專利名稱：土壤磷素生物活化真菌接種劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種土壤磷素生物活化真菌接種劑的制備方法，具體來說涉及溶磷真菌接種劑的制備方法。
背景技術：
磷素是一切生命活動的物質基礎，它不僅是生物遺傳信息載體DNA的組成元素， 更重要的它是生物能量載體ATP的組成元素。磷素供應不足，一切生命都將失去其原有的光輝。在農業生產領域，有效磷供應不足仍是全球作物產量的主要限制因子之一。而從我國情況來看，全國有74%耕地土壤由于土壤磷素固定而缺磷。據報道自20世紀50年代我國開始施用化學磷肥以來，累積儲存在土壤中的難溶性磷已高達6000萬噸，因此，破解開發利用土壤難溶性磷技術難題，對提高土壤磷素的利用率，科學地減施磷肥，保障國家糧食生產安全、減少農產品生產過程中對周邊生態環境的污染、從源頭上預防和防治土壤重金屬污染和農業面源污染都具有重要意義。由于土壤難溶磷的轉化是在一定的條件下，以生物活動為中心的生物驅動過程， 因此，開發利用土壤中難溶磷不外乎兩條途徑一、發揮植物自身的溶磷潛力，通過基因工程育種技術，選育磷高效利用植物品種來開發利用土壤難溶性磷素資源。這方面研究近年來已成為農作物育種領域的研究熱點之一。到目前為止，已經獲得植物的溶磷基因，可以說該技術源于理論、技術層面的難題已經破解，其應用、推廣的阻力主要源于公眾對轉基因作物產品安全性的置疑。二、通過解磷菌將土壤中難溶性磷活化出來。這方面的研究幾十年來從未間斷過， 并且取得了豐碩的成果。自前蘇聯學者孟金娜(1935)從土壤中分離一株能分解核酸和卵憐脂的解憐巨大芽抱桿菌(Bucillus. megaterium var. phosphaticum)后，于1947年大量生產使用，接種土壤中來提高土壤有效磷含量。我國對解磷菌的研究始于1950年，前東北農科所于1950年從東北黑土和灰化土中分離出能分解有機磷的巨大芽孢桿菌。同年，中國科學院(前林業土壤研究所)從東北黑土中分離出一種假單胞菌(Pseudomonas spp.)也具有分解核酸和卵磷脂的能力。東北農科所將巨大芽孢桿菌制成菌劑在黑鈣土和非黑鈣土上施用，不同的作物增產幅度不同，平均增產黑鈣土為13.5%，非黑鈣土為11.7%。20世紀80年代以后，國內許多單位相繼開發出了有多種芽孢桿菌組成的復合解磷菌制劑，但這些菌劑在生產上使用的效果并不理想，主要表現在田間應用效果不穩定。導致其田間應用效果不穩定的主要原因除了這些解磷菌的土壤適應性差外，更主要的是這些解磷制劑使用的菌種都是解磷細菌，而該類菌種的致命缺點在于在深層液體發酵工廠化生產過程中，由于營養物質的種類和比例、溫度、PH值、供氧量、發酵時間等發酵條件的微小變化，都會導致該類菌種不可逆地丟失解磷基因，喪失解磷能力，從而導致其田間應用效果不穩定。本發明“土壤磷素生物活化真菌接種劑”使用的菌種是解磷真菌平陽正青霉的無性系菌株 JB201015 (Eupenicillium euglaucum anamorph JB201015),克服了工廠化生產過程中，菌種會不可逆地喪失解磷基因的缺點；在田間應用上，通過拌種的方法，使菌種定植在作物的根際，以作物根際分泌物為碳源、氮源生長、繁殖，通過溶磷真菌的代謝活動，將作物根際土壤中難溶的磷酸鹽(P0/_)，轉化成可溶性磷酸鹽(H2PO4' HPO42O供作物吸收利用。克服了以往解磷菌土壤適應性差的缺點。因此在此提出一種方法，能夠有效破解開發利用累積儲存在中國土壤中的6000 萬噸難溶性磷的技術難題，為提高中國土壤磷肥的利用率，科學地減施磷肥，保障國家糧食生產安全、減少農產品生產過程中對周邊生態環境的污染、從源頭上預防和防治土壤重金屬污染和農業面源污染提供技術和物質支撐。

發明內容
要解決的問題本發明的目的是提供一種制備土壤磷素生物活化真菌接種劑的方法；本發明的另一目的是提供一種土壤適應性強、溶磷增產效果明顯的土壤真菌接種劑；本發明的另一目的是提供一種生產過程中不會喪失解磷基因的土壤磷素生物活化真菌接種劑；本發明的另一個目的是提供一種生產成本低、不需深層發酵、生產周期短的土壤磷素生物活化真菌接種劑。技術方案一種土壤磷素生物活化真菌接種劑的制備方法，具體包括以下步驟A.取保藏號為CGMCC 3. 4396的平陽正青霉Eupenicillium euglaucum的子囊孢子一接種環，放入無菌水中，利用漩渦混合器震蕩I分鐘，使子囊孢子均勻地分散在無菌水中，制備成子囊孢子懸液；B.取O. Iml上述的子囊孢子懸液，均勻涂布在水瓊脂平板上；C.將水瓊脂平板置于顯微鏡下挑取單孢子，以多個點的方式接種于第一選擇性培養基平板上，在25-27°C中培養10-15天；D.挑取在選擇性培養基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接種到第二選擇性培養基平板上，同樣在在25-27°C中培養10-15天，然后篩選獲得一株具有最大溶磷圈的菌落的分生孢子；E.將選出的分生孢子在25°C條件下培養1-2天；再用15mL無菌水洗脫孢子，制備成孢子懸濁液，吸取IOmL孢子懸濁液接種到IOOmLPD培養液的三角瓶中，在26°C條件下，震蕩培養3-5天，獲得液體菌種； F.將液體菌與一級種子ro培養液種按15-20 % (體積)接種到一級種子ro培養液中，在27°C條件下，培養1-2天；G.再將培養后的一級種子ro培養液與二級種子ro培養液按15-20% (體積)接種到二級種子ro培養液中，在26-27°C條件下發酵3天，獲得二級液體菌種；H.將二級液體菌種與滅菌草碳I : 4(重量)吸附，在27°C的條件下，空氣相對濕度大于85%條件下，保濕培養2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。所述第一選擇性培養基是由10g/L的葡萄糖、O. 5g/L的硫酸銨、O. lg/L的硫酸鎂、O. 2g/L的氯化鉀、O. 5g/L的酵母粉、O. 002g/L的硫酸亞鐵、O. 2g/L的氯化鈉、5g/L的磷酸氫鈣、20g/L瓊脂配成，再利用O. lmol/L的鹽酸溶液和O. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值為 7. O。所述第二選擇性培養基是由10g/L的麥芽糖、O. 5g/L的硫酸銨、O. lg/L的硫酸鎂、 O. 2g/L的氯化鉀、O. 5g/L的酵母粉、O. 002g/L的硫酸亞鐵、O. 2g/L的氯化鈉、5g/L的磷酸氫鈣、20g/L瓊脂配成，再利用O. lmol/L的鹽酸溶液和O. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值為 7. O。在步驟A中所述震蕩條件為120轉/分鐘。所獲得的液體菌種的菌絲體 3X107cfu/ml以上；二級液體菌種的菌絲體3X108cfu/ml以上；滅菌草碳的分生孢子量達到3X109cfu/g。上述步驟D中的步驟可以重復多次，進行多級篩選。一種根據上述權利要求中的制備方法所制成的土壤磷素生物活化真菌接種劑，其特征在于所述接種劑采用以下步驟制備A.取保藏號為CGMCC 3. 4396的平陽正青霉Eupenicillium euglaucum的子囊孢子一接種環，放入無菌水中，利用漩渦混合器震蕩I分鐘，使子囊孢子均勻地分散在無菌水中，制備成子囊孢子懸液；B.取0. Iml上述的子囊孢子懸液，均勻涂布在水瓊脂平板上；C.將水瓊脂平板置于顯微鏡下挑取單孢子，以多個點的方式接種于第一選擇性培養基平板上，在25-27°C中培養10-15天；D.挑取在選擇性培養基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接種到第二選擇性培養基平板上，同樣在在25-27°C中培養10-15天，然后篩選獲得一株具有最大溶磷圈的菌落的分生孢子；E.將選出的分生孢子在25°C條件下培養1-2天；再用15mL無菌水洗脫孢子，制備成孢子懸濁液，吸取IOmL孢子懸濁液接種到IOOmLPD培養液的三角瓶中，在26°C條件下，震蕩培養3-5天，獲得液體菌種；F.將液體菌與一級種子H)培養液種按15-20 % (體積)接種到一級種子H)培養液中，在27°C條件下，培養1-2天；G.再將培養后的一級種子ro培養液與二級種子ro培養液按15-20% (體積)接種到二級種子ro培養液中，在26-27°C條件下發酵3天，獲得二級液體菌種；H.將二級液體菌種與滅菌草碳I : 4(重量)吸附，在27°C的條件下，空氣相對濕度大于85%條件下，保濕培養2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。所獲得的液體菌種的菌絲體3X107cfu/ml以上；二級液體菌種的菌絲體 3X108cfu/ml以上；滅菌草碳的分生孢子量達到3X109cfu/g。上述步驟D中的步驟可以重復多次，進行多級篩選。有益效果具體地說，本發明的優點如下所述真菌接種劑的土壤適應性強、溶磷增產效果明顯；在工廠生產過程中不會喪失解磷基因；該真菌接種劑的生產成本低、不需深層發酵、生產周期短。在作用于植物的根際后，能夠活化作物根際土壤中難溶的磷酸鹽，供作物吸收利用。

圖I為接種劑發酵工藝的流程圖。
具體實施例方式本發明的土壤磷素生物活化真菌接種劑及其制備方法，使用的菌種是解磷真菌平陽正青霉的無性系菌株 JB201015 (Eupenicillium euglaucum anamorph JB201015),該菌株克服了工廠化生產過程中，菌種會不可逆地喪失解磷基因的缺點；在田間應用上，通過拌種的方法，使菌種定植在作物的根際，以作物根際分泌物為碳源、氮源生長、繁殖，通過溶磷真菌的代謝活動，將作物根際土壤中難溶的磷酸鹽(PO43O，轉化成可溶性磷酸鹽(H2PO4' HPO42-)供作物吸收利用。克服了以往解磷菌土壤適應性差的缺點。技術原理土壤中的磷主要以有機磷和無機磷兩種形態存在。在石灰性土壤中，磷主要是以磷酸鈣鹽形式存在，占無機磷酸鹽的60-70%。這些磷酸鈣鹽主要以Ca(H2P04)2、 CaHPO4 · 2H20、CaHPO4, Ca3 (PO4)2, Ca4H (PO4) 3 · 2. 5H20、Ca5 (PO4) 3 · OH 形式存在。依據其化學性質，土壤鈣磷的水溶性依次為=Ca(H2PO4)2 > CaHPO4 · 2H20 > CaHPO4 > Ca3(PO4)2 > Ca4H(PO4)3 · 2. 5H20 > Ca5(PO4)3 · 0H。石灰性土壤中的鈣磷存在形式取決于土壤的 pH值和CaCO3的含量。在堿性條件下，施入土壤中的磷肥主要轉化成CaHPO4 · 2H20和 CaHPO4,很少一部分轉化成Ca3(PO4)2和Ca4H(PO4)3 · 2. 5H20，且在連年施用磷肥的條件下， Ca4H(PO4)3 · 2. 5H20 不會形成 Ca5(PO4)3 · 0H，而以 Ca4H(PO4)3 · 2. 5H20 的形態存在數年。在 pH < 7. 3條件下，CaHPO4 · 2H20和CaHPO4可以轉化成Ca (H2PO4) 2被植物利用，降低石灰性土壤的PH值有助于鈣磷的活化。該發明以購于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)的平陽正青霉(編號 3.4396) (Eupenicillium euglaucum)為母本,篩選出一株利用作物根際分泌物生長和產酸能力強的無性系菌株 JB201015 (Eupenicillium euglaucum anamorph JB201015),該菌株接種到作物根際土壤中后，可顯著降根際土壤的PH值，促進作物根際土壤中難溶的磷酸鹽 CaHPO4 · 2H20和CaHPO4向Ca (H2PO4) 2轉化，供作物吸收利用。技術路線通過工廠化生產，擴繁平陽正青霉無性系菌株JB201015 (Eupenicillium euglaucum anamorph JB201015)的菌絲體并獲得其分生孢子，將分生孢子吸附于滅菌載體，制備成孢子粉劑或草碳型粉劑成品(商品)；通過拌種或與營養土混合，將孢子接種在作物的根際，待溶磷孢子萌發后(土溫4°C以上)，通過溶磷真菌的代謝活動，活化作物根際土壤中難溶的磷酸鹽，供作物吸收利用。生產制備流程取保藏號為CGMCC 3. 4396的平陽正青霉Eupenicillium euglaucum的子囊孢子一接種環，放入無菌水中，利用漩渦混合器震蕩(120轉/分鐘)I分鐘，使子囊孢子均勻地分散在無菌水中，制備成子囊孢子懸液；取O. Iml上述的子囊孢子懸液，均勻涂布在水瓊脂平板上；將水瓊脂平板置于顯微鏡下挑取單孢子，以多個點的方式接種于第一選擇性培養基平板上，在25-27°C中培養10-15天；挑取在選擇性培養基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接種到第二選擇性培養基平板上，同樣在在25-27°C中培養10-15天，然后篩選獲得一株具有最大溶磷圈的菌落的分生孢子。所述第一選擇性培養基是由10g/L的葡萄糖、O. 5g/L的硫酸銨、O. lg/L的硫酸鎂、 O. 2g/L的氯化鉀、O. 5g/L的酵母粉、O. 002g/L的硫酸亞鐵、O. 2g/L的氯化鈉、5g/L的磷酸氫鈣、20g/L瓊脂配成，再利用O. lmol/L的鹽酸溶液和O. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值為
7.O。所述第二選擇性培養基是由10g/L的麥芽糖、O. 5g/L的硫酸銨、O. lg/L的硫酸鎂、
O.2g/L的氯化鉀、O. 5g/L的酵母粉、O. 002g/L的硫酸亞鐵、O. 2g/L的氯化鈉、5g/L的磷酸氫鈣、20g/L瓊脂配成，再利用O. lmol/L的鹽酸溶液和O. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值為
7.O。接著，將選出的分生孢子在22-27°C (優選為25°C )條件下培養1_2天；再用15mL 無菌水洗脫孢子，制備成孢子懸濁液，吸取IOmL上述孢子懸濁液接種到IOOmL PD培養液的三角瓶中，在22-27°C (優選為26°C)條件下，震蕩培養3_5天，獲得液體菌種；將液體菌與一級種子H)培養液種按15-20% (體積)接種到一級種子H)培養液中，在22-30°C (優選為27°C)條件下，培養1-2天。再將培養后的一級種子ro培養液與二級種子ro培養液按15-20% (體積)接種到二級種子H)培養液中，在26-27°C條件下發酵3天，獲得二級液體菌種；將二級液體菌種與滅菌草碳I : 4(重量)吸附，在22-30°C (優選為27°C)的條件下，空氣相對濕度大于 85%條件下，保濕培養2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。其中上述所獲得的液體菌種的菌絲體3X 107cfu/ml以上；二級液體菌種的菌絲體 3X108cfu/ml以上；滅菌草碳的分生孢子量達到3X109cfu/g以上為優選狀態。菌種的篩選過程可以重復多次，進行多級篩選，以便獲得優秀的菌落。具體實施效果黑土在施肥水平氮(N) 200kg/ha,磷(P205) 80kg/ha,鉀(K20) 60kg/ha 條件下，孢子粉劑拌種(300g/ha)，玉米增產9-19. 8 % ;減施磷肥1/3，玉米產量10677kg/ha (Iha為10畝)。白漿土在施肥水平氮(N) 250kg/ha，磷(P205) 125kg/ha，鉀(K20) 90kg/ha 條件下，孢子粉劑拌種(300g/ha),玉米增產9. 1-10. 2% ;減施磷肥1/3,玉米產量12081kg/ha。工藝控制(I)溫度——發酵的最適溫度一般應控制在26°C左右。(2)pH值——發酵的最適pH值在6. 5左右，有時也可以略高或略低一些，但應避免 pH值超過7.0。(3)溶氧一溶氧濃度是影響發酵過程的一個重要因素。當溶氧濃度降到30%飽和度以下時，產率急劇下降，低于10%飽和度時，則造成不可逆的損害。一般要求發酵中溶解氧量不低于飽和溶解氧的30%，通風比一般為I : 0.8L/min，攪拌轉速在發酵各階段應根據需要而調整。(4)菌絲生長速度——比生長速率不低于Ο.ΟΙδΙΓ1。上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發明的一個可行性實施例的具體說明，但是該實施例并非用以限制本發明的專利范圍，凡未脫離本發明技藝精神所作的等效實施例或變更，例如，等變化的等效性實施例，均應包含于本案的專利范圍之內。
權利要求
1.一種土壤磷素生物活化真菌接種劑的制備方法，具體包括以下步驟A.取保藏號為CGMCC3. 4396的平陽正青霉(Eupenicillium euglaucum)的子囊孢子一接種環，放入無菌水中，利用漩渦混合器震蕩I分鐘，使子囊孢子均勻地分散在無菌水中，制備成子囊孢子懸液；B.取O.Iml上述的子囊孢子懸液，均勻涂布在水瓊脂平板上；C.將水瓊脂平板置于顯微鏡下挑取單孢子，以多個點的方式接種于第一選擇性培養基平板上，在25-27°C中培養10-15天；D.挑取在選擇性培養基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接種到第二選擇性培養基平板上，同樣在在25-27°C中培養10-15天，然后篩選出一株具有最大溶磷圈和最大菌落直徑的菌落分生孢子；E.將選出的分生孢子在25°C條件下培養1-2天；再用15mL無菌水洗脫孢子，制備成孢子懸濁液，吸取IOmL孢子懸濁液接種到IOOmLPD培養液的三角瓶中，在26°C條件下，震蕩培養3-5天，獲得液體菌種；F.將液體菌與一級種子H)培養液種按15-20%(體積)接種到一級種子H)培養液中， 在27°C條件下，培養1-2天；G.再將培養后的一級種子ro培養液與二級種子ro培養液按15-20%(體積)接種到二級種子ro培養液中，在26-27°C條件下發酵3天，獲得二級液體菌種；H.將二級液體菌種與滅菌草碳I: 4 (重量)吸附，在27°C的條件下，空氣相對濕度大于85%條件下，保濕培養2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。
2.根據權利要求I中的土壤磷素生物活化真菌接種劑的制備方法，其特征在于所述第一選擇性培養基是由10g/L的葡萄糖、O. 5g/L的硫酸銨、O. lg/L的硫酸鎂、O. 2g/L的氯化鉀、O. 5g/L的酵母粉、O. 002g/L的硫酸亞鐵、O. 2g/L的氯化鈉、5g/L的磷酸氫鈣、20g/L瓊脂配成，再利用O. lmol/L的鹽酸溶液和O. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值為7. O。
3.根據權利要求2中的土壤磷素生物活化真菌接種劑的制備方法，其特征在于所述第二選擇性培養基是由10g/L的麥芽糖、O. 5g/L的硫酸銨、O. lg/L的硫酸鎂、O. 2g/L的氯化鉀、O. 5g/L的酵母粉、O. 002g/L的硫酸亞鐵、O. 2g/L的氯化鈉、5g/L的磷酸氫鈣、20g/L瓊脂配成，再利用O. lmol/L的鹽酸溶液和0. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值為7. O。
4.根據權利要求2或3中的土壤磷素生物活化真菌接種劑的制備方法，其特征在于 所獲得的液體菌種的菌絲體3X 107cfu/ml以上；二級液體菌種的菌絲體3X 108cfu/ml以上；滅菌草碳的分生孢子量達到3X109cfu/g。
5.根據權利要求4中的土壤磷素生物活化真菌接種劑的制備方法，其特征在于上述步驟D中的步驟可以重復多次，進行多級篩選。
6.一種根據上述權利要求中的制備方法所制成的土壤磷素生物活化真菌接種劑，其特征在于所述接種劑采用以下步驟制備A.取保藏號為CGMCC3. 4396的平陽正青霉Eupenicillium eugl aucum的子囊孢子一接種環，放入無菌水中，利用漩渦混合器震蕩I分鐘，使子囊孢子均勻地分散在無菌水中， 制備成子囊孢子懸液；B.取0.Iml上述的子囊孢子懸液，均勻涂布在水瓊脂平板上；C.將水瓊脂平板置于顯微鏡下挑取單孢子，以多個點的方式接種于第一選擇性培養基平板上，在25-27°C中培養10-15天；D.挑取在選擇性培養基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接種到第二選擇性培養基平板上，同樣在在25-27°C中培養10-15天,然后篩選出一株具有最大溶磷圈和菌落直徑的分生孢子；E.將選出的分生孢子在25°C條件下培養1-2天；再用15mL無菌水洗脫孢子，制備成孢子懸濁液，吸取IOmL孢子懸濁液接種到IOOmLPD培養液的三角瓶中，在26°C條件下，震蕩培養3-5天，獲得液體菌種；F.將液體菌與一級種子H)培養液種按15-20%(體積)接種到一級種子H)培養液中， 在27°C條件下，培養1-2天；G.再將培養后的一級種子ro培養液與二級種子ro培養液按15-20%(體積)接種到二級種子ro培養液中，在26-27°C條件下發酵3天，獲得二級液體菌種；H.將二級液體菌種與滅菌草碳I: 4 (重量)吸附，在27°C的條件下，空氣相對濕度大于85%條件下，保濕培養2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。
7.根據權利要求6中的土壤磷素生物活化真菌接種劑，其特征在于所述第一選擇性培養基是由10g/L的葡萄糖、O. 5g/L的硫酸銨、O. lg/L的硫酸鎂、O. 2g/L的氯化鉀、O. 5g/L 的酵母粉、O. 002g/L的硫酸亞鐵、O. 2g/L的氯化鈉、5g/L的磷酸氫鈣、20g/L瓊脂配成，再利用O. lmol/L的鹽酸溶液和O. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值為7. O。
8.根據權利要求6中的土壤磷素生物活化真菌接種劑，其特征在于所述第二選擇性培養基是由10g/L的麥芽糖、O. 5g/L的硫酸銨、O. lg/L的硫酸鎂、O. 2g/L的氯化鉀、O. 5g/L 的酵母粉、O. 002g/L的硫酸亞鐵、O. 2g/L的氯化鈉、5g/L的磷酸氫鈣、20g/L瓊脂配成，再利用O. lmol/L的鹽酸溶液和0. lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值為7. O。
9.根據權利要求6或7中的土壤磷素生物活化真菌接種劑，其特征在于所獲得的液體菌種的菌絲體3X107cfu/ml以上；二級液體菌種的菌絲體3X108cfu/ml以上；滅菌草碳的分生孢子量達到3X 109cfu/g。
10.根據權利要求9中的土壤磷素生物活化真菌接種劑，其特征在于上述步驟D中的步驟可以重復多次，進行多級篩選。
全文摘要
一種土壤磷素生物活化真菌接種劑及其制備方法。取斜面菌種一支，在25℃條件下培養1-2天；用15mL無菌水洗脫孢子，制備孢子懸濁液，吸取10mL孢子懸濁液接種到100mL PD培養液的三角瓶中，在26℃條件下，震蕩培養3-5天，獲得液體菌種；將液體菌種按15-20％接種到一級種子PD培養液中，在27℃條件下℃，培養1-2天；將一級種子PD培養液按15-20％接種到二級種子PD培養液獲得二級液體菌種；將二級液體菌種與滅菌草碳1∶4吸附然后粉碎得到孢子粉。
文檔編號C12N11/14GK102604926SQ201210085390
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者崔振 申請人:宋丹丹, 崔振