專利名稱：ssc- miR-374b-5p 在制備減少脂肪沉積和/或抗肥胖相關性疾病的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明生物醫藥領域，涉及SSC-miR-374b-5p在制備減少脂肪沉積和/或抗肥胖相關性疾病的藥物中的應用。
背景技術：
近年來，超重和肥胖是世界范圍內快速增長的一個健康問題。當體內脂肪積聚過多和(或)分布異常、體重增加就容易導致肥胖癥(obesity)，它是由遺傳環境等因素共同作用的慢性代謝性疾病。椐WHO估計，目前全球肥胖癥患者超過4億，而超重人群達到16 億，且預計這個數字到2015年將會翻倍。每年至少有260萬人因肥胖癥而死亡。Padwal等人(2003年)和Drew等人(2007年)的研究表明，肥胖會導致心血管疾病、高血壓、高血脂、 糖尿病等疾病的產生，與諸多慢性疾病的產生有密切關系肥胖發病原因復雜各異。目前人類對肥胖相關疾病的治療尚沒有有效療法，主要治療手段有飲食干預、運動干預、藥物干預及外科手術等。其中，藥物治療是常見的行之有效的治療手段之一。因此，鑒于近年來肥胖癥的嚴峻形勢，研究如何有效的減少脂肪沉積并開發新型減肥藥品或保健品藥物就顯得尤為重要。CCAAT 增強子結合蛋白家族(CCAAT enhancerbinding proteins, C/EBPs)是第一個被證明在脂肪分化轉錄調控中起重要作用的家族，它是一類能與DNA增強子區域結合的轉錄因子。C/EBPs屬于bZIP蛋白家族，C端有一個堿性轉錄激活區和一個亮氨酸拉鏈結構，可形成同源或異源二聚體，通過DNA結合區結合于靶基因的調控元件。根據其結構和功能分為C/EBP a、C/EBP 3、C/EBP S等，分別在不同時間、空間表達，調控脂肪細胞分化。 最初發現C/EBP6的成脂作用是基于觀察胰島素、cAMP和地塞米松在脂肪細胞分化過程中對它們的誘導表達作用。胚胎纖維母細胞缺乏C/EBP P*C/EBP S，脂肪形成輕度減少；但當二者都缺乏時，脂肪細胞的形成嚴重受阻。在C/EBPs家族中，C/EBP 3、 6表達最早出現，在前脂細胞中表達，并且于分化早期出現短暫的表達水平增高，但在分化后期，C/EBPP減至初期水平的50%，而C/EBPS幾乎檢測不到。C/EBPa首先在肝細胞內發現，在不同組織中都有表達，并非脂肪細胞專一性的。C/EBPa能與aP2、S⑶l、Glut4、 Ieptin等脂肪細胞特征基因啟動子處的位點相結合，激活上述基因的表達，而這些基因的 C/EBP a結合位點經突變后則無激活效應。沒有受到誘導刺激因子作用的3T3-L1前脂肪細胞轉染表達C/EBPa的質粒后可發生完全分化。C/EBPa在脂肪細胞分化較晚階段才有表達，調控脂肪細胞終末分化。由此可見C/EBPa在促進脂肪細胞分化過程中的重要性。miRNA是一類長度約為21-23個核苷酸(nucleotide, nt)的內源性單鏈小分子 RNA,它主要通過與祀基因mRNA的3’端非翻譯區(3，untranslational region, 3’ UTR)互補配對，引導RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)降解祀基因 mRNA或抑制其翻譯，在轉錄后水平調節基因表達，參與生長發育、疾病發生、衰老、代謝穩態等多種生命活動的調控。MicroRNA的初始轉錄產物是pri-miRNA。MicroRNA成熟的第一步是由Drosha RNaseIII核酸內切酶剪切pre-miRNA形成60_70nt長的、具有莖環結構的 microRNA前體pre-miRNA, Ran-GTP和受體Exportin-5負責將pre-miRNA從細胞核轉運出細胞質。然后，pre-miRNA在細胞質中經Dicer樣RNA內切酶剪切后形成一個18_25nt的成熟miRNA。最后,成熟miRNA被整合進入核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)形成RISC, 執行基因沉默功能。目前研究證實microRNA在調控脂肪代謝及抑制脂肪細胞分化過程中扮演重要的調控角色。MiRNA-122是第一個被發現參與脂代謝調控的miRNA，在維持肝臟正常的基因表達模式有關鍵作用。在小鼠和靈長類動物中，通過反義寡核苷酸干擾體內miR-122可顯著改變膽固醇和脂肪酸代謝。miR-370在脂代謝調控上的作用與miR-122相似。miR-370是通過間接地改變miR-122的表達從而影響脂代謝。轉染miR-370可上調人肝細胞系HEPG2 的miR-122表達水平；相反，抑制miR-370表達也可抑制miR-122表達。同時，轉染miR-370 還可上調肝細胞SREBP-lc和二脂酸甘油酸基轉移酶2 (diacylgycerol acy I transferase 2，DGAT2),直接調節肉毒喊掠櫚酸基轉移酶 la (carnitine palmitoyl transferase la, Cptla)的表達水平。從這些研究結果可以看出，miRNA是一類重要而復雜的調控元件，直接和間接地參與脂代謝調控。miR-378/378*位于過氧化物酶體增殖物激活受體Y共激活因子 I a (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator I-alpha, PGCla)基因的內含子內。當脂肪生成時，miR-378/378*過表達可以提高甘油三酯的積累。 脂肪細胞系ST2轉染miR-378/378*后，FAS、硬脂酰基輔酶A脫氫酶(stearoyl-coenzymeA desaturase, SCD-1)和脂肪酸結合蛋白-4(fatty acid binding protein 4, FABP4)等脂肪酸代謝基因表達顯著上調。miR-143、miR-27和miR-335與脂代謝和脂肪細胞分化關系密切。向前脂肪細胞中轉染miR-143反義寡核苷酸能下調細胞外信號調節激酶 5 (extracellular signal-regulated kinase, ERK5),抑制前脂肪細胞分化。miR-27 能抑制過氧化物酶體增殖物激活受體 Y (Peroxisome Proliferator-activated receptor y , PPAR Y )和轉錄因子 CCAAT/增強子結合蛋白 a (CCAAT/enhancer binding protein a , C/ EBP a)的表達。當脂肪細胞分化時，miR-27表達被下調。miR-335在肥胖小鼠的肝臟和脂肪組織表達上調。由此可見，miRNA可以參與脂代謝調控，在維持機體物質代謝和能量平衡方面發揮重要作用。同時，miRNA也參與免疫調控、肌肉老化和脂肪分化等廣泛的生命活動中。但是目前尚未有文獻報道microRNA-374b可以在脂肪代謝過程中具有調控作用。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供SSC-miR-374b-5p在制備減少脂肪沉積和/或抗肥胖相關性疾病的藥物中的應用。ssc-miR-374b-5p在制備減少脂肪沉積和/或抗肥胖相關性疾病的藥物中的應用。所述的ssc-miR-374b-5p序列為SEQ ID NO. I，其編碼序列為SEQ ID NO. 2，其前體序列為SEQ ID NO. 3，其前體序列的編碼DNA的正義鏈如SEQ ID NO. 5所示，反義鏈如SEQ IDN0. 6 所示。含ssc-miR-374b-5p前體序列編碼DNA的重組表達載體在制備減少脂肪沉積或抗肥胖相關性疾病的藥物中的應用。其中，所述的重組表達載體是將SEQ ID NO. 5所示的ssc-miR-374b-5p前體序列編碼DNA的正義鏈和SEQ ID NO. 6所示的ssc-miR-374b-5p前體序列編碼DNA的反義鏈退火后插入到pSilencer 3. O-HlsiRNA表達載體中所得。一種減少脂肪沉積和/或抗肥胖相關性疾病的藥物，它的活性成分為 ssc-miR-374b_5p、miR-374b_5p 的編碼序列、含 ssc-miR-374b_5p 前體序列的編碼 DNA 的重組表達載體或含有miR-374b-5p的編碼序列的表達盒中的至少一種。ssc-miR-374b-5p在抑制C/EBP-P在脂肪細胞分化過程中的表達中的應用。含ssc-miR-374b-5p前體序列的編碼DNA的重組表達載體在抑制C/EBP- ^在脂肪細胞分化過程中的表達中的應用。其中，所述的重組表達載體是將SEQ ID NO. 5所示的ssc-miR-374b-5p前體序列編碼DNA的正義鏈和SEQ ID NO. 6所示的ssc-miR-374b-5p前體序列編碼DNA的反義鏈退火后插入到pSilencer 3. O-Hl siRNA表達載體中所得。所述MicroRNA、所述編碼序列、所述重組表達載體和所述表達盒中的一種或幾種的組合均可應用于抑制C/EBP-0蛋白翻譯。所述MicroRNA針對的是C/EBP-0基因3-UTR 上的物種保守性結合位點(圖2)，在哺乳動物中具有廣泛的抑制作用。有益效果本發明首次發現SSc-miR-374b-5p可以有效的與脂肪細胞分化重要轉錄因子C/ EBP-^編碼基因的轉錄產物mRNA相互結合，抑制帶有C/EBP-0 3-UTR熒光素酶報告基因的活性。細胞水平實驗結果表明，該microRNA可以結合C/EBP-0 3-UTR上進而抑制C/EBP-3 蛋白翻譯，為其用于減少脂肪沉積及肥胖相關疾病的治療和預防提供了實驗依據。本發明提供的microRNA有望作為新型的抗肥胖相關藥物，具有重大的價值。


圖I為在細胞電穿孔轉染(Amaxa細胞核轉染儀(AAD-1001S，Lonza，USA))過程中所使用的Hela 229細胞系。A =Hela 229 轉染 miR_374b 后 24h 細胞圖片；B =Hela 229 轉染 miR_374b 后 48h 細胞圖片；C Hela 229 細胞轉染試劑盒(Amaxa Cell line Nucleofector Kit R)所帶含有 GFP的陽性質粒熒光圖。圖2為生物信息學軟件預測的ssc-miR-374b-5p在C/EBP- ^ 3-UTR上的結合位點及物種間的高度保守性。圖3為證明ssc-miR-374b-5p與C/EBP-P 3-UTR結合的雙熒光素酶檢測結果。其中，miR-SC表示含陰性對照序列的重組載體，miR-374b表示含 ssc-miR-374b-5p前體序列的退火雙鏈DNA的重組表達載體。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。實施例3中，每個處理均設置三個重復，結果取平均值。實施例I、ssc-miRNA-374b_5p及其編碼序列的發現一、ssc-miRNA-374b-5p 核苷酸序列的獲得ssc-miRNA-374b-5p 序列5' -AUAUAAUACAACCUG CUAAGUG-3' (SEQ ID NO. I)。ssc-miRNA-374b-5p 的編碼序列5 ' -ATATAATACAACCTG CTAAGTG-3 ' (SEQ IDN0. 2)。二、ssc-miRNA-374b-5p 前體序列的獲得ssc-miRNA-374b_5p 前體序列5' -UCGGAUGGAUAUAAUACAACCUGCUAAGUGUCCUAGCACUUAUCAGGUUGUAUUAUCAUUGUCCG UGUCUAUGGCUCUCG-3' (SEQ ID NO. 3)編碼ssc-miRNA-374b_5p前體序列的正義鏈5' -GATCCTCGGATGGATATAATACAACCTGCTAAGTGTCCTAGCACTTATCAGGTTGTATTATCATT GTCCGTGTCTATGGCTCTCGTTTTTTGGAAA-3' (SEQ ID NO. 5)編碼ssc-miRNA-374b_5p前體序列的反義鏈5' -AGCTTTTCCAAAAAACGAGAGCCATAGACACGGACAATGATAATACAACCTGATAAGTGCTAGGA CACTTAGCAGGTTGTATTATATCCATCCGAG-3' (SEQ ID NO. 6)隨機合成的一段與ssc-miRNA-374b-5p前體序列相同長度的核苷酸序列作為陰性對照序列 miR-SC :5' -GACUUACAGCCAGUUCCUAGUAUAGUGAA GCAGCAGAUGGUAUACUAGGAACUG GCUGUAAGC-3' (SEQ ID NO. 4)。編碼miR-SC的正義鏈5' -GATCCGACTTACAGCCAGTTCCTAGTATAGTGAAGCAGCAGATGGTATACTAGGAACTGGCTGTA AGCTTTTTTTGGAAA-3' (SEQ ID NO. 7) R5-AGCTTTTCCAAAAAAAGCTTACAGCCAGTTCCTAGTATACCATCTGCTGCTTCACTATACTAGGA ACTGGCTGTAAGTCG-3' (SEQ ID NO. 8)這個陰性對照已經通過Blast比對所有豬、人、大鼠及小鼠的基因組序列，與C/ EBP- ^ 3-UTR確認沒有結合位點。實施例2、ssc-miRNA-374b-5p表達載體的構建將編碼ssc-miRNA-374b-5p的前體序列的正義鏈和反義鏈經降落PCR(反應體系如下)方法退火，序列退火后可以形成與載體相連的粘性末端，將退火后的序列鏈接到 pSilencer 3. O-HlsiRNA表達載體上形成重組質粒,重組質粒具有氨節抗性。用重組質粒轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞(購于Promega公司)，涂布于含有氨芐的LB平板上，37°C 倒置12小時后挑取陽性克隆，菌液PCR送樣測序。測序結果表明攜帶了目的片段SEQ ID NO. 5的重組質粒，并將其命名為重組質粒A。降落PCR反應體系滅菌單蒸水退火緩沖液(5 X)
編碼miRNA前體的正義鏈(50 (imol/L) 編碼miRNA前體的反義鏈(50 (imol/L)
20 (iL 10 (iL 10 (iL 10
總體積降落PCR反應程序
步驟溫度
時間說明
95 0C
每8s下降O.l-C，降至25°C 4 °C
2min讓oligo充分變性
約90 min 退火
約I h暫時存放根據同樣的方法，將編碼陰性對照的DNA模板插入到pSilencer 3. O-HlsiRNA表達載體上，測序正確后命名為重組質粒B。表達海腎熒光素酶的pRL-TK表達載體(Promega公司)，命名為重組質粒C。 實施例3、C/EBP- ^ 3-UTR (重組質粒D)的構建一、根據 C/EBP-P 基因(GenBank accession NM005194)設計含有 Xbal 酶切位點的弓I物序列上游引物序列GCTCTAGACGGAACTTGITCAAGCAGC (SEQ IDN0. 9);下游引物序列GCTCTAGA CAGAAACAACCCCGTAGGA (SEQ ID NO. 10)，模板為豬的基因組 DNA，PCR 擴增 C/ EBP-^基因自5^ 1312位至1701位核苷酸序列并克隆到pGL3-Control載體(Ambion公司)中Iuciferase基因下游的Xbal酶切位點處,得到重組質粒D。二、ssc-miRNA-374b-5p序列對脂肪細胞分化重要轉錄因子C/EBP-0基因表達的抑制作用處理一用Hela 229細胞(購于中國細胞庫上海典藏細胞中心)鋪細胞瓶， 細胞融合達到95%時(約3-4X105個)用0. 25%胰酶消化，經800Xg離心5分鐘徹底去除培養基，100 u L電轉液重懸細胞，用電穿孔轉染法(Amaxa細胞核轉染儀，細胞轉染試劑盒(Amaxa Cell line Nucleofector Kit R)),將實施例 2 構建的重組質粒 A 100ng、 IOng重組質粒C和IOOng重組質粒D共轉染入Hela 229細胞，計數，平均分配到24孔板中(2X IO4個/孔)；轉染后24或48h收集細胞，通過檢測Iuciferase的表達量來確定 ssc-miRNA-374b-5p對C/EBP-0基因表達的抑制作用。處理二(陰性對照)用Hela 229細胞(購于中國細胞庫上海典藏細胞中心)鋪細胞瓶，細胞融合達到95%時(約3-4X105個)用0. 25%胰酶消化，經800Xg離心5分鐘徹底去除培養基，100 u L電轉液重懸細胞，用電穿孔轉染法(Amaxa細胞核轉染儀，細胞轉染試劑盒(Amaxa Cell line Nucleofector Kit R)),將實施例2構建的IOOng重組質粒 B、IOng重組質粒C和IOOng重組質粒D共轉染入Hela 229細胞，計數，平均分配到24孔板中(2 X IO4個/孔)；轉染后24或48h收集細胞，通過檢測Iuciferase的表達量來確定陰性對照質粒對C/EBP-0基因表達的抑制作用。本實驗結果見圖I和圖3.實驗結果顯示與對照組miR-SC相比，過表達ssc-miRNA-374b-5p序列可以極顯著抑制帶有其靶基因3' -UTR的熒光素酶報告基因的活性，且在轉染后24h和48h結果一致，說明ssc-miRNA-374b-5p序列與其靶基因3' -UTR之間有很強的靶向結合作用，從而抑制了脂肪細胞分化重要轉錄因子C/EBP-0在脂肪細胞分化過程中的表達，減少脂肪沉積。
權利要求
1.ssc-miR-374b-5p在制備減少脂肪沉積和/或抗肥胖相關性疾病的藥物中的應用。
2.含SSC-miR-374b-5p前體序列編碼DNA的重組表達載體在制備減少脂肪沉積或抗肥胖相關性疾病的藥物中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述的重組表達載體是將SEQID NO. 5所示的ssc-miR-374b-5p前體序列編碼DNA的正義鏈和SEQ ID NO. 6所示的ssc-miR-374b_5p 前體序列編碼DNA的反義鏈退火后插入到pSilencer 3. O-HlsiRNA表達載體中所得。
4.一種減少脂肪沉積和/或抗肥胖相關性疾病的藥物，其特征在于它的活性成分為 ssc-miR-374b_5p、miR-374b_5p 的編碼序列、含 ssc-miR-374b_5p 前體序列的編碼 DNA 的重組表達載體或含有miR-374b-5p的編碼序列的表達盒中的至少一種。
5.ssc-miR-374b-5p在抑制C/EBP-0在脂肪細胞分化過程中的表達中的應用。
6.含ssc-miR-374b-5p前體序列編碼DNA的重組表達載體在抑制C/EBP-0在脂肪細胞分化過程中的表達中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述的重組表達載體是將SEQID NO. 5所示的ssc-miR-374b-5p前體序列編碼DNA的正義鏈和SEQ ID NO. 6所示的ssc-miR-374b_5p 前體序列編碼DNA的反義鏈退火后插入到pSilencer 3. O-HlsiRNA表達載體中所得。
全文摘要
本發明生物醫藥領域，涉及ssc-miR-374b-5p在制備減少脂肪沉積和/或抗肥胖相關性疾病的藥物中的應用。本發明首次發現ssc-miR-374b-5p可以有效地與脂肪細胞分化重要轉錄因子C/EBP-β編碼基因的轉錄產物mRNA相互結合，抑制帶有C/EBP-β3-UTR熒光素酶報告基因的活性。細胞水平實驗結果表明，該microRNA可以結合C/EBP-β3-UTR上進而抑制C/EBP-β蛋白翻譯，為其用于減少脂肪沉積及肥胖相關疾病的治療和預防提供了實驗依據。本發明提供的microRNA有望作為新型的抗肥胖相關藥物，具有重大的價值。
文檔編號C12N15/63GK102600482SQ20121008295
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月26日 優先權日2012年3月26日
發明者孫欽偉, 楊曉靜, 潘士鋒, 趙茹茜, 馬文強 申請人:南京農業大學