專利名稱：小麥抗赤霉病擴展基因Fhb1的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于作物育種學(xué)領(lǐng)域，涉及小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，提供人類大約20%的能量。在小麥生產(chǎn)中許多生物與非生物逆境直接影響小麥的產(chǎn)量與品質(zhì)。赤霉病就是其中最重要的ー種生物逆境，嚴重影響小麥的品質(zhì)和產(chǎn)量?？共∑贩N的選育和應(yīng)用是控制赤霉病最經(jīng)濟有效的方法，抗病基因的發(fā)掘是抗病育種的前提和基礎(chǔ)，而開發(fā)與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記更是應(yīng) 用抗病基因的關(guān)鍵。小麥對赤霉病的抗性主要有五種類型(Mesterhazy 1995),其中抗擴展(Type I)和抗擴展(Type II) (Schroeder and Christensen 1963)是最主要的兩種類型。Type I 抗性主要反映小麥抵抗病原菌的初擴展，是小麥抵御赤霉菌危害的第一道屏障，在抗性反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。許多研究表明小麥對赤霉病的抗性是典型的數(shù)量性狀，受多基因控制。迄今為止已經(jīng)定位了大約200多個抗赤霉病QTL，其中位于3B染色體上的抗赤霉病擴展QTL存在于多個抗性種質(zhì)中，表達穩(wěn)定且效應(yīng)最強，且具有很好的抗病育種潛カ(Liu and Anderson2003)。Liu et al. (2006)將該 QTL 精細定位到相距 I. 2cM 的 XSTS3B-189-XSTS3B-206 區(qū)間，并將其命名為Fhbl。Lin et al (2006)利用望水白X南大2419重組自交系群體在望水白的3B染色體上也檢測到該QTL，定位于Xbarc 147-Xgwm493區(qū)間，解釋30%左右的表型變異。由于小麥赤霉病抗性具有典型的數(shù)量性狀特征，易受環(huán)境影響，早期世代很難對其進行選擇。此外，許多抗赤霉病種質(zhì)的農(nóng)藝性狀較差，且地區(qū)適應(yīng)性較強，利用傳統(tǒng)育種方法培育抗性品種費時費カ可能也得不到預(yù)期的結(jié)果。分子標(biāo)記輔助選擇育種與傳統(tǒng)育種相比，可以在早期世代確定目標(biāo)基因型，且選擇不受基因表達及環(huán)境條件的影響，能夠提高選擇的準(zhǔn)確性，從而加快育種進程(Collard and Mackill 2008)。因此與其更緊密連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)有利于提高對Fhbl的應(yīng)用效率。此外，F(xiàn)hbl目前所在區(qū)間對應(yīng)的物理區(qū)間在望水白中還不知有多大，有必要開發(fā)更緊密連鎖的分子標(biāo)記加快該基因的克隆研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供與小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl更加緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明的另ー個目的是提供該小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標(biāo)記的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標(biāo)記，用標(biāo)記引物MAG6067-F :SEQ ID NO. I,MAG6067-R SEQ ID NO. 2擴增小麥品種DNA，獲得的擴增片段為280bp，即為小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl連鎖的分子標(biāo)記MAG6067，該標(biāo)記為顯性分子標(biāo)記，與Fhbl緊密連鎖，利用Mapmaker Macintosh V 3. 0測得該標(biāo)記與Fhbl基因的遺傳距離為0. 05cM ；或用標(biāo)記引物MAG6660-F :SEQ ID NO. 3, MAG6660-R SEQ ID NO. 4 擴增小麥品種DNA,獲得的擴增片段為510bp，即為小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl連鎖的分子標(biāo)記MAG6660，該標(biāo)記為共顯性分子標(biāo)記，與Fhbl緊密連鎖,利用Mapmaker Macintosh V 3.0測得該標(biāo)記與Fhbl基因共分離。所述的分子標(biāo)記在小麥種質(zhì)資源中抗赤霉病擴展基因Fhbl的鑒定中的應(yīng)用。小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標(biāo)記方法，用上述的任意ー對分子標(biāo)記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物，如果用分子標(biāo)記MAG6067的引物MAG6067-F和MAG6067-R能夠擴增出280bp的擴增片段，或者用分子標(biāo)記MAG6660的引物MAG6660-F和MAG6660-R能夠擴增出510bp的擴增片段，則標(biāo)志著待檢小麥存在抗赤霉病擴展基因Fhbl。
本發(fā)明所述的分子標(biāo)記在篩選抗赤霉病小麥中的應(yīng)用。利用上述的分子標(biāo)記篩選抗赤霉病小麥的方法為用上述的任意ー對分子標(biāo)記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物，如果用分子標(biāo)記MAG6067的引物MAG6067-F和MAG6067-R能夠擴增出280bp的擴增片段，或者用分子標(biāo)記MAG6660的引物MAG6660-F和MAG6660-R能夠擴增出510bp的擴增片段，則標(biāo)志著待檢小麥為存在抗赤霉病擴展基因Fhbl的抗赤霉病小麥。所述的分子標(biāo)記的引物在克隆抗赤霉病擴展基因Fhbl中的應(yīng)用。上述小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標(biāo)記是通過以下方法獲得的(一)望水白Fhbl近等基因系NMAS016與其輪回親本綿陽99-323F2:3群體的創(chuàng)建與Fhbl區(qū)段重組體的篩選(1)NMAS016(早)與小麥品種綿陽99-323 (3)進行雜交得到雜種F15F1自交產(chǎn)生F2群體；(2)利用Fhbl的邊界標(biāo)記篩選F2群體中在該區(qū)段發(fā)生重組的雜合單株，利用相同標(biāo)記在其F3代篩選在該區(qū)段發(fā)生重組的純合單株。(ニ)重組體抗病表型的鑒定(3)重組體開花時采用單花滴注法接種。接種15天后分單株調(diào)查病小穗數(shù)和病軸長評價其抗擴展性；(三)分子標(biāo)記分析(4)用SDS法提取抗病親本NMAS016、感病親本綿陽99_323及F2群體各單株的DNA ;用中國春3B序列開發(fā)的69個SSR標(biāo)記對NMASO16，綿陽99-323，中國春以及中國春缺失系3BS8-0. 78-0. 87 (Endo and Gill 1996)進行多態(tài)性分析和特異性分析。(5)選擇在親本間擴增出多態(tài)、且能缺失定位到3BS8-0. 78-0. 87bin的分子標(biāo)記在F2代群體單株中擴增獲取群體各單株的基因型資料，并且利用這些標(biāo)記檢測雜合重組體后代F3家系各單株的基因型；PCR 反應(yīng)體系為 12. 5 ii I，其中 10 X buffer I. 25 u I, 25mM MgCl2O. 75 u I,
2.5mMdNTPs I yl，左右引物各 0. 2 y M，Taq 酶(5u/yl) 0. I yl，模板 DNA 10ng，加水至12. 5u I ；PCR擴增程序為94°C預(yù)變性3min后，94°C變性30sec，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)35次，最后72°C延伸8min ;在PE9600擴增儀上進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物在8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，然后在紫外透射儀上照相，記錄結(jié)果。(四)分子標(biāo)記獲得(6)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，結(jié)合F2代群體各單株基因型資料與雜合重組體F3家系的田間抗病表型，利用軟件Mapmaker Macintosh V3. 0構(gòu)建望水白Fhbl的遺傳連鎖圖，獲得了與Fhbl最為緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG6067和MAG6660。有益效果 本發(fā)明在國際上首次獲得了與Fhbl緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG6067和MAG6660。可以加速抗病基因Fhbl在小麥抗病育種中的應(yīng)用，并且還可以用于Fhbl基因的克隆。I、獲得了與Fhbl緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG6067和MAG6660。在已知的分子標(biāo)記中與Fhbl連鎖最為緊密的是MAG6660，與Fhbl基因共分離，能夠幫助該基因向推廣品種中轉(zhuǎn)移以及與其它抗病基因的聚合。2、鑒定方便。這兩個分子標(biāo)記都為共顯性標(biāo)記，具有檢測方便、擴增穩(wěn)定、簡便等優(yōu)點。用標(biāo)記MAG6660檢測Fhbl基因，可以確定Fhbl的存在與否以及存在狀態(tài)，并預(yù)測小麥的赤霉病抗性，進而快速篩選攜有Fhbl的植株并用于抗病品種的選育。同時利用分子標(biāo)記進行實驗室檢測可以避免環(huán)境對品種的影響。3、提高抗病品種的選擇鑒定效率，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)的抗赤霉病育種過程中，需要將攜帶有抗病基因的親本與栽培品種進行一系列雜交，對后代群體單株進行抗病性鑒定，并且需要多年多點的表型鑒定；并且抗病表型鑒定易受環(huán)境的影響，表型鑒定結(jié)果有一定的誤差。因此抗病品種的選育不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測與抗赤霉病擴展基因Fhbl緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以將表型鑒定的工作大大減少，并且在苗期就可鑒定出攜有抗病基因Fhbl的單株，從而淘汰非目標(biāo)植株。因此，通過檢測與抗赤霉病擴展基因Fhbl共分離的分子標(biāo)記MAG6660進行選擇，不僅節(jié)約育種成本同時大大提高抗病品種的選擇效率。4、可用于克隆抗赤霉病擴展基因Fhbl研究。圖位克隆抗赤霉病擴展基因Fhbl的前提在于獲得與Fhbl緊密連鎖的分子標(biāo)記。MAG6067和MAG6660在所有已知分子標(biāo)記中與Fhbl連鎖最為緊密。


圖1MAG6067和MAG6660與小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的遺傳連鎖圖，右邊為遺傳連鎖圖的標(biāo)記，左側(cè)數(shù)據(jù)為標(biāo)記間的遺傳距離。圖2MAG6067 擴增帶型。I 為 NMAS016，2 為綿陽 99-323，3、4、5、6、12、18、19，20、21為抗病基因型單株，其余為感病或雜合基因型單株。箭頭所指為特異擴增條帯。圖3MAG6660擴增帶型。M為PUM，左側(cè)是分子量標(biāo)記條帶大小(bp)。I為NMAS016，2為綿陽99-323，3、8、15、16、17為抗病基因型單株，2、5、9、13、19、20為感病基因型單株，4、6、7、10、11、12、14、18、21為雜合基因型單株。箭頭所指為特異擴增條帯。
具體實施例方式實施例I
上述小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標(biāo)記是通過以下方法獲得的(一)望水白Fhbl近等基因系NMAS016與其輪回親本綿陽99-323F2:3群體的創(chuàng)建與Fhbl區(qū)段重組體的篩選(1)NMAS016(早)與小麥品種綿陽99-323 (3)進行雜交得到雜種F15F1自交產(chǎn)生包含有2875個單株的F2群體；(2)利用 Fhbl 的邊界標(biāo)記 Xbarc 147 和 Xgwm493 (http://wheat, pw. usda. gov/GG2/)在F2群體中篩到71個在該區(qū)段發(fā)生重組的雜合單株，利用相同標(biāo)記在其F3代篩選得到99個在該區(qū)段發(fā)生重組的純合單株。(ニ)重組體抗病表型的鑒定 重組體開花時采用單花滴注法接種。接種15天后分單株調(diào)查病小穗數(shù)和病軸長度評價其抗擴展性。鑒定結(jié)果表明這些重組體抗性分離明顯，攜帯有Fhbl基因的株系與感病親本相比，抗性有顯著提高(表I)。(三)多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選及重組體基因型分析(I)首先利用中國春3B序列開發(fā)的69個SSR標(biāo)記Fhbl近等基因系NMAS016和綿陽99-323進行多態(tài)性篩選，最終得到2個在親本間有多態(tài)的SSR標(biāo)記MAG6067和MAG6660。(3)利用在親本間有多態(tài)的分子標(biāo)記BARC147、GWM493、MAG6067和MAG6660分析所有純合重組體，這些重組體僅可分成6種重組類型(表I)。(四)分子標(biāo)記的獲得根據(jù)連鎖交換規(guī)律，結(jié)合F2代群體各單株基因型資料與雜合重組體F3家系的田間抗病表型(表I)，利用軟件Mapmaker Macintosh V3. 0構(gòu)建了望水白Fhbl的遺傳連鎖圖，獲得了與Fhbl緊密連鎖的分子標(biāo)記MAG6067和MAG6660，它們分別距Fhbl基因0. 05cM、OcM。MAG6067和MAG6660分子標(biāo)記引物擴增帶型見圖2和圖3。表1NMAS016-綿陽99_323F2:3群體中純合重組體的基因型和表型
權(quán)利要求
1.小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標(biāo)記，其特征在于 用標(biāo)記引物 MAG6067-F :SEQ ID NO. I, MAG6067-R SEQ ID NO. 2 擴增小麥品種 DNA，獲得的擴增片段為280bp，即為小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl連鎖的分子標(biāo)記MAG6067，該標(biāo)記為顯性分子標(biāo)記，與Fhbl緊密連鎖,利用Mapmaker Macintosh V 3. 0測得該標(biāo)記與Fhbl基因的遺傳距離為0. 05cM； 或用標(biāo)記引物 MAG6660-F :SEQ ID NO. 3, MAG6660-R SEQ ID NO. 4 擴增小麥品種 DNA，獲得的擴增片段為510bp，即為小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl連鎖的分子標(biāo)記MAG6660，該標(biāo)記為共顯性分子標(biāo)記，與Fhbl緊密連鎖,利用Mapmaker Macintosh V 3. 0測得該標(biāo)記與Fhbl基因共分離。
2.權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記在小麥種質(zhì)資源中抗赤霉病擴展基因Fhbl的鑒定中的應(yīng)用。
3.小麥抗赤霉病擴展基因Fhbl的分子標(biāo)記方法，其特征在于用權(quán)利要求I所述的任意ー對分子標(biāo)記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物，如果用分子標(biāo)記MAG6067的引物MAG6067-F和MAG6067-R能夠擴增出280bp的擴增片段，或者用分子標(biāo)記MAG6660的引物MAG6660-F和MAG6660-R能夠擴增出510bp的擴增片段，則標(biāo)志著待檢小麥存在抗赤霉病擴展基因FhbI。
4.權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記在篩選抗赤霉病小麥中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于利用權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記在篩選抗赤霉病小麥的方法為用權(quán)利要求I所述的任意ー對分子標(biāo)記引物PCR擴增待檢小麥基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物，如果用分子標(biāo)記MAG6067的引物MAG6067-F和MAG6067-R擴增出280bp的擴增片段，或者用分子標(biāo)記MAG6660的引物MAG6660-F和MAG6660-R能夠擴增出510bp的擴增片段，則標(biāo)志著待檢小麥為存在抗赤霉病擴展基因Fhbl的抗赤霉病小麥。
6.權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記的引物在克隆抗赤霉病擴展基因Fhbl中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于作物育種學(xué)領(lǐng)域，涉及小麥抗赤霉病擴展基因Fhb1的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記選自MAG6067或MAG6660中的任意一種，與Fhb1基因的遺傳距離分別為0.05cM和0cM。本發(fā)明在國際上首次獲得了與Fhb1最為緊密連鎖的分子標(biāo)記。用標(biāo)記MAG6660檢測Fhb1基因，可以確定Fhb1的存在與否以及存在狀態(tài)，并預(yù)測小麥的赤霉病抗性，進而快速篩選攜有Fhb1的植株并用于抗病品種的選育。同時利用分子標(biāo)記進行實驗室檢測可以避免環(huán)境對表型的影響。利用本發(fā)明與Fhb1緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以大大節(jié)省抗病材料的篩選時間和勞力，并加強預(yù)測的準(zhǔn)確性，還可以加快Fhb1基因的克隆。
文檔編號C12N15/10GK102653759SQ20121008519
公開日2012年9月5日 申請日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者李國強, 薛樹林, 郜忠霞, 馬正強 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)