專利名稱：一株能夠代謝木糖的釀酒酵母菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株釀酒酵母工程菌，尤其涉及一株酵母菌株中搭建了外源的木糖代謝途徑的、能夠快速代謝木糖的釀酒酵母工程菌株。
背景技術：
可替代石油基燃料和化學品生產技術的開發和儲備是保障社會發展和國家安全的必要舉措。年產量巨大的木質纖維素原料能夠為大規模生物基相關產品生產提供物質基礎，因而備受關注。木質纖維素中可利用糖的主要成分是葡萄糖及木糖，鑒于葡萄糖是容易利用的糖分，因此，含量可高達30%但不易利用的木糖的轉化是原料充分利用的關鍵，也是降低生物基化學品生產成本的基礎。目前從木糖衍生的產品主要是作為功能食品的木糖醇和木寡糖，及化學品糠醛，但這些產品一方面市場容量有限，另一方面只能依賴木糖含量較高的原料(如玉米芯)生產，因此急需開發葡萄糖、木糖共利用的大宗化學品生產平臺以及相應的微生物細胞工廠。釀酒酵母是傳統的乙醇生產菌株，人類對其的利用已有幾百年的歷史，因其良好的生產性能、對環境的高耐受性及公認的食品安全性而被認為是現代生物技術最有應用前景的微生物細胞工廠之一。但是，釀酒酵母因缺少木糖代謝途徑而不能利用木糖。因此， 在釀酒酵母中構建木糖代謝途徑模塊，并進而建立目標產品的產出模塊，將木糖轉化為燃料或其他大宗化工品，對研究和發展以木質纖維素為原料化工產品生產平臺具有重要的意義。在釀酒酵母中搭建的木糖代謝的研究工作已開展多年，主要策略是先將木糖轉化成其異構體木酮糖，木酮糖再經過磷酸化這一限速步驟進入磷酸戊糖(PPP)途徑，磷酸戊糖途徑中間產物再通過糖酵解途徑最終轉化成丙酮酸并進一步代謝。途徑繁瑣且效率不高。首先，木糖轉化成木酮糖的兩條途徑在釀酒酵母中的建立均存在局限性。①木糖還原酶(XR)和木糖醇脫氫酶(XDH)催化的途徑因XR和XDH輔助因子不偶聯，造成引入該途徑的菌株代謝木糖時氧化還原不平衡，由此造成副產物木糖醇積累的問題始終未能徹底解決； ②木糖異構酶(XI)途徑雖然可以避開氧化還原不平衡的問題，但目前也僅有少數幾種木糖異構酶在釀酒酵母中實現活性表達，且在釀酒酵母生長溫度(30°C左右)下酶活不高，導致發酵過程木糖的轉化效率不足。其次，木酮糖需要磷酸化成木酮糖-5-磷酸才能進入磷酸戊糖途徑，控制催化這一反應的木酮糖激酶0 )的表達水平則成為另一瓶頸，研究表明 XK酶活低則表現木糖代謝效率不足，酶活高則由于消耗過多ATP而影響細胞生長。最后， 木酮糖-5-磷酸需要經磷酸戊糖途徑再進入糖酵解途徑才能轉化成丙酮酸，磷酸戊糖途徑的主要作用是在細胞內為許多大分子(如核酸)合成提供中間產物，可想而知，PPP的轉化效率很難在保證自身大分子合成所需的基礎上，再滿足高效木糖分解代謝需要的代謝產物流量。為了提高釀酒酵母木糖代謝轉化效率，很多工作圍繞上面三個問題展開研究，包括對代謝途徑進行了強化和優化，全局性影響因素分析等。目前，相關的工作仍是研究熱點。但能顯著提高釀酒酵母木糖代謝轉化效率的根本措施應該是避開磷酸戊糖途徑。新近在大腸桿菌中建立的木糖代謝途徑引起我們的注意。這一途徑中，一分子木糖經木糖酸、3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸兩個中間代謝產物生成一分子丙酮酸和一分子乙醇醛(圖I)。從代謝途徑上看，這條通過木糖酸的木糖代謝途徑大大縮短木糖到丙酮酸的距離(圖1)，不與合成途徑競爭，是一種經濟節能的途徑。

發明內容
本發明的目的是提供一株酵母菌株中搭建了外源的木糖代謝途徑的、能夠快速代謝木糖的釀酒酵母工程菌株。本發明所述能夠代謝木糖的釀酒酵母菌株，其特征在于所述菌株為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) BSHH02B,該菌已于2012年02月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5747。上述能夠代謝木糖的釀酒酵母菌株帶有木糖代謝途徑，S卩(I)木糖在木糖脫氫酶的催化下生成木糖酸；(2)木糖酸在木糖酸脫水酶催化下生成3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸；
(3)3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸在2-酮-3-脫氧木糖酸醛縮酶催化下丙酮酸和乙醇醛。該菌株還帶有未解析的乙醇醛代謝途徑，可以進一步利用生成的乙醇醛。上述的釀酒酵母菌株的好氧發酵的特征如下在木糖(20g/L)為唯一碳源的全合成營養缺陷型液體培養基SC-ura上的最大比生長速率為O. 361Γ1 ;接種后28小時可收獲14g/L菌體干重的最大釀酒酵母生物量，并在 28小時內將木糖利用完全；15小時后會積累少量的木糖醇，并在接種后21小時達到最大值
O.44g/L ;好氧條件下，不積累木糖酸、乙醇醛、乙二醇、丙酮酸、甘油、乙酸和乙醇。相應的出發菌株CEN. PK102-5B (Dr. Peter kotter贈送)不能利用木糖生長。本發明所述能夠代謝木糖的釀酒酵母菌株的構建方法，步驟是(I)表達載體構建將木糖脫氫酶基因Cc-xylB (Gene ID :7329904)、木糖酸脫水酶基因Ec-yjhG(Gene ID :7438120)和2-酮-3-脫氧木糖酸醛縮酶基因Ec_yjhH(Gene ID :7438121)分別連接在附加體質粒pJFE3上，形成質粒pJFE3_XylB、pJFE3_yjhG和 pJFE3-yjhH ；以pJFE3_yjhH為模板，將Ec-yjhH基因連同它的上下游啟動子和終止子連接在質粒pJFE3-yjhG上，形成質粒PJFE3-yjhG-yjhH ；以pJFE3-xylB為模板，將 Cc-xylB基因連同它的上下游啟動子和終止子連接在質粒pJFE3-yjhG-yjhH上，形成質粒 pJFE3-yjhG-yjhH-xylB ；(2)通過醋酸鋰轉化法將步驟(I)中構建的表達載體pJFE3-yjhG-yjhH_xylB轉化到釀酒酵母菌株CEN. PK102-5b中；在20g/L木糖為唯一碳源的SC-Ura培養基中測試其利用木糖的性能，篩選獲得能夠代謝木糖的釀酒酵母菌株。上述的木糖脫氫酶基因(Cc-xylB)來源于新月桿菌(Caulobacter crescentus)； 上述的木糖酸脫水酶基因(Ec-yjhG)來源于大腸桿菌(Escherichia coli);上述的 2-酮-3-脫氧木糖酸醒縮酶基因(EC-yjhH)來源于大腸桿菌(Escherichia coli)。上述構建表達載體所用的附加體質粒PJFE3是現有技術中已有的，該質粒已在山東大學碩士學位論文“不同來源木糖異構酶基因xylA的克隆、分子改造及在釀酒酵母木糖代謝工程中的應用”(葛瑞蕾，2011)公布，質粒PJFE3的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。上述的木糖代謝途徑在釀酒酵母中的功能表達為世界首次；與其他釀酒酵母菌株所含有的木糖代謝途徑相比，本發明所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) BSHH02BCGMCC No. 5747菌株所含有的木糖代謝途徑具有代謝途徑短、不參與PPP途徑、經濟高效等優點，在好氧條件下，該菌株能夠快速的利用木糖進行生長；能夠應用于利用含木糖的原料生產化工產品，如乙醇、乙二醇、羧酸等。


本發明所述釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) BSHH02B 已于 2012 年 02 月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為 CGMCCNo. 5747，保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究。圖I是菌株BSHH02B代謝木糖的示意圖，其中，一分子木糖經木糖酸、3_脫氧-D-甘油-戊酮糖酸兩個中間代謝產物生成一分子丙酮酸和一分子乙醇醛，并進一步代謝。圖2是釀酒酵母附加體穿梭質粒pJFE3_y jhG-y jhH-xylB示意圖，其中木糖脫氫酶基因(Cc-xylB)來源于新月桿菌(Caulobacter crescentus),木糖酸脫水酶基因(Ec-yjhG)來源于大腸桿菌(Escherichia coli), 2_酮_3_脫氧木糖酸醒縮酶基因 (Ec-yjhH)來源于大腸桿菌(Escherichia coli);并且以上三種基因都在釀酒酵母組成型啟動子TEFlp控制下表達。圖3是質粒pJFE3_xylB示意圖,其中木糖脫氫酶基因(Cc-xylB)來源于新月桿菌 (Caulobacter crescentus),且此基因在組成型啟動子TEFlp控制下表達。圖4是質粒pJFE3_yjhG示意圖,其中木糖酸脫水酶基因(Ec-yjhG)來源于大腸桿菌(Escherichia coli),且此基因在組成型啟動子TEFlp控制下表達。圖5是質粒pJFE3_yjhH示意圖，其中2-酮-3-脫氧木糖酸醛縮酶基因(Ec-yjhH) 來源于大腸桿菌(Escherichia coli),且此基因在組成型啟動子TEFlp控制下表達。圖6是質粒pJFE3-yjhG_yjhH示意圖,其中木糖酸脫水酶基因(Ec-yjhG)來源于大腸桿菌(Escherichia coli), 2_酮_3_脫氧木糖酸醒縮酶基因(Ec-yjhH)來源于大腸桿菌(Escherichia coli);并且以上兩種基因都在各自的同一種組成型啟動子TEFlp控制下表達。圖7是菌株BSHH02B在木糖(20g/L)為唯一碳源的全合成營養缺陷型培養基 SC-Ura上的生長曲線及代謝產物分析圖。BSHH02B在木糖(20g/L)為唯一碳源的全合成營養缺陷型液體培養基SC-ura上的最大比生長速率為0. 361Γ1 ;接種后28小時可收獲14g/L 菌體干重(▲)的最大釀酒酵母生物量，并在28小時內將木糖( )利用完全；15小時后會產生少量的木糖醇(■)，并在接種后21小時達到最大值0. 44g/L ;在整個好氧發酵過程中，不積累木糖酸、乙醇醛、乙二醇、丙酮酸、甘油、乙酸和乙醇。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例I :重組質粒的構建方法如下(I)根據新月桿菌(Caulobacter crescentus)的木糖脫氫酶基因(Cc-xylB)序列人工合成其DNA ;并以此DNA為模板，以XF (XF的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示)5’_ GTACGGATCCATGTCCTCAGCCATCTATCC-3'和 XR(XR 的核苷酸序列如 SEQ ID No. 3 所示)5' -TGACCTGCAGTCAACGCCAGCCGGCGTCG-3'為引物擴增Cc-xylB片段；隨后利用限制性內切酶 BamHI和PstI對此擴增片段進行限制性酶切，并連接于附加體質粒pJFE3的TEFlp啟動子和PGKlt終止子之間(利用限制性內切酶BamHI和PstI對pJFE3進行限制性酶切)，形成質粒 pJFE3-xylB(圖 3)。上述pJFE3(2)以大腸桿菌(Escherichia coli)染色體為模板，以GF(GF的核苷酸序列如SEQ ID 吣.4所示)5' -CAGGTCTAGAAGGAGAAACTCATGTCTGT-3'和 GR(GR 的核苷酸序列如 SEQ ID No. 5 所示)5' -CATTCTGCAGGTCGGATAATTCAGGTGTCT-3'為引物擴增木糖酸脫水酶基因(Ec-yjhG)片段；隨后利用限制性內切酶XbaI和PstI對此擴增片段進行限制性酶切，并連接于附加體質粒PJFE3的TEFlp啟動子和PGKlt終止子之間(利用限制性內切酶XbaI 和PstI對pJFE3進行限制性酶切)，形成質粒pJFE3-yjhG(圖4)。(3)以大腸桿菌(Escherichia coli)染色體為模板，以HF (HF的核苷酸序列如SEQ ID No. 6 所示)5' -GTCAAGATCTATGAGCACTTACGAAAAGGA-3'和 HR(HR 的核苷酸序列如 SEQ ID No. 7 所示)5' -GATCCTGCAGTCAGACTGGTAAAATGCCCT-3'為引物擴增 2-酮-3-脫氧木糖酸醛縮酶基因(Ec-yjhH)片段；隨后利用限制性內切酶BglII和PstI對此擴增片段進行限制性酶切，并連接于附加體質粒PJFE3的TEFlp啟動子和PGKlt終止子之間(利用限制性內切酶BamHI和PstI對pJFE3進行限制性酶切)，形成質粒pJFE3_yjhH(圖5)。 (4)以質粒pJFE3_y jhH為模板，以PHF (PHF的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示) 5' -GTCTGAGCTCAACGAACGCAGAATTTTCGA-3'和 PHR(PHR 的核苷酸序列如 SEQ ID No. 9 所示)5 ' -CATCGAGCTCCACAATGCATACTTTGTACG-3 '為引物，將 Ec-yjhH 連同它的上下游 TEFlp啟動子和PGKlt終止子一同PCR擴增，連接于pJFE3_yjhG質粒的SacI酶切位點上， 形成質粒 pJFE3-yjhG-yjhH(圖 6)。(5)以質粒pJFE3-χylB為模板，以PBF(PBF的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示) 5 ' -GTCTCATATGAACGAACGCAGAATTTTCGA-3 '和 PBR (PBR 的核苷酸序列如 SEQ ID No. 11 所示):5 ' -CATCCATATGCACAATGCATACTTTGTACG-3 '為引物，將 Cc-xylB 連同它的上下游 TEFlp啟動子和PGKlt終止子一同PCR擴增，連接于pJFE3-yjhG_yjhH質粒的NdeI酶切位點上，形成質粒 pJFE3_yjhG-yjhH_xylB(圖 2)。實施例2 :重組菌株的構建(I)接CEN. PK102-5B菌株在YPD培養基，30°C培養過夜；(2)轉接過夜培養的CEN. PK102-5B培養液到50ml新鮮YPD中，使初始OD6tltl等于
O.25，繼續30°C培養約4小時，使培養液OD600等于O. 7至I. O ;(3)將質粒pJFE3_y jhG-y jhH-xylB用醋酸鋰轉化法轉化CEN. PK102-5B菌株，其中，50%的聚乙二烯(PEG)3350用作保護劑，單鏈魚精DNA用于質粒轉化的擔體。(4)轉化后的菌懸液涂布添加20g/L葡萄糖的全合成營養缺陷型培養基SC-Ura平板，挑取轉化子。(5)轉化子在20g/L木糖為唯一碳源的SC-Ura培養基中測試其利用木糖的性能， 篩選獲得能快速利用木糖的釀酒酵母菌株BSHH02B。
上述釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BSHH02B 已于 2012 年 02 月 08 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5747， 保藏地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究。實施例3 BSHH02B菌株的木糖發酵方法如下(I)菌株活化挑取BSHH02B菌株的單菌落接種于添加20g/L葡萄糖的全合成營養缺陷型培養基SC-Ura中，30°C、200rpm培養24小時；上述培養物以10%體積的接種量轉接于全合成營養缺陷型培養基SC-Ura (20g/L葡萄糖作為碳源)中，30°C、200rpm培養12 小時。(2)接種將以上活化的菌液作為菌種，無菌水沖洗后以初始OD6tltl = O. I接種于含 800ml的全合成營養缺陷型培養基SC-Ura (20g/L木糖作為碳源)的IL發酵罐中；在30°〇、 pH 5. 0,0. 5L/min的通氣量、600rpm的攪拌轉速的條件下進行發酵。(3)生長曲線的測定接種后，每隔一段時間取一定量的發酵液，測定菌液的0D_ 值，并計算比生長速率和獲得的生物量(對該菌株，經測定，每單位OD6c 值相當于O. 2457g/ L的細胞干重)。BSHH02B在木糖(20g/L)為唯一碳源的全合成營養缺陷型液體培養基 SC-ura上的最大比生長速率為O. 36^1, 28小時可收獲14g/L菌體干重的最大釀酒酵母生物量。(如圖7)。相應的親本菌株CEN. PK102-5B不能利用木糖生長。(4)代謝產物的分析將以上所取的發酵液13000rpm離心I分鐘后，取上清液為高效液相色譜層析(HPLC)的分析樣品，對其中的代謝產物(木糖、木糖酸、木糖醇、乙醇醛、乙二醇、丙酮酸、甘油、乙酸、乙醇)進行定量分析。分析過程中層析柱使用Aminex HPX-87H(Bio-Rad, USA)離子交換柱，檢測器使用折光檢測儀RID-10A (Shimadze，Japan)和二極管陣列檢測器 SPD_M20A(Shimadze, Japan),流動相為 5mM H2SO4J^速為 O. 6ml/min,柱溫為45°C。分析過程中所使用的層析柱不能將木糖和木糖酸有效的分離，木糖酸的定量還需使用Lien所建立的異羥肟酸比色法(1959):將上清液樣品溶于O. 7M的HCl，100°C沸水浴15分鐘將木糖酸轉化為木糖酸-Y -內酯；取以上溶液125ul溶于250ul的羥胺試劑(2M 的羥胺鹽酸溶于2M的NaoH)，隨后依次加入162. 5ul的Hcl (3. 2M)和125ul的FeCl3(100g/ L，溶于O. IM的Hcl);最后，測定反應液在550nm處的吸光值。以上異羥肟酸比色法結合 HPLC即可計算出發酵液中木糖酸和木糖的含量。菌株BSHH02B在28小時內完全利用培養基中的木糖；15小時后開始積累少量的木糖醇，并在接種后21小時達到最大值O. 44g/L ； 在整個好氧發酵過程中，不積累木糖酸、乙醇醛、乙二醇、丙酮酸、甘油、乙酸和乙醇。本發明中使用的培養基配方YPD 培養基2%蛋白胨，I %酵母粉，2%葡萄糖，蒸餾水配制，自然pH值，115°C高溫滅菌30分鐘。SC-Ura 培養基I. 7g/L酵母基礎氮源(YNB)，5. Og/L硫酸銨，O. 77g/L缺尿嘧啶的氨基酸混合物， pH6.0，115°C高溫滅菌30分鐘。當補加碳源時，木糖或葡萄糖單獨滅菌后加入，糖終濃度為 20g/L。
權利要求
1.一株能夠代謝木糖的釀酒酵母菌株，其特征在于所述菌株為釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)BSHH02B,該菌已于2012年02月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5747。
2.權利要求I所述能夠代謝木糖的釀酒酵母菌株的構建方法，步驟是(1)表達載體構建將木糖脫氫酶基因Cc-xylB、木糖酸脫水酶基因Ec-yjhG和 2-酮-3-脫氧木糖酸醛縮酶基因Ec-yjhH分別連接在附加體質粒pJFE3上，形成質粒 pJFE3-xylB、pJFE3_yjhG 和 pJFE3_yjhH ；以 pJFE3_yjhH 為模板，將 Ec-yjhH 基因連同它的上下游啟動子和終止子連接在質粒PJFE3-y jhG上，形成質粒pJFE3_y jhG_y jhH ； 以pJFE3-xyIB為模板，將Cc_XyIB基因連同它的上下游啟動子和終止子連接在質粒 pJFE3-yjhG-yjhH 上,形成質粒 pJFE3-yjhG-yjhH_xylB ；(2)通過醋酸鋰轉化法將步驟(I)中構建的表達載體pJFE3-yjhG-yjhH_xylB轉化到釀酒酵母菌株CEN. PK102-5B中；在20g/L木糖為唯一碳源的SC-Ura培養基中測試其利用木糖的性能，篩選獲得能夠代謝木糖的釀酒酵母菌株。
3.根據權利要求3所述的構建方法，其中所述的木糖脫氫酶基因Cc-xylB來源于新月桿菌(Caulobacter crescentus)。
4.根據權利要求3所述的構建方法，其中所述的木糖酸脫水酶基因Ec-yjhG來源于大腸桿菌(Escherichia Coli)。
5.根據權利要求3所述的構建方法，其中所述的2-酮-3-脫氧木糖酸醛縮酶基因 Ec-yjhH 來源于大腸桿菌(Escherichia Coli)。
全文摘要
本發明公開了一株能夠代謝木糖的釀酒酵母菌株，所述菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSHH02B，該菌已于2012年02月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.5747。該菌株搭載有一獨特的木糖代謝途徑，即一分子木糖經木糖酸、3-脫氧-D-甘油-戊酮糖酸兩個中間代謝產物生成一分子丙酮酸和一分子乙醇醛。利用該木糖代謝途徑，本發明所述釀酒酵母BSHH02B能夠在好氧條件下快速的利用木糖進行生長，并能夠應用于利用含木糖的原料生產化工產品，如乙醇、乙二醇、羧酸等。
文檔編號C12N15/81GK102604850SQ20121008813
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月29日 優先權日2012年3月29日
發明者劉懷偉, 沈煜, 霍文嚴, 鮑曉明 申請人:山東大學