專利名稱：用于檢測辣椒疫霉的lamp引物及含有該引物的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及辣椒疫霉的檢測，具體地說，涉及用于檢測辣椒疫霉的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。
背景技術(shù)：
植物病原卵菌是一類重要的植物病原菌，可侵染危害多種植物，導(dǎo)致多種植物的毀滅性病害，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(P. capsici)、大豆疫霉 (P. sojae)、寄生疫霉(P. parasitic)、樟疫霉(P. cinnamomi)及冬生疫霉(P. hibemalis)分別引起馬鈴薯、辣椒、大豆、煙草、樟樹及柑橘的重要疫病，嚴(yán)重年份乃至絕產(chǎn)。該類病菌主要以菌絲體或卵孢子在病殘體或土壤中渡過不良環(huán)境而作為初侵染源，在適宜條件下，菌絲體或卵孢子均可萌發(fā)產(chǎn)生孢子囊-釋放游動孢子，再借助雨水或氣流進行傳播、侵染而導(dǎo)致植物病害。因此，對該類病菌的初侵源或侵染寄主早期進行適時監(jiān)控，利于控制病害的發(fā)生，傳統(tǒng)的病害防控策略主要依靠品種、栽培、化防和生態(tài)調(diào)控等防治措施，這些防控措施主要在病害爆發(fā)乃至產(chǎn)生明顯危害時才實施，忽視了對初侵染源或侵染寄主早期適時采取綜合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最終很難控制病害的發(fā)生與流行。辣椒疫霉(P. capsici)是我國常見辣椒病害種類，多在高溫高濕的環(huán)境下侵染辣椒，如朝天椒(Capsicum annuum)、小米辣(C. frutescens),造成疫病,而使作物大幅度減產(chǎn)甚至絕收。辣椒疫霉在國內(nèi)也有侵染香蕉樹(Hevea brasiliensis)、木瓜(Chaenomeles sinensis)、胡椒(Pipernigrum)、扁葉香果蘭(Vanilla planifolia)等作物的報道，因此開發(fā)辣椒疫霉的早期快速檢測技術(shù)，對相關(guān)作物生產(chǎn)中的病害防控和無公害化具有重要的意義。近年來，PCR技術(shù)及其相關(guān)分子檢測技術(shù)已廣泛用于植物病原菌消長動態(tài)的分子檢測與預(yù)警，主要利用核糖體rDNA/ITS序列設(shè)計特異性引物來對植物致病菌進行快速檢測。ITS+5. 8S區(qū)域由編碼真核細胞rRNA 5. 8S亞基的基因和該基因兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間序列 (InterTranscribedSpacer, ITS)組成，由于ITS+5. 8S區(qū)域具有較高的變異速率，因此常被用于真菌種水平的鑒定和分子系統(tǒng)學(xué)研究。目前大多采用常規(guī)PCR方法進行植物病原菌檢測，對儀器設(shè)備(如PCR儀、凝膠成像系統(tǒng))要求高，投入大，給技術(shù)的基層推廣造成了極大障礙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種便于基層推廣使用的，用于檢測辣椒疫霉的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于檢測辣椒疫霉(Phytophthora capsici) 的LAMP引物組，其包括外側(cè)正向引物F3 :5 ’ -AACGCATATTGCACTTCCG-3 ’ ；外側(cè)反向引物B3 :5 ’ -GCCTCCACAACCAGCAAG-3 ’ ；以及
內(nèi)側(cè)正向引物 FIP : 5 ’ -CATCCTCCACCGACTACACGGCCTGGGAGTATGCCTGTATCAG-3 ’ ；內(nèi)側(cè)正向引物 BIP :5’ -TGTTGTCCTTCGGGTCGACTGTACCACGCTTTTCGAGCAA-3’。本發(fā)明還提供含有上述LAMP引物組的用于檢測辣椒疫霉的試劑盒，其中所述試劑盒包括引物FIP、BIP、F3和B3。前述試劑盒中還包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。更優(yōu)選地，前述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。本發(fā)明進一步提供上述LAMP引物組或試劑盒在檢測辣椒疫霉中的應(yīng)用，包括步驟1)提取樣品中的DNA ；2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進行LAMP-PCR擴增反應(yīng)；3) 分析PCR產(chǎn)物，即對上述擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳檢測結(jié)果判定樣品中是否含有辣椒疫霉。其中，LAMP-PCR反應(yīng)體系以25 μ I計為
模板DNA2μ1112mMdNTPs1.25μ120μΜ引物FIP2μ120μΜ引物BIP2μ1ΙΟμΜ引物F30·5μ1ΙΟμΜ引物Β30·5μ18υ/μ1 Bst DNA 聚合酶Ιμ 10 X PCR反應(yīng)緩沖液12.5μ1ddH20補足至LAMP-PCR反應(yīng)條件為65°C 60分鐘，80°C 2分鐘，冰上終止反應(yīng)。用上述引物組對待測樣品DNA進行恒溫擴增，若電泳檢測結(jié)果出現(xiàn)梯狀DNA條帶， 則該樣品含有辣椒疫霉病菌，若沒有擴增出條帶，則該樣品中不含辣椒疫霉病菌。本發(fā)明將LAMP引物恒溫擴增技術(shù)用于辣椒疫霉病菌的快速檢測，可從發(fā)病植物組織及土壤中復(fù)雜的病原菌環(huán)境準(zhǔn)確地檢測出辣椒疫霉。該方法的特異性和靈敏度均較常規(guī)PCR方法更高，可對辣椒疫霉的各種形態(tài)的繁殖體如菌絲、卵孢子和游動孢子等進行檢測，對辣椒疫霉疫情的早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測等方面具有重要意義；同時可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。


圖I為本發(fā)明LAMP引物組恒溫擴增結(jié)果；其中，1-6為辣椒疫霉病菌，C為辣椒DNA 樣品，7-15分別為致病疫霉、黃瓜疫霉、大豆疫霉、惡疫霉、終極腐霉、畸雌腐霉、刺腐霉、地生腐霉、鐮刀菌，NC為陰性對照。圖2為本發(fā)明LAMP引物組恒溫擴增反應(yīng)體系渾濁度目測效果；其中，管1_6為辣椒疫霉病菌，管C為辣椒DNA樣品，管7-15分別為致病疫霉、黃瓜疫霉、大豆疫霉、惡疫霉、終極腐霉、畸雌腐霉、刺腐霉、地生腐霉、鐮刀菌，管NC為陰性對照。圖3為LAMP引物組恒溫擴增反應(yīng)體系靈敏度檢測結(jié)果，其中，1-7分別代表DNA樣品經(jīng) IoiUo4Uo8Uo9Uo10Uo11 及 ο12 倍稀釋。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例均按照常規(guī)實驗條件,如Sambrook等分子克隆實驗手冊(New York Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),或 Draper 等(Blackwell 科學(xué)出版社， 1988)，鄭小波(疫霉菌及其研究技術(shù)，中國農(nóng)業(yè)出版社，1997)中所述的操作技術(shù)規(guī)程，或按照制造廠商所建議的實驗條件。實施例I用于檢測辣椒疫霉的LAMP引物組的合成根據(jù)辣椒疫霉(P. capsici) ITS+5. 8S區(qū)域的基因序列，設(shè)計用于檢測辣椒疫霉的 LAMP引物組，其包括外側(cè)正向引物F3 :5 ’ -AACGCATATTGCACTTCCG-3 ’ ；外側(cè)反向引物B3 :5 ’ -GCCTCCACAACCAGCAAG-3 ’ ；內(nèi)側(cè)正向引物 FIP : 5 ’ -CATCCTCCACCGACTACACGGCCTGGGAGTATGCCTGTATCAG-3，；
內(nèi)側(cè)正向引物 BIP :5’ -TGTTGTCCTTCGGGTCGACTGTACCACGCTTTTCGAGCAA-3’。引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。實施例2利用LAMP弓I物組檢測辣椒疫霉的特異性分析I. I試劑和設(shè)備水浴鍋，LAMP-PCR試劑盒購自日本榮研公司。I. 2樣本來源本實施例中采用的辣椒疫霉病菌六個株系、致病疫霉、黃瓜疫霉、大豆疫霉、惡疫霉、終極腐霉、畸雌腐霉、刺腐霉、地生腐霉、鐮刀菌等(表I)保存于中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗室和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉西莉教授實驗室，部分病菌由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)張修國教授實驗室惠贈。表I用于LAMP-PCR檢測的樣本來源
權(quán)利要求
1.用于檢測辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)的LAMP引物組,其特征在于,其包括 外側(cè)正向引物 F3 :5，-AACGCATATTGCACTTCCG-3，；外側(cè)反向引物 B3 :5’ -GCCTCCACAACCAGCAAG-3’ ；以及內(nèi)側(cè)正向引物 FIP :5’ -CATCCTCCACCGACTACACGGCCTGGGAGTATGCCTGTATCAG-3’ ；內(nèi)側(cè)正向引物 BIP :5’ -TGirGTCCTTCGGGTCGACTGTACCACGCITTTCGAGCAA-3’。
2.含有權(quán)利要求1所述LAMP引物組的用于檢測辣椒疫霉的試劑盒，其特征在于，所述 試劑盒包括引物FIP、BIP、F3和B3。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、BstDNA聚 合酶、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。
5.權(quán)利要求1所述LAMP引物組或權(quán)利要求2-4任一項所述試劑盒在檢測辣椒疫霉中 的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟1)提取樣品中的DNA；2)以步驟1)中提取的DNA為模板，進行LAMP-PCR擴增反應(yīng)；3)分析PCR產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，PCR反應(yīng)體系以25yl計為模板 DNA2^il112mM dNTPs1.25^il20|iiM引物FIP2^il20|iiM引物BIP2^il10|iiM引物F30.5^il10|iiM引物B30.5^il8U/|iil Bst DNA聚合酶1 pi10 x PCR反應(yīng)緩沖液12.50ddH20補足至250。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，LAMP-PCR反應(yīng)條件為65°C60分鐘， 80 °C 2分鐘，冰上終止反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的LAMP引物及含有該引物的試劑盒，所述引物包括FIP和BIP以及F3和B3(如Seq ID No.1-4所示)。本發(fā)明將LAMP引物恒溫擴增技術(shù)用于辣椒疫霉病菌的快速檢測，可從發(fā)病植物組織及土壤中復(fù)雜的病原菌環(huán)境準(zhǔn)確地檢測出辣椒疫霉。該方法的特異性和靈敏度均較常規(guī)PCR方法更高，可對辣椒疫霉的各種形態(tài)的繁殖體如菌絲、卵孢子和游動孢子等進行檢測，對辣椒疫霉疫情的早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測等方面具有重要意義；同時可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。
文檔編號C12Q1/68GK102586469SQ201210093758
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者孫翔, 郭良棟 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所