專利名稱：狼山雞pou1f1基因單核苷酸多態性位點及其檢測方法
技術領域：
本發明屬于分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及狼山雞POUlFl基因第3109酸多態性位點及其檢測方法。
背景技術：
基因多態性是指不同物種或同一物種內不同個體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，它包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數的變化。單核苷酸多態性(SNP)指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起。具有轉換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發生突變的位點，其 中大多數是甲基化的，可自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。根據對遺傳性狀的影響，基因多態性又可分為兩種一種是同義突變多態性，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同；另一種是非同義突變多態性，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而產生蛋白質序列的改變，可能最終影響到蛋白質的功能。因此，對編碼區SNPs的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響；尤其對于無義密碼子突變來說，更可能會導致所編碼的蛋白發生重大變化，從而影響它的功能發揮，對個體的表現型產生重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。近年來，人們發展了許多用于探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多態技術(SSCP)、PCR-RFLP和直接測序技術等。SSCP可以發現靶DNA片段中未知位置的堿基突變。Takao經實驗證明小于300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被SSCP發現，他認為現在知道的所有單堿基改變絕大多數可用該方法檢測出來。另外，SSCP方法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。該方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器。垂體特異性轉錄因子(Pituitaryspecific transcription factor I, POUlFl,原稱pit-1)，由Pit-I基因編碼，是家禽垂體前葉特異表達的一種具有重要功能的DNA結合蛋白，參與調節機體的細胞生長與發育。POUlFl與垂體中PRL基因、GH基因、TSHP基因以及Pit-I自身的啟動子結合，調控這些基因的轉錄，通過調節這些基因的表達而對家禽的生長、發育、繁殖和免疫等很多方面起著重要的作用。POUlFl基因被認為是神經內分泌生長軸的重要成員，對動物的生長發育發揮著重要調節作用。POUlFl基因已被當作重要候選基因在畜禽中開展了大量研究，目前已被證明與豬、牛、山羊、等眾多畜禽的生長發育、屠宰性狀及肉質性狀顯著相關。狼山雞作為我國古老的優良地方品種，是著名蛋肉兼用型雞種之一。目前，狼山雞的開發利用處于最佳發展時期。但是迄今為止，在狼山雞上關于POUlFl基因的遺傳特征以及基因多態性與狼山雞的生長性狀之間的相關性尚未有報道，基于已有的研究成果，將進一步探討POUlFl基因的功能。

發明內容
本發明解決的問題在于利用PCR產物混合測序的方法篩查狼山雞POUlFl基因的多態性位點，提供了一種狼山雞POUlFl基因多態性的篩查和檢測方法。通過關聯分析尋找與狼山雞生長性狀相關的SNP作為分子標記，以功能SNP作為狼山雞分子育種和輔助選擇的標記，加快良種選育速度和提聞種群品質。本發明是通過以下技術方案來實現本發明根據POUlFl基因的外顯子設計引物，以狼山雞的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，對PCR產物混合并純化，測序后得到在狼山雞POUlFl基因(GenBank登錄號為NC_006088)的第3109位為G或A的堿基多態性位點的部分序列。 狼山雞POUlFl基因的單核苷酸多態性位點，其中，所述基因單核苷酸多態性位點包括在狼山雞POUlFl基因的第3109位為G或A的堿基多態性位點。上述技術方案中所述的狼山雞POUlFl基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其中，包括以下步驟(I)、以包含POUlFl基因的待測狼山雞全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增狼山雞POUlFl基因；所述的引物對P為上游引物5’TTTCTTTTGGTTTTGTTCAG3’下游引物5’TTTTCAGCCTTTTGTTGG3’ ；(2)、對步驟(I)的PCR擴增產物進行切膠回收及純化、測序；(3)、對步驟(2)的純化產物進行PCR-SSCP檢測用變性劑對PCR擴增產物進行變性處理，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定狼山雞POUlFl基因的多態性位點。上述技術方案中所述的檢測方法，其中，所述的PCR擴增的反應程序為95°C預變性 4min ;94°C變性 50s，59°C退火 50s，72。。延伸 lmin，33 個循環，最后 72°C延伸 10min,4°C保存。上述技術方案中所述的檢測方法，其中，步驟(2)中用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行切膠回收及純化、測序；優選的所用瓊脂糖凝膠的質量濃度為I. 5%。上述技術方案中所述的檢測方法，其中，步驟(3)中聚丙烯酰胺凝膠的質量濃度為 10% O上述技術方案中所述的檢測方法，其中，步驟(3)中根據10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定狼山雞POUlFl基因的多態性位點，所述位點包括所述多態性位點包括在狼山雞POUlFl基因的第3109位為G或A的堿基多態性位點，表現為CC，CD，DD三種基因型。本發明利用PCR-SSCP方法對狼山雞POUlFl基因第3外顯子3109位點上的錯義突變可能產生編碼蛋白構象發生變化的單核苷酸多態性進行檢測。本發明對狼山雞上述SNP進行了基因分型和基因頻率分析，同時也對SSCP多態位點與狼山雞生長性狀之間進行了關聯分析。與現有技術相比，本發明把PCR產物混合測序篩查SNP與PCR-SSCP結合起來解決了 SSCP的不穩定性，以防突變位點的漏檢，提供了一種用簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應用的在DNA水平上篩查和檢測與狼山雞生長性狀密切相關的遺傳標記，可用于狼山雞的輔助選擇和分子育種。


I、圖I是本發明的技術流程示意圖；2、圖2是本發明中PCR產物混合測序篩查到的狼山雞POUlFl基因序列3109位G-A突變測序結果圖；3、圖3為本發明用來檢測PCR產物片段大小的I. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖； 4、圖4為本發明用來檢測各樣本突變情況的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
具體實施例方式為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明。本發明首先根據POUlFl基因的保守序列設計引物，以狼山雞的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，混合PCR產物并對其純化，測序。然后，進行測序圖分析和序列比對篩查出SNP位點；其次，對待測群體進行多態位點的PCR-SSCP檢測；最后，根據在群體中檢測到的基因型，進行群體遺傳統計分析和生長性狀的關聯分析，篩選出與狼山雞生長性狀密切相關的分子標記。下面對本發明做詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。實施例一一、狼山雞POUlFl基因部分DNA序列的擴增與測序I、血樣的采集及處理取血樣10mL，加入O. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80°C保存備用。本研究所用狼山雞血樣總數300份，具體血樣采自江蘇省南通市狼山雞原種場。2、血樣基因組DNA的提取(I)、將冷凍血樣室溫解凍，取30 μ L抗凝全血置于I. 5mL離心管，加入500 μ LIXSTE緩沖液、15 μ L 20% SDSUOy L O. Olmg/μ L蛋白酶K，55°C水浴鍋中消化過夜。(2)、取出樣本，加入500 μ L飽和苯酚，輕搖20min，12000r/min離心IOmin ；(3)、取上清,再次加入500 μ L飽和苯酹,輕搖20min, 12000r/min離心IOmin ；(4)、取上清,加入500 μ L氯仿-異戍醇(24 : I),輕搖20min, 12000r/min離心IOmin ；(5)、取上清，加入ImL冰無水乙醇(_20°C )，來回顛倒沉淀DNA，10000r/min離心IOmin后倒出乙醇；(6)、用ImL 70%乙醇清洗DNA，10000r/min離心5min倒掉乙醇；重復一次，置通風櫥干燥2-4h至水分揮發干；
(7)、待DNA完全干燥后加入200 μ L滅菌后的TE溶液，4°C冰箱溶解DNA 3d ；(8)、I %瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，-20°C或_70°C長期保存DNA備用。3、擴增引物設計根據NCBI數據庫中(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)Gallus galIus 的GenBank登錄號為NC_006088的POUlFl基因的外顯子3DNA序列，以該基因序列保守區序列為參考，利用Primer 5. O設計PCR引物對，其引物對序列如下上游引物TTTCTTTTGGTTTTGTTCAG；
下游引物TTTTCAGCCTTTTGTTGG；該引物擴增了狼山雞POUlFl基因第3外顯子區域及一部分內含子區域。4、PCR擴增POUlFl基因外顯子3 :分別以包含POUlFl基因的待測狼山雞全基因組DNA為模板，用上述設計的引物對進行PCR擴增，PCR總反應體系為15 μ L，見表I ;PCR總反應程序，見表2。表I本發明的PCR反應體系
體系成分體積UL)
PCR緩沖液I. 50
dNTP(2 mmol/L)O. 30
上游引物(lOpmol/pL)O. 30
下游引物(IOpmol^L)O. 30
Taq DNA 聚合酶(2.5 U/jxL)O. 30
DNA 模板(50 ng^iL)I. 00
滅菌超純水(H2O)11.30
總體積15.00表2PCR反應程序
_克隆測序PCR程序_循環次數
94°C預變性4 min
94 °C 變性50s59 變性50 s> 33個循環
72 ’C延伸Imin
72 11C 延伸 10 min _4 O保存_5、PCR產物純化和測序PCR擴增完成之后進行瓊脂糖凝膠電泳，所用的瓊脂糖凝膠的質量濃度為I. 5%,然后進行PCR產物的切膠回收及純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入I. 5mL離心管中，然后用PCR產物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟如下(1)、首先向吸附柱中加入50(^1^平衡液此，120001'/11^11離心11^11，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(2)、將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。(3)、向膠塊中加入等體積溶液PC，60°C水浴放置IOmin左右，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。(4)、將上一步所得溶液加入一個吸附柱中，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中
的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(5)、向吸附柱中加入700 μ L漂洗液，12000r/min離心lmin，倒掉廢液，將吸附柱
重新放入收集管中。(6)、向吸附柱中加入500 μ L漂洗液，12000r/min離心lmin，倒掉廢液，將離心吸附柱放入收集管中，12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50°C溫箱數分鐘，徹底晾干。(7)、將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液，室溫放置2min。12000r/min離心lmin收集DNA溶液。(8)、為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復步驟7。把以上PCR擴增產物混合送南京金斯瑞生物工程有限公司進行正向測序。對測序峰圖進行分析，其中在同一位點有不同峰的是發生了單核苷酸突變；如圖2中的GA雙峰位于在狼山雞POUlFl基因第3109位。二、狼山雞POUlFl基因多態性的PCR-SSCP檢測I、PCR反應條件PCR產物擴增體系和反應條件分別如前面表I和表2所述，PCR擴增產物的I. 5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖3所示，可以清晰的看到303bp的條帶，其中圖3中M :DNA分子量標準為 DL2000(2000bp, 1250bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 375bp, 250bp, 125bp)，由 M 向后的 8個泳道表示不同狼山雞個體DNA的PCR產物。2、PCR-SSCP 檢測對于PCR擴增后的產物首先分別用變性劑(如甲酰胺，O. 5mol/L EDTA(pH 8.0)，甘油，O. 025%二甲苯青，O. 025%溴酚藍等)進行變性處理，然后根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果判定其多態性。130V電壓電泳15h，銀染檢測電泳結果，用Bio-RAD凝膠成像分析系統照相分析，
并判型、記錄其基因型。由于雞為二倍體動物，當發生突變時，可形成三種不同的基因型(CC，CD，DD)，可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳圖來進行判別，如圖4所示，將三種基因型區分開，根據條帶的個數能夠判定是否發生了點突變，將三種基因型區分開，從而檢測其SNP多態性。其中，CC型表現為上一條帶；DD型表現為下一條帶；雜合子CD型表現為上下結合的兩條帶。三、本發明制備的分子標記在狼山雞群體多態性中的診斷應用I、群體多態性中的診斷利用上述的SNP多態性檢測方法對狼山雞300份DNA樣品的基因型分別進行丙烯酰胺凝膠電泳。
2、SNP位點的頻率統計分析基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數占總個體數的比率。Pcc = Nrc/N，其中P。。代表某一位點的CC基因型頻率；N。。表示群體中具有CC基因型的個體數；N為檢測群體的總數量。基因頻率是指一個群體中某一基因數對其等位基因總數的相對比率。計算的公式
可以寫成PC = (2NCG+NCal+NCa2+……+Ncan)/2N。式中，P。表示等位基因C頻率，Ncc表示群體中具有CC基因型的個體數量，Ncai表示群體中具有Cai基因型個體數量，al-an為等位基因C的η個不同的復等位基因。統計結果見表3。表3狼山雞POUlFl基因多態位點的基因型和等位基因頻率
權利要求
1.狼山雞POUlFl基因的單核苷酸多態性位點，其特征在于所述基因單核苷酸多態性位點包括 在狼山雞POUlFl基因的第3109位為G或A的堿基多態性位點。
2.權利要求I所述的狼山雞POUlFl基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、以包含POUIFI基因的待測狼山雞全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增狼山雞POUlFl基因； 所述的引物對P為 上游引物5’ TTTCTTTTGGTTTTGTTCAG3 下游引物5’ nTTCAGCCITTTGITGG3’ ； (2)、對步驟(I)的PCR擴增產物進行切膠回收及純化、測序； (3)、對步驟(2)的純化產物進行PCR-SSCP檢測用變性劑對PCR擴增產物進行變性處理，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定狼山雞POUlFl基因的多態性位點。
3.如權利要求2所述的狼山雞POUlFI基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于所述的PCR擴增的反應程序為95°C預變性4min ;94°C變性50s，59°C退火50s，72°C延伸lmin，33個循環，最后72°C延伸10min，4°C保存。
4.根據權利要求2所述的狼山雞POUlFl基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于步驟⑵中用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行切膠回收及純化、測序。
5.根據權利要求4所述的狼山雞POUlFl基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于步驟(2)中瓊脂糖凝膠電泳中所用瓊脂糖凝膠的質量濃度為I. 5%。
6.根據權利要求2所述的狼山雞POUlFl基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于步驟(3)中聚丙烯酰胺凝膠的質量濃度為10%。
7.如權利要求2所述的狼山雞POUlFl基因的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于步驟(3)中根據10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定狼山雞POUlFl基因的多態性位點，所述多態性位點包括在狼山雞POUlFl基因的第3109位為G或A的堿基多態性位點，表現為CC，⑶，DD三種基因型。
全文摘要
本發明公開了一種檢測狼山雞基因單核苷酸多態性的方法，以包含POU1F1基因的待測狼山雞全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增POU1F1基因；然后進行進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定狼山雞POU1F1基因第3109位的單核苷酸多態性。本發明把PCR產物混合測序篩查SNP與PCR-SSCP結合起來解決了SSCP的不穩定性，以防突變位點的漏檢，提供了一種用簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應用的在DNA水平上篩查和檢測與狼山雞生長性狀密切相關的遺傳標記，可用于狼山雞的輔助選擇和分子育種。
文檔編號C12Q1/68GK102649957SQ20121011496
公開日2012年8月29日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者嚴林俊, 劉垚, 張春雷, 房興堂, 陳宏 申請人:江蘇師范大學