專利名稱：一種高親和力青霉素結合蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及食品安全檢測領域。更具體的，本發明涉及分子改造獲得的高親和力青霉素結合蛋白及其在農副產品中￠-內酰胺類抗生素殘留快速檢測中的應用。
背景技術：
奶牛在養殖過程中易患乳房炎、陰道炎等疾病，由于P -內酰胺類抗生素藥效好、價格低廉，奶農在奶牛患病時大量使用，導致原料乳中￠-內酰胺類抗生素殘留現象普遍，在很大程度加大了乳制品企業奶源質量安全控制的難度，而含有￠-內酰胺類抗生素殘留的乳制品會影響到消費者的身體健康和生命安全。因此，農業部出臺了行業標準《無公害食品生鮮牛乳》(NY5045-2008)，要求乳制品企業必須檢測原料乳中P -內酰胺類抗生素殘 &3甶o青霉素結合蛋白是細菌細胞壁合成的重要的酶，具有￠-內酰胺環結構的抗生素類似其底物，與其可發生不可逆結合。因此，青霉素結合蛋白是實現3 -內酰胺類抗生素殘留快速檢測最具潛力的蛋白。但目前已知的青霉素結合蛋白與￠-內酰胺類抗生素的親和力達不到國家要求的檢測標準，為實現快速檢測￠-內酰胺類抗生素，迫切需要找到與3-內酰胺類抗生素親和力更高的青霉素結合蛋白。目前，乳制品企業使用的內酰胺類抗生素快速檢測產品主要以進口產品為主，如美國Snap公司和比利時UniSensor公司。本發明針對我國P _內酰胺類抗生素快速檢測產品存在的檢測限達不到國家標準問題，利用計算機輔助設計、量子化學、分子生物學、分析化學等方法，對無乳鏈球菌青霉素結合蛋白(PBP Ib)的第526位和547位氨基酸進行分子改造，開發了一種新的高親和力青霉素結合蛋白。本發明中，命名這種高親和力青霉素結合蛋白為WFYZH-Pro-P -lactam，其對應基因為WFYZH-Gen-P -lactam，表達載體為WFYZH-Bdzt- P -lactam。本發明以WFYZH-Pro- ^ -Iactam作為分子識別原件,開發了一種^-內酰胺類抗生素快速檢測試紙條。

發明內容
本發明的目的是提供一種與P -內酰胺類抗生素親和力更高的青霉素結合蛋白(WFYZH-Pro-0-lactam)。本發明涉及的保藏菌株為大腸埃希氏菌Escherichia coli,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路I號院，100101，中國)，保藏日期2011年10月24日，保藏編號CGMCC No. 5381。本發明的另一個目的是提供一種基于WFYZH-Pro-0 -Iactam生產的能達到或超過國家檢測標準的￠-內酰胺類抗生素殘留快速檢測試紙條。本發明的第一方面，提供了 WFYZH-Pro-0 -Iactam :將PBP Ib的第526位的異亮氨酸和第547位的谷氨酰胺改造為賴氨酸和精氨酸，制備原核表達載體轉化大腸桿菌BL21制得陽性菌株(命名為WFYZH-Gchj-P-lactam，CGMCC No. 5381)進行表達，并通過分離純化、活性測定和蛋白鑒定獲得WFYZH-Pro- ^ -lactam。
本發明的第二方面,提供了一種基于WFYZH-Pro-0-lactam開發的￠-內酰胺類抗生素快速檢測試紙條。在本發明實施例中，提供了基于WFYZH-Pro-P-Iactam加工試紙條的方法。


圖I是WFYZH-Pro-@ -Iactam的對應基因測序結果。圖2是WFYZH-Pro- ^ -Iactam的對應氨基酸測序結果。圖3是試紙條示意圖。
具體實施例方式本發明將PBP Ib的第526位的異亮氨酸和第547位的谷氨酰胺改造為賴 氨酸和精氨酸，并通過原核表達載體制備、表達純化、活性測定、蛋白鑒定等，獲得了WFYZH-Pro-P-Iactam，其與P -內酰胺類抗生素的親和力大幅提高。I、基因定點突變根據所要突變位點的DNA序列設計兩條突變引物(Ptl和Pt2)，與重組質粒PGEX-6p-l-PBP Ib引物(Pl和P2)配合進行3輪聚合酶鏈式反應(PCR)反應。第I輪PCR反應以重組質粒PGEX-6p-l-PBP Ib為模板，以Pl和Pt2搭配，擴增得到PBPIb基因5'端片段，以Ptl和P2搭配，擴增得到3'端片段，分別回收擴增產物備用。第2輪PCR反應以第I輪PCR反應得到的兩個片段互為模板和引物作一次10個循環的擴增。第3輪PCR反應以第2輪PCR反應得到的產物為模板，Pl和P2搭配為引物再進行擴增，即可得到帶有突變位點的目的基因，將其連接到載體(pGEM-T)中，轉化鑒定后的陽性克隆進行測序，即可獲得克隆載體(命名為pGEM-WFYZH)。2、原核表達載體構建用內切酶(XhoI和EcoRI)對pGEM_WFYZH與原核表達載體(pGEX-6p-l)分別進行雙酶切，凝膠電泳后回收相應片段。在連接酶(T4DNA)的作用下將其連接，構建含目的基因的原核表達載體，轉化大腸桿菌DH5 a恒溫培養后，提取重組質粒。重組質粒經PCR和酶切鑒定正確后進行基因測序。測序結果表明(如附圖1)，第526位異亮氨酸對應的堿基ata已經突變為aaa(賴氨酸)；第547位谷氨酰胺對應的堿基caa已經突變為cga (精氨酸)。3、蛋白的轉化和表達自-70°C冰箱中取出含感受態大腸桿菌BL21 50 y L的I. 5mL離心管,插入濕冰中溶解約15min,向其中加入5 y L構建好的重組質粒,輕輕混勻后靜置冰上30min。42°C水浴熱激90s，迅速移入冰浴中靜置2min，加入800iiL LB培養基(含15iig/mL四環素)，然后于37°C振蕩培養(225rmp) lh，取50 y L培養物涂LB瓊脂平板，于37°C培養12h ;挑選單菌落，用LB培養基振蕩培養12h，提質粒，酶切鑒定，保存陽性克隆菌種。將陽性克隆菌種接種于5mL LB培養基中，于37°C、220rmp培養24h，培養物轉接至IOOmL LB培養基，37°C振蕩培養至OD6tltl為0. 8，加入異丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為lmmol/L，繼續培養4h。采用4°C、6000rmp離心15min收獲菌體。菌體重懸于磷酸緩沖液(PBS，0. Olmol/L)，菌體置冰浴中超聲破碎。加入聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-IOO)至終濃度1%，室溫攪拌30min，4°C、12000rmp離心15min，收集上清液。4、蛋白純化以10倍體積的PBS和10倍體積的含1% Triton X-100的PBS平衡好的谷胱甘肽親和層析柱，以20倍柱體積的PBS洗去雜蛋白，親和柱中加入凝血酶，250C反應12h，收集酶切反應液，上樣于經過lOmmol/L NH4HCO3預平衡的丙烯葡聚糖凝膠SlOO層析柱，以lOmmol/L NH4HCO3洗脫，收集洗脫液，濃縮。純化后的WFYZH-Pro- ^ -Iactam儲存在-20°C、10%的甘油溶液中。5、活性測定4°C條件下，向酶標板微孔中加入一定量WFYZH-Pro-P-Iactam溶液，放置過夜，以使蛋白固定于微孔表面，使用PBS沖洗微孔后，繼續加入2%酪蛋白溶液封閉，使用PBS沖洗三次后備用。首先應該是配制含四種￠-內酰胺抗生素的牛乳樣品(請添加)，向微孔中加入100 u L脫脂后的待測牛乳樣品(做三個平行樣)，37°C培養30min，使牛乳樣品中含有的待測0 -內酰胺類抗生素與WFYZH-Pro-P -lactam充分反應，生成蛋白-待測抗生素復合物。向微孔中加入IOOii L生物素標記的氨芐青霉素(B-AMPI)，37°C培養30min，生成蛋白-B-AMPI復合物。用清洗溶液(8. 55g/L NaCl和0. 25mL/L Tween20)及PBS清洗兩次后，向微孔中加入100 u L辣根過氧化物酶標記的親和素(I 1500)，370C培養30min，以使蛋白-B-AMPI復合物與辣根過氧化氫酶標記的親和素充分反應。使用清洗溶液和PBS沖洗微孔后，加入IOOii L辣根過氧化氫酶底物四甲基聯苯胺溶液，37°C培養IOmin,向微孔中加入100 u L lmol/L鹽酸溶液以終止酶解反應，并使用酶標儀測定微孔在 450nm處的吸光值。利用上述方法，分別測定改造前后PBP Ib和WFYZH-Pro- ^ -Iactam對于四種常用P-內酰胺類抗生素的檢測極限(結果見下表)。表PBP Ib 和 WFYZH-Pro-P-Iactam 的活性對比結果
權利要求
1.一種高親和力青霉素結合蛋白，其特征在干，所述蛋白基于無乳鏈球菌青霉素結合蛋白(PBP Ib)分子改造獲得，其氨基酸序列為SEQ 2。
2.一種表達如權利要求I所述高親和力青霉素結合蛋白的菌株，其保藏號為=CGMCCNo.5381。
3.ー種內酰胺類抗生素快速檢測試紙條，其特征在于，該試紙條是基于權利要求I所述的高親和カ青霉素結合蛋白生產獲得。
4.根據權利要求3所述的β-內酰胺類抗生素快速檢測試紙條在用于快速檢測β -內酰胺類抗生素的殘留量的應用，其中所述的β_內酰胺類抗生素為具有β_內酰胺環的一大類抗生素，包括青霉素類抗生素、頭孢菌素類抗生素、頭霉素類抗生素、硫霉素類抗生素及單環β-內酰胺類抗生素等。
5.根據權利要求3所述的β_內酰胺類抗生素快速檢測試紙條在快速檢測農副產品中內酰胺類抗生素中的應用，其中所述的內酰胺類抗生素為具有內酰胺環的一大類抗生素，包括青霉素類抗生素、頭孢菌素類抗生素、頭霉素類抗生素、硫霉素類抗生素及單環β-內酰胺類抗生素等。
全文摘要
本發明提供了一種高親和力青霉素結合蛋白，其特征在于，該蛋白是由無乳鏈球菌青霉素結合蛋白(PBP 1b)的第526位異亮氨酸和第547位的谷氨酰胺分別改造為賴氨酸和精氨酸后獲得，提高了與β-內酰胺類抗生素的親和力。本發明還提供了一種基于該蛋白生產的快速檢測試紙條，可用于快速檢測農副產品β-內酰胺類抗生素殘留。
文檔編號C12N1/21GK102627693SQ20121008910
公開日2012年8月8日 申請日期2012年3月30日 優先權日2011年11月22日
發明者侯偉, 周峰, 邢媛 申請人:平原縣偉峰永駐科技有限公司