專利名稱：黃牛wnt10b基因的單核苷酸多態性位點及其檢測方法
技術領域：
本發明屬于分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測黃牛WNTlOB基因內含子I及外顯子2、4、5的單核苷酸多態性的檢測方法。
背景技術：
單核苷酸多態性(SNP)就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性。因此，通常所說的SNPs包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數的變化。一個SNP表示在基因組某個位點上有一個核苷酸的變化，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起；具有轉換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發生突變的位點，其中大多數是甲基化的，可自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。
在任何已知或未知的基因內或附近都可能找到數量不等的SNPs，根據它們在基因組中分布的位置可分為基因編碼區SNPs(cSNPs)、基因周邊SNPs(pSNPs)和基因間SNPs(iSNPs)等三類。總的說來，cSNP比較少，因為在外顯子內的變異率僅占周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關注。根據對遺傳性狀的影響，cSNPs又可分為兩種一種是同義cSNPs，即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質中氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的“含義”相同；另一種是非同義cSNPs，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而產生蛋白質序列的改變，可能最終影響到蛋白質的功能。因此，對編碼區SNPs的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響；尤其對于無義密碼子突變來說，更可能會導致所編碼的蛋白發生重大變化，從而影響它的功能發揮，對個體的表現型產生重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。由于SNPs是二等位基因分子標記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個、3個或4個等位基因構成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標記。目前，主要采用幾種不同的路線來發現SNPs :即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應等。在這些SNP檢測技術中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術人員和經驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用于生產實際的理想SNP檢測方法；當然，利用PCR-SSCP與DNA測序結合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應技術檢測SNP位點，需要平板讀數儀、基因芯片、微球陣列技術和質譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。
RFLP-PCR方法是一種檢測SNP的有效技術，在發現SNP位點后引入限制性內切酶進行切割，然后進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。脂肪組織不僅是重要的能量貯庫和賦形組織，還是保持內環境穩定的重要內分泌器官。動物體內存在棕色和白色兩種脂肪。白色脂肪堆積在皮下，負責儲存多余熱量；棕色脂肪負責分解引發肥胖的白色脂肪，將后者消耗，加快新陳代謝。WNTlOB(wingless-type MMTV integration site family, member IOB, WNTIOB)是fct蛋白家族19個成員之一，該蛋白家族主要負責調節胚胎發生的復雜過程，其中也包括脂肪組織的形成。WNTlOB能夠抑制脂肪沉積包括白色脂肪組織發育以及棕色脂肪生成。

發明內容
本發明解決的問題在于利用PCR-RFLP方法檢測黃牛WNTlOB基因的多態性，并將其與生長性狀進行關聯分析，驗證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標記，從而加快良種選育速度。本發明是通過以下技術方案來實現黃牛WNTlOB基因單核苷酸多態性位點，其中，該基因單核苷酸多態性包括黃牛WNTlOB基因第220位點為A或G的單核苷酸多態性位點；和第3980位點為G或T的單核苷酸多態性位點。黃牛WNTlOB基因單核苷酸多態性位點的檢測方法，其中，包括以下步驟(I)、以包含WNTlOB基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對Pl為引物，PCR擴增黃牛WNTlOB基因獲得第一擴增產物，并用限制性內切酶NaeI酶切第一擴增產物；(2)、以引物對P3為引物，PCR擴增黃牛WNTlOB基因獲得第三擴增產物，并用限制性內切酶ApaI酶切第四擴增產物；(3)、分別對步驟(I)和(2)酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定黃牛WNTlOB基因第220和3980位的單核苷酸多態性；所述的引物對Pl為上游引物Fl ggggaaactg aggcaaagag a ；下游引物Rl agcgggcaag cacagaact ；所述的引物對P3為上游引物 F3 :tcagacctac ccctatccac ac ；下游引物 R3 :aaacgccagg aagacccag。
上述技術方案所述的黃牛WNTlOB基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其中，步驟(I)中的PCR擴增反應程序為95°C預變性5min ;94°C變性458，66.01退火458，721延伸45s, 30 35個循環；72°C延伸IOmin ；步驟⑵中PCR擴增反應程序為95°C預變性5min ;94°C變性45s，65. 5°C退火45s, 72°C延伸 45s, 30 35 個循環；72°C延伸 IOmin0上述技術方案所述的黃牛WNTlOB基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其中，所述的瓊脂糖凝膠電泳所采用的瓊脂糖凝膠的質量濃度為2. 5%。
上述技術方案所述的黃牛WNTlOB基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其中，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定黃牛WNTlOB基因的單核苷酸多態性為第220位點為A或G的單核苷酸多態性，表現為AA、AG、GC三種基因型；和第3980位點為G或T的單核苷酸多態性，表現為GG、GT、TT三種基因型。具體的第220位的多態性為AA基因型表現為355bp條帶，AG基因型表現為355、235和120bp條帶，GG基因型表現為235和120bp條帶；第3980位的多態性為GG基因型表現為244和208bp條帶，GT基因型表現為452、244和208bp條帶，TT基因型表現為452bp條帶。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果
本發明公開了與黃牛生長性狀相關的功能基因WNTlOB的第202、1617、3980、4711位的單核苷酸多態性，并且針對上述位點的SNP多態性，本發明還公開了其檢測方法，通過設計特定的PCR引物擴增片段，能夠用RFLP方法簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態性。本發明對WNTlOB基因的SNP進行了基因分型和基因頻率分析，以及與三品種成年牛的生長性狀之間進行了性狀關聯分析；結果表明在第220位點、第3980位點的郟縣紅牛和魯西牛的突變純合個體有較大的體尺性狀，且差異極顯著；而其他兩個位點的多態性與性狀關聯不大。這表明WNTlOB基因的第220位和3980位檢測SNP位點可用作黃牛生長性狀選擇的分子標記優選該位點的純合個體進行育種。本發明提供的檢測方法為WNTlOB基因的SNP與黃牛的生長性狀關系的建立奠定了基礎，以便用于中國黃牛用生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。


圖I黃牛WNTlOB基因Pl檢測SNP位點擴增電泳圖；圖2黃牛WNTlOB基因Pl檢測SNP位點酶切結果電泳圖；圖3黃牛WNTlOB基因Pl檢測SNP的不同基因型測序圖；圖4黃牛WNTlOB基因P2檢測SNP位點擴增電泳圖；圖5黃牛WNTlOB基因P2檢測SNP位點酶切結果電泳圖；圖6黃牛WNTlOB基因P2檢測SNP位點不同基因型測序圖； 圖7黃牛WNTlOB基因P3檢測SNP位點擴增電泳圖；圖8黃牛WNTlOB基因P3檢測SNP位點酶切結果電泳圖；圖9黃牛WNTlOB基因P3檢測SNP位點不同基因型測序圖。圖10黃牛WNTlOB基因P4檢測SNP位點擴增電泳圖；圖11黃牛WNTlOB基因P4檢測SNP位點酶切結果電泳圖；圖12黃牛WNTlOB基因P4檢測SNP位點不同基因型測序圖。
具體實施例方式為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
以下通過對黃牛樣本采集及基因組DNA提取、檢測、純化與濃度分析、黃牛WNTlOB基因第I內含子及第2、4、5外顯子的PCR擴增、黃牛WNTlOB基因第I內含子及第2、4、5外顯子的PCR-RFLP分析實施例來進一步說明本發明技術及其效果。所述是對本發明的解釋而不是限定。一、黃牛WNTlOB基 因部分DNA序列的擴增及其多態性的檢測I、黃牛血樣的采集及處理取黃牛血樣10mL，加入O. 5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，_80°C保存備用。本發明采用了 3個黃牛品種共計435個無血緣關系的母牛血樣，具體為(I)、魯西牛血樣分別從60頭純種魯西成年牛采集，采自山東省魯西黃牛原種場；(2)、秦川牛血樣分別從115頭的純種秦川成年牛采集，采自陜西大荔縣；(3)、郟縣紅牛血樣分別從260頭的郟縣成年紅牛采集，采自河南省郟縣；2、血樣基因組DNA的提取、純化(I)、將冷凍血樣室溫解凍，轉移500 μ L至I. 5mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩沖液，充分混勻，12000r/min離心IOmin (4°C ),棄去上清液,重復上述步驟至上清液透明、
沉淀呈淡黃色。(2)、在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 μ L，搖動，使血細胞沉淀脫離離心管管壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提緩沖液的配制0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS加超純水500mL，滅菌，調pH至8. 0，4°C保存備用。(3)、加蛋白酶K 3yL(20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加I μ L蛋白酶K混勻繼續消化至澄清。(4)、將反應液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動離心管20min，使其充分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉入另一 I. 5mL離心管中，重復一次。(5)、加氯仿500 μ L,充分混勻20min, 4°C, 12000r/min離心IOmin,將上清液轉入另一 I. 5mL離心管中。(6)、加O. I倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉動離心管直至白色的絮狀沉淀析出，_20°C保存30 60min。(7)、4°C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。(8)、4°C, 12000r/min離心lOmin,棄去上清液,室溫下使乙醇揮發干凈。(9)、干燥后的DNA溶于80 100 μ L的TE-緩沖液或超純水，4°C保存直至DNA完全溶解，I %瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，-80°C保存。(10) ,500 μ L的DNA溶液中加入10% SDS使其終濃度為O. I %，加入蛋白酶K至終濃度達到50 μ g/mL。(11)、5°C保溫 IOh 左右。(12)、等體積苯酚、氯仿、異戊醇(25 24 I)和氯仿分別抽提一次。(13)、12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中。(14)、加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉淀DNA。
(15)、倒掉液體，70%乙醇洗滌后晾干，加入60 μ L滅菌超純水溶解，4°C待檢測。3、DNA池的構建(1),1%瓊脂糖凝膠電泳檢測選部分DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇DNA樣品條帶均一、無拖尾、無降解的樣品進行DNA池的構建。(2)、OD 值測定用紫外光光度計測定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值，并計算DNA含量和OD26tl/ OD280的比值。如0D26(i/0D28(i比值小于I. 6，說明樣品中含有較多的蛋白質或酚，則應進行純化；若比值大于I. 8，則應該考慮去除RNA純化。DNA 濃度(μ g/mL) = 50 X OD260 值 X 稀釋倍數(3)、品種DNA池的構建DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μ L，然后從秦川牛品種100個個體、濃度為50ng/ μ L DNA的樣品中取10 μ L混合構建成品種DNA池；按照同樣的方法也構建魯西牛和郟縣紅牛DNA池。4、PCR擴增引物設計根據GenBank公開的牛基因組序列為參考，具體根據No. NC_007303序列設計引物擴增WNTlOB基因的第I內含子及第2、4、5外顯子的序列，擴增第I內含子、第2、4、5外顯子所對應的引物對序列P1、P2、P3和P4如下所述的引物對Pl為上游引物FI : GGGGAAACTGAGGCAAAGAGA ；下游引物Rl :AGCGGGCAAGCACAGAACT ；所述的引物對P2為上游引物F2 TGGCGTAAGTCCCAGTTTCTA ；下游引物R2 CTCTAACCCAGGGCTTTCTCT ；所述的引物對P3為上游引物F3 TCAGACCTACCCCTATCCACAC ；下游引物R3 :AAACGCCAGGAAGACCCAG。所述的引物對P4為上游引物F4 ACCTCTGTGCTCTGTCCATTTG下游引物R4 GCTGGTGGCTCGTCTTGTT該4對引物能夠擴增WNTlOB基因第I內含子及第2、4、5外顯子的基因片段。并且已經過DNA池測序證明，所設計的4對引物擴增區域含有第220、1617、3980、4711位的單核苷酸多態性(見圖3、6、9、12)。5、PCR克降黃牛WNTlOB基因分別以3個黃牛品種的DNA池為模版，以引物對PU P2、P3和P4為引物進行PCR擴增，PCR總反應體系為15 μ L，見表I ;PCR總反應程序，見表2，其中表2中的X°C表示不同的引物對所使用的退火溫度不同，Pl為66. 0°C，P2為62. 1°C，P3為65. 5°C，P4為64. 9V ；表I PCR反應體系
權利要求
1.黃牛WNTlOB基因單核苷酸多態性位點，其特征在于，該基因單核苷酸多態性包括 黃牛WNTlOB基因第220位點為A或G的單核苷酸多態性位點；和 第3980位點為G或T的單核苷酸多態性位點。
2.黃牛WNTlOB基因單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、以包含WNTlOB基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對Pl為引物，PCR擴增黃牛WNTlOB基因獲得第一擴增產物，并用限制性內切酶NaeI酶切第一擴增產物； (2)、以引物對P3為引物，PCR擴增黃牛WNTlOB基因獲得第三擴增產物，并用限制性內切酶ApaI酶切第三擴增產物； (3)、分別對步驟⑴和⑵酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定黃牛WNTlOB基因第220和3980位的單核苷酸多態性； 所述的引物對Pl為上游引物 Fl ggggaaactg aggcaaagag a ； 下游引物Rl agcgggcaag cacagaact ； 所述的引物對P3為上游弓I物 F3 tcagacctac ccctatccacac ； 下游引物 R3 aaacgccagg aagacccag。
3.如權利要求2所述的黃牛WNTlOB基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于，步驟(I)中的PCR擴增反應程序為95°C預變性5min ;94°C變性45s，66. (TC退火45s，72°C延伸45s，30 35個循環；72°C延伸IOmin ； 步驟(2)中PCR擴增反應程序為95°C預變性5min;94°C變性45s，65. 5°C退火45s，72°C延伸45s, 30 35個循環；72°C延伸IOmin0
4.如權利要求2所述的黃牛WNTIOB基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠電泳所采用的瓊脂糖凝膠的質量濃度為2. 5%。
5.如權利要求2所述的黃牛WNTIOB基因的單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特征在于，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定黃牛WNTlOB基因的單核苷酸多態性為 第220位點為A或G的單核苷酸多態性，表現為AA、AG、GC三種基因型；和 第3980位點為G或T的單核苷酸多態性，表現為GG、GT、TT三種基因型。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測黃牛WNT10B基因單核苷酸多態性的方法，以包含WNT10B基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P3為引物，PCR擴增黃牛WNT10B基因，用限制性內切酶NaeI、ApaI分別消化用引物對P1、P3擴增后的PCR產物，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定黃牛WNT10B基因第220、3980位的單核苷酸多態性。本發明的方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與黃牛生長發育性狀密切相關的分子遺傳標記，以用于黃牛的輔助選擇和分子育種，加快黃牛良種繁育速度。
文檔編號C12N15/12GK102649962SQ20121011496
公開日2012年8月29日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者張春雷, 房興堂, 趙靜, 陳宏 申請人:江蘇師范大學