專利名稱：一種用于檢測辣椒疫霉的引物及其檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及 一種用于檢測疫霉菌的通用分子引物、檢測辣椒疫霉的特異性分子引物及其檢測試劑盒，屬于生物技術領域。
背景技術：
辣椒疫霉能引起辣椒、南瓜、西葫蘆等多種作物發病，俗稱“死秧病”，常引致辣椒等作物死苗、爛果，一般死株率為15% — 30%，嚴重時高達60%以上，甚至毀種，嚴重影響辣椒等作物的產量與品質。該病于1918年在美國最早發現，Leonian于1922年分離并定名為Phytophthora capsici Leon。我國于60年代初始見于新疆，70年代偶爾發生，80年代中期以來連年發生，且很快由新疆經甘肅、青海等省迅速蔓延開來，現在陜西、江西、上海、湖南、安徽等全國大部分地區該病的危害都非常嚴重，特別是近年來，隨著我國農業產業結構的調整，設施農業大量發展，辣椒種植面積不斷擴大，該病在我國有逐年加重的趨勢。這種嚴峻的形勢要求盡快建立一套快速靈敏的檢測方法用于辣椒疫病的早期診斷，為辣椒疫病的防治提供依據。傳統檢測植物病害的方法為通過直接觀察植物組織的發病癥狀，分離得到病原物后再進行形態學鑒定。然而直接觀察會遺漏潛育期或隱癥的病害，以致延誤病害的防治，導致病害的爆發。辣椒疫霉菌引起的病害很容易與腐霉菌和鐮刀菌引起的病害癥狀相混淆。因此對于辣椒疫霉診斷來說，分離得到病原菌的純培養是必要的。而得到辣椒疫霉菌的純培養后的鑒定工作依然困難重重，且辣椒疫霉與其他疫霉種之間形態差異較小，采用形態學為主要分類依據的傳統鑒定方法很難對疫霉菌進行準確的鑒定，也難以快速及時地進行病害的診斷。費時費力，而且要求操作者具備豐富的疫霉菌分離、形態學鑒定知識，對基層植保工作者具有一定的難度。因此，開發出快速靈敏、易操作、易普及的檢測方法對于控制由辣椒疫霉菌弓I起的病害具有十分重要的意義。從聚合酶鏈式反應(PCR)發明以來，便以其快速靈敏的特性成為動植物病原物檢測的重要方法。跟傳統的檢測方法相比較，PCR技術具有高度的特異性及靈敏度，且耗時短等優點，更可通過實時定量PCR技術對植物病毒、細菌、真菌及卵菌進行定量檢測。發展分子檢測方法的基礎是尋找合適的病原菌分子靶標，目前廣泛采用的植物疫病菌分子檢測靶標是核糖體基因ITS序列，該序列在許多疫霉種間缺乏足夠的多態性。此外，elicitin基因也被用來作為疫霉菌檢測的標靶，Ras家族相關的編碼基因Yptl被廣泛用于疫霉菌的分子檢測，線粒體編碼基因Cbzl、Cbz2和可能編碼儲存蛋白的Zpr基因分別作為橡樹疫霉iP.ramorum )和樟疫霉iP.cinnamomi )檢測的革巴標。本發明旨在尋找辣椒疫霉中新的分子檢測靶標。Yktep是一個細胞存活必須的R-SNARE蛋白，Ykt6在真核生物的進化上非常保守，將不同物種中的Ykt6氨基酸序列進行比對分析，結果表明，在系統進化上疫霉和植物及藻類在親緣關系上比真菌更近，這與疫霉的分類地位完全符合。由此我們將Ykt6作為一個新的分子檢測靶標，通過序列比對分析設計出了一對疫霉潛在的通用分子檢測引物，并在此基礎上設計了辣椒疫霉特異性的分子檢測引物。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于檢測疫霉菌的通用分子檢測引物、檢測辣椒疫霉的特異性分子檢測引物及其檢測試劑盒。本發明是通過以下技術方案實現的:
一種用于檢測辣椒疫霉的分子引物及 其檢測試劑盒，所述的檢測辣椒疫霉的特異性引物為:
上游(20bp) PcyktF: AGATGGTATGTCGCTATGAC 下游(20bp) PcyktR: ACATTTCGTAACGTCAACAT 所述的用于檢測疫霉菌的通用引物為:
上游(2lbp) PyktF:AGAGTTGCTGCGCCAGGATGG下游(2lbp) PyktR:GTCTTGGACAACACGGCGGTG所述的檢測試劑盒為:
檢測溶液 I 包括:25mmol Tris.Cl (PH 8.3)、125mmol KC1、3.75 mmol MgCl2'
0.25mmoldNTPs、疫霉屬的通用引物 PyktF/PyktR 各 I u mol、0.lmgBSA、Taq DNA 聚合酶50U，加入超純水制備成ImL檢測溶液。保存期限為I年。檢測溶液II 包括:25mmol Tris.Cl (PH 8.3)、125mmol KC1、3.75 mmol MgCl2'
0.25mmoldNTPs、疫霉屬的通用引物 PcyktF/PcyktR 各 liimol、0.1mgBSA> Taq DNA 聚合酶50U，加入超純水制備成ImL檢測溶液。保存期限為I年。所述的檢測試劑盒的使用方法為:
當直接使用辣椒疫霉特異性引物進行檢測時，提取待檢測物DNA，取5 y L溶液作為反應模板，取試劑盒II中的溶液IOii L,另取IOii L去離子水加入200 ii L反應小管中，混勻后PCR擴增，程序為94°C變性3分鐘，94°C變性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；32個循環，最后72 °C延伸5分鐘；
當使用套式PCR進行檢測時，提取待檢測物DNA，取5 ii L溶液作為反應模板，取試劑盒I中的溶液IOii L,另取IOii L去離子水加入200 ii L反應小管中，混勻后PCR擴增,程序為94°C變性3分鐘，94°C變性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；32個循環，最后72°C延伸5分鐘。將反應結束后的PCR產物用水稀釋5倍后取5 u L，取試劑盒II中的溶液10 u L，另取10 ii L去離子水加入200 u L反應小管中，混勻后PCR擴增，程序為94°C變性3分鐘，94°C變性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；32個循環，最后72°C延伸5分鐘；
擴增產物的電泳檢測:取IOuL PCR擴增產物，在1% (質量體積比)的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓為120V，20分鐘后在紫外光下檢測結果。如果存在分子量約為282bp的條帶，則證明所檢病原為辣椒疫霉。本發明的優點是:
本發明提供了疫霉菌的通用分子檢測引物及辣椒疫霉的特異性引物，以及含有該引物的試劑盒。本發明通過序列比對，找到了一個潛在的疫霉屬通用檢測引物，通過實驗驗證，該引物可在實驗提供的16個不同疫霉種擴增出一條約630bp (不同種間大小有差異)大小的條帶，為其它疫霉種的分子檢測提供了一個潛在的分子靶標。
本發明中所設計的一對辣椒疫霉檢測引物特異性高，在對14個不同疫霉種和12個其它真菌進行檢測時，只有辣椒疫霉能特異性的檢測出一條282bp的電泳條帶，且在辣椒疫霉菌株中的檢出率達到100%。可從發病植物組織及土壤中復雜的病原菌環境準確地檢測出辣椒疫霉。利用套式PCR方法，本發明最低可以檢測出Ifg DNA含量的樣品，即相當于可以檢測出一個游動孢子和一個卵孢子，檢測靈敏度高。


圖1.疫霉屬通用引物PyktF、PyktR PCR驗 證結果，1.卞豆疫霉iPhytophthoraso Jae) ^2.辣傲備霉{Phytophthora capsi ci )>3.惡備霉{Phytophthora cactorum)、
4.燒、他後霉{Phytophthora cryptogea )^.煙草疫霉從ora nicotianae、、
6.掠櫚疫霉 iPhytoph thora palmi vora )、7.瓜類疫霉 iPhytoph thora me I on is)、8.掘氏後霉 iPhytophthora drechsleri)、9.蒸枝疫霉 iPhytophthora Iitchii )、10.芒麻疫霉 iPhytoph thora boehmeriae )> 11.致病疫霉 iPhytoph thora infes tans )、12.苜猜疫^ (.Phytophthora medicagini5)> 13.墻疫霉(^Phytophthora cinnamomi)> 14.$(.Phytophthora parasi)> 15-18.腐霉屬(Phythium.spp)、19.禾谷鍵刀菌(/7W1Sari應graminearum)>20.尖抱鍵刀舊 QFusarium oxysporum)^21.稻痕病菌(Magnaportheoryzae)>22.辣椒炭疽病菌capsici)>23.油菜菌核病菌(5b7<9ro(i/ iasclerotiorum)>24.1Botrytis cinerea)。圖2.辣椒疫霉特異性引物(PcyktF、PcyktR)的驗證，1-4、分離自不同地區的辣椒疫霉菌株、5.大豆疫霉、6惡疫霉、7.隱地疫霉、8.煙草疫霉、9.棕櫚疫霉、10.瓜類疫霉、
11.掘氏疫霉、12.荔枝疫霉、13.苧麻疫霉、14.致病疫霉、15.苜蓿疫霉、16.樟疫霉、17.寄生疫霉、18-20.腐霉屬、19.禾谷鐮刀菌、20.尖孢鐮刀菌、21.稻瘟病菌、22.辣椒炭疽病菌、23.油菜菌核病菌。圖3.使用疫霉通用引物(PyktF、PyktR)和辣椒疫霉特異性引物(PcyktF、PcyktR)進行套式PCR擴增進行靈敏度驗證。對應的辣椒疫霉DNA濃度分別為lng、lOOpg、10pg、lpg、lOOfg、10fg、lfg、100ag、IOag
圖4.辣椒疫霉特異性引物(PcyktF、PcyktR)對土壤中卵孢子的PCR檢測，1.陽性對照，2-3，發病田塊土壤中卵孢子的分離結果。4，沒有發病的田塊土壤分離結果6.陰性對照圖5.辣椒疫霉特異性引物(PcyktF、PcyktR)對發病植株的PCR檢測，1.陽性對照，2-4.發病植株,5.健康植株,6.陰性對照
圖6.辣椒疫霉特異性引物(PcyktF、PcyktR)對污染河水中游動孢子的PCR檢測，1.陽性對照，2-3，污染河水中的檢測結果。4，沒有污染的水中檢測結果6.陰性對照。
具體實施例方式實施例1
(I)土壤中殘留辣椒疫霉卵孢子的檢測結果:
土壤中卵孢子的富集:取待檢土壤樣品20-100克，研碎，先后采用200目篩網去除較大土粒，然后經過400、500、800目篩網過濾，同時用3-10升水反復沖洗，從800目篩網上收集卵孢子，用Iml水懸浮。由于卵孢子不能透過800目篩網，這樣處理可以達到使卵孢子富集的效果。卵孢子DNA的提取:將用無菌水懸浮的卵孢子轉移到1.5 mL的離心管中，在12000r.min-1轉速下離心5分鐘，吸出上清液，留15 y L液體吸打混勻后吸入研缽中，液氮研磨后取粉末于小管中，CTAB法提取基因組，方法如下，加900 ii L 2% CTAB提取液和90 U I 10%SDS，漩渦混勻，于60°C水浴I h，中間每10 min上下顛倒幾次，12000 rpm離心10 min，取上清加等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，顛倒混勻，12000 rpm離心10 min ;將上清轉移至新管，加等體積氯仿，輕輕顛倒混勻，12000 rpm離心5 min。上清轉移至新管中,加等體積甲醇沉淀，12000 rpm離心10 min，傾去上清，沉淀用70%乙醇洗滌一次，室溫晾干。加適量滅菌超純水(含20 ug/ml RNase)，37°C處理I h后，用于后備實驗。PCR擴增及電泳檢測(圖4)，參見試劑盒使用指南。(2)辣椒感病植株的檢測結果:
發病植株DNA的提取:將有水浸狀病斑 的辣椒葉片或根莖部位用70%酒精消毒后，用液氮研磨后取少量粉末，采用CTAB法提取基因組(方法見上)。也可使用堿裂解法快速提取DNA，方法如下，取一段發病的植株組織，每毫克組織加入10 W 0.5 M NaOH，充分研磨后轉移至1.5 ml的EP管中，12000 rpm離心5 min，取上清用于后續PCR擴增實驗。PCR擴增及電泳檢測(圖5)，參見試劑盒使用指南。(3)辣椒疫霉污染水源中游動孢子的檢測結果:
游動孢子的富集及DNA提取:辣椒疫霉在有水膜的環境下能夠形成孢子囊并釋放大量游動孢子，是再侵染的重要途徑。取辣椒疫霉污染水源500mL，在5000g的離心力下離心20min,倒去上清液，沉淀的游動孢子用100 u L水懸浮，轉入1.5mL離心管，加入0.05g石英砂，渦旋震蕩10秒后，2000r.min-1離心5分鐘后取上清用于后續PCR擴增。
權利要求
1.一種用于檢測辣椒疫霉的引物及其檢測試劑盒，其特征在于所述的辣椒疫霉分子檢測引物為: 上游(20bp) PcyktF: AGATGGTATGTCGCTATGAC 下游(20bp) PcyktR: ACATTTCGTAACGTCAACAT, 所述的疫霉屬通用引物為:上游(2 lbp) PyktF:AGAGTTGCTGCGCCAGGATGG 下游(21bp) PyktR:GTCTTGGACAACACGGCGGTG 所述的檢測試劑盒為: 檢測溶液 I 包括:25mmol Tris.Cl (PH 8.3)、125mmol KC1、3.75 mmol MgCl2'`0.25mmoldNTPs、疫霉屬的通用引物 PyktF/PyktR 各 I u mol、0.lmgBSA、Taq DNA 聚合酶50U，加入超純水制備成ImL檢測溶液；保存期限為I年； 檢測溶液 II 包括:25mmol Tris.Cl (PH 8.3)、125mmol KC1、3.75 mmol MgCl2'`0.25mmoldNTPs、辣椒疫霉疫霉特異性引物 PcyktF/PcyktR 各 I y mol、0.1mgBSA, Taq DNA聚合酶50U，加入超純水制備成ImL檢測溶液；保存期限為I年； 所述的檢測試劑盒的使用方法為: 當直接使用辣椒疫霉特異性引物進行檢測時，提取待檢測物DNA，取5 y L溶液作為反應模板，取試劑盒II中的溶液IOii L,另取IOii L去離子水加入200 ii L反應小管中，混勻后PCR擴增，程序為94°C變性3分鐘，94°C變性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；32個循環，最后72 °C延伸5分鐘；` 當使用套式PCR進行檢測時，提取待檢測物DNA，取5 ii L溶液作為反應模板，取試劑盒I中的溶液IOii L,另取IOii L去離子水加入200 ii L反應小管中，混勻后PCR擴增,程序為94°C變性3分鐘，94°C變性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；32個循環，最后72°C延伸5分鐘；將反應結束后的PCR產物用水稀釋5倍后取5 u L，取試劑盒II中的溶液10 u L，另取10 ii L去離子水加入200 u L反應小管中，混勻后PCR擴增，程序為94°C變性3分鐘，94°C變性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；32個循環，最后72°C延伸5分鐘； 擴增產物的電泳檢測:取IOuL PCR擴增產物，在1% (質量體積比)的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓為120V，20分鐘后在紫外光下檢測結果；如果存在分子量約為282bp的條帶，則證明所檢病原為辣椒疫霉。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測辣椒疫霉的引物及其檢測試劑盒，其特征在于辣椒疫霉特異性檢測引物為上游(20bp) PcyktF: AGATGGTATGTCGCTATGAC、下游(20bp) PcyktR: ACATTTCGTAACGTCAACAT，疫霉菌通用引物為上游(21bp)PyktFAGAGTTGCTGCGCCAGGATGG、下游(21bp)PyktRGTCTTGGACAACACGGCGGTG。本發明找到了一個潛在的疫霉屬通用檢測引物，通過實驗驗證，該引物可在實驗提供的14個不同疫霉種擴增出一條約630bp(不同種間大小有差異)大小的條帶，為其它疫霉種的分子檢測提供了一個潛在的分子靶標。
文檔編號C12N15/11GK103103255SQ20121047250
公開日2013年5月15日 申請日期2012年11月21日 優先權日2012年11月21日
發明者戚仁德, 趙偉, 汪濤 申請人:安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所