、“蠐螬高毒力蘇云金芽孢桿菌研究(現代商貿工業，2010，9 :353-355) ”、 及“蘇云金芽孢桿菌對松材線蟲的殺線活性(中國生物防治，2010，26(1) :85-89)”等分別從眾多的蘇云金芽孢桿菌菌株中篩選到了對煙草甲、美國白蛾、甜菜夜蛾、蠐螬、線蟲等害蟲的高效特異性菌株；在殺蟲基因克隆和工程菌構建方面，目前全世界內已克隆了 71類近 600多個蘇云金芽孢桿菌的基因，文獻“蘇云金芽孢桿菌及其殺蟲晶體蛋白基因資源的研究進展(上海農業學報，2010，26 (4) :135-139) ”、“蘇云金芽孢桿菌cry9Aa基因的克隆、表達及活性分析(植物保護學報，2010，37 (6) =541-546) ”、“蘇云金芽孢桿菌crylAc28基因的克隆及原核表達(東北農業大學學報，2010,41 (10) :61-67) ”、“一株對美國白蛾高毒力蘇云金芽孢桿菌的殺蟲基因鑒定(中國農學通報，2010，26 (3) :242-244) ”、“蘇云金芽胞桿菌 cryllal7基因克隆、表達的研究(東北農業大學學報，2011，42 (4) :93-97) ”、“蘇云金桿菌 cry7Ab8基因的克隆表達及其殺蟲活性(華北農學報，2011，26 (2) :35-38) ”、及“一株含cry 新基因的蘇云金桿菌菌株的研究(華北農學報，2011，26 (I) :54-57) ”等分別分離、鑒定、表達了一系列的新活性基因。在制劑研制方面，文獻“抗紫外線降解蘇云金芽胞桿菌微膠囊劑的制備工藝(華中農業大學學報，2009，28 (3) =281-285) ”、“ 17600IU/mg蘇云金芽孢桿菌濃懸浮劑的研制(湖北農業科學，2010，49 (12) :3048-3051) ”、“0. 18%阿維菌素 100億活芽孢/克蘇云金桿菌粉劑防治馬尾松毛蟲試驗(現代農業科技，2011年第13期143-144) ”、 “蘇云金桿菌與粘蟲顆粒體病毒聯合作用對甜菜夜蛾的影響(揚州大學學報，2011，32 (2) 64-68) ”、“蘇云金芽胞桿菌工程菌WG-001可濕性粉劑的增效化合物篩選(植物保護學報，2011,38(3) :271-275) ”等分別對蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑的制劑化以及與其他殺蟲制劑的聯合應用工藝進行了研究。從生態環境和社會發展的整體出發，高效安全的生物農藥的開發應用對人類、環境和農業的可持續發展都有著重要的意義，蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑是生物農藥中應用最廣泛的一種無公害生物殺蟲劑，有著廣闊的發展前景。但目前生產應用的蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑仍存在殺蟲范圍窄、有效成分易降解、易受環境因素影響等缺點。并且在生產實踐中，由于人工的連續傳代，蘇云金桿菌芽孢和晶體變小、生長速度變慢、殺蟲效果低下等缺點，所以仍需要不斷從自然界中直接分離更加高效、廣譜的蘇云金芽孢桿菌用來開發殺蟲劑
發明內容
本發明的目的是在于提供了一種蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis),本發明命名為BtCS36(保藏號CCTCCM2012040)。該菌是從自然界直接分離，含有多個殺蟲蛋白質編碼基因，對鱗翅目的棉鈴蟲、茶尺蠖、小菜蛾、甜菜夜蛾、菜青蟲等多種害蟲具有高效毒殺作用，是一株對鱗翅目害蟲高效且廣譜的天然蘇云金芽孢桿菌。該菌發酵性能優良，是一株具有開發、應用前景的蘇云金芽孢桿菌天然菌株。本發明的另一個目的是在于提供了一種蘇云金芽孢桿菌的制備方法，利用蘇云金芽孢桿菌芽孢可耐78_82°C高溫的特性以及可以形成伴胞晶體的特性，采用彈土法分離蘇云金芽孢桿菌，以初孵甜菜夜蛾和棉鈴蟲為試蟲，進行毒力生物測定，經過比較毒力致死中量LC5tl,篩選到高毒力菌株BtCS36。本發明的還有一個目的是在于提供了一種蘇云金芽孢桿菌在殺蟲劑發酵液制備中的應用方法，該方法發酵條件合理、簡單易行、發酵周期短、發酵液毒力效價高。利用其生產新型Bt殺蟲劑不僅可以高效防治多種鱗翅目害蟲，保證農作物穩產高產，而且對生態環境安全，因此具有重要的現實意義和緊迫性。為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施—種蘇云金芽孢桿菌的制備方法，其步驟是A、利用蘇云金芽孢桿菌芽孢可耐78_82°C高溫的特性以及可以形成伴胞晶體的特性，米用彈土法(Acta Microbiologica Sinica 30, 380-388),從中國土壤中(湖南長沙) 分離蘇云金芽孢桿菌。B、以初孵甜菜夜蛾和棉鈴蟲為試蟲，進行毒力生物測定，經過比較毒力致死中量 LC50,篩選到高毒力菌株BtCS36。C、采用形態觀察和經典的生理生化鑒定方法，確立了 BtCS36基本的生理生化特性。BtCS36基本的生理生化特性見表I。其具體的生理生化特性如下I. H血清型以BtCS36的鞭毛抗原與Bt的標準抗血清進行交叉凝集反應及交叉吸收凝集反應試驗，BtCS36的H血清型為H7。2.生化特性按Barjac的經典方法進行生理生化試驗。表I蘇云金芽孢桿菌BtCS36菌株的生化特征
權利要求
1.一種蘇云金芽孢桿菌，其特征在于-.Bacillus thuringiensis BtCS36 CCTCCM2012040。
2.權利要求I所述的一種蘇云金芽孢桿菌的制備方法，其步驟是A、利用土壤中蘇云金芽孢桿菌芽孢耐78- 82°C高溫以及形成伴胞晶體的特性，采用彈土法分離蘇云金芽孢桿菌；B、以初孵甜菜夜蛾和棉鈴蟲為試蟲，進行毒力生物測定，經過比較毒力致死中量LC5tl, 篩選到高毒力菌株BtCS36。
3.權利要求I所述的一種蘇云金芽孢桿菌在殺蟲劑發酵液制備中的應用A、采用不同的含固量和不同的C/N比進行正交試驗，得到發酵培養基配方，發酵培養基組成為成分含量單位玉米淀粉 3. 5g棉餅粉2.0g豆餅粉2.0g玉米漿2.0g酵母粉0.4g蛋白胨0.6gMgS040.04gCaC030. 25ga -淀粉酶 100U蒸懼水100mL ；B、采用步驟A中篩選出來的發酵培養基配方，在全自動發酵罐中進行10次以上發酵試驗，確立了其發酵工藝培養基消前PH8. 1，消后pH為7.0左右，每罐接種一支經80°C處理 20分鐘的斜面菌種，接種溫度30°C，采用變溫、變速、變壓0-11小時，32°C、500轉/分、通氣量0. 6立方米/小時；12-21小時，29°C、600轉/分、通氣量0. 8立方米/小時；22小時-發酵結束，32°C、600轉/分、通氣量0.8立方米/小時的發酵手段，確定了發酵工藝，發酵周期為30小時，發酵結束后發酵液酸化至pH5. 0，發酵液對棉鈴蟲的毒力效價達3000-5000IU/ u I。
全文摘要
本發明公開了一種蘇云金芽孢桿菌及制備方法和應用，保藏編號CCTCC M2012040。其步驟是:A、利用土壤中蘇云金芽孢桿菌芽孢耐78－82℃高溫以及形成伴胞晶體的特性，采用彈土法分離蘇云金芽孢桿菌；B、以初孵甜菜夜蛾和棉鈴蟲為試蟲，進行毒力生物測定，經過比較毒力致死中量LC50，篩選到高毒力菌株BtCS36。利用正交試驗和小試發酵，確定了其發酵培養基配方和發酵工藝。利用該菌和確定的發酵工藝發酵周期為30小時左右，發酵液對棉鈴蟲的毒力效價達3000-5000IU/μl。生產新型Bt殺蟲劑不僅可以高效防治多種鱗翅目害蟲，保證農作物穩產高產，而且對生態環境安全，因此具有重要的現實意義和緊迫性。
文檔編號C12R1/07GK102618467SQ20121008225
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月26日 優先權日2012年3月26日
發明者劉朋明, 吳丹丹, 吳燕, 高梅影 申請人:中國科學院武漢病毒研究所