一種檢測肉牛ucp3基因單核苷酸多態(tài)性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了牛UCP3基因單核苷酸多態(tài)性位點及其檢測方法，以包含UCP3基因的待測牛全基因組DNA為模版，以引物對P1為引物，PCR擴增牛UCP3基因，然后進行SSCP多態(tài)性檢測。其基因多態(tài)性位點包括：在牛的UCP3基因第5191位為A或G的堿基多態(tài)性。本發(fā)明把PCR產(chǎn)物混合測序篩查SNP與PCR-SSCP結(jié)合起來解決了SSCP的不穩(wěn)定性，以防突變位點的漏檢，提供了一種簡單、快速、低成本、精確度高的，便于推廣應(yīng)用的在DNA水平上篩查和檢測與牛肉質(zhì)性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，可用于牛的輔助選擇和分子育種。
【專利說明】—種檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態(tài)性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一種檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，
以牛的肉用性狀基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為分子遺傳標(biāo)記，特別涉及牛的UCP3(解偶聯(lián)蛋白3)基因的單核苷酸多態(tài)性位點及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們對于牛肉的數(shù)量和品質(zhì)要求日益提高。雖然我國已成為第三大養(yǎng)牛與牛肉生產(chǎn)國，但是高檔大部分依賴于進口。因此提高肉用性能勢在必行，途徑主要有改善飼料營養(yǎng)，加強飼養(yǎng)管理水平和培育優(yōu)良品種等，而良種是肉牛業(yè)發(fā)展的先決條件和物質(zhì)基礎(chǔ)。人們在了解肉用性狀的遺傳規(guī)律和相應(yīng)的生長發(fā)育、脂肪沉積等生命活動調(diào)控規(guī)律的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子生物學(xué)方面的研究，發(fā)現(xiàn)了與肉用性狀有密切聯(lián)系的功能基因和主效基因以及和這些基因連鎖的分子遺傳標(biāo)記，根據(jù)目標(biāo)性狀與候選基因基因型間的關(guān)聯(lián)性進行選擇，提高了育種方向的準(zhǔn)確性，縮短了育種年限。
[0003]單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP),主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換(transit1n)或顛換(transvers1n)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種:一種是同義cSNP (synonymous cSNP),即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP (non-synonymous cSNP),指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能。這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。這些SNPs作為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。
[0004]分子生物學(xué)的發(fā)展為分子標(biāo)記輔助選擇提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，通過檢測功能基因某位點的多態(tài)性，對不同基因型個體與其生產(chǎn)性能進行關(guān)聯(lián)分析，找出優(yōu)勢基因型和優(yōu)勢等位基因，為選種提供依據(jù)，這一過程中檢測多態(tài)性和基因分型的準(zhǔn)確是很關(guān)鍵的。目前主要的方法有PCR-RFLP技術(shù)或PCR-SSCP技術(shù)結(jié)合DNA測序。
[0005]UCP3基因編碼解偶聯(lián)蛋白3 (uncoupling protein 3, UCP3),該蛋白是解偶聯(lián)蛋白超家族成員之一，最早是1997年Boss在人類骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的。解偶聯(lián)蛋白鑲嵌在線粒體內(nèi)膜上，是哺乳動物線粒體的質(zhì)子載體，在氧化磷酸化解偶聯(lián)、抗氧化和能量代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在豬的分子育種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，豬UCP3基因?qū)θ赵鲋亍⒅境练e、飼料轉(zhuǎn)化率和小豬初生重有重要影響。牛UCP3基因定位于牛15號常染色體。Sherman等(2008)發(fā)現(xiàn)牛UCP3基因內(nèi)含子3 —個A/G多態(tài)與歐洲牛與大不列顛雜交牛的平均日增重和局部生長效率顯著相關(guān)。Li等(2010)發(fā)現(xiàn)南陽牛、魯西牛、延邊牛中UCP3基因BglI酶切多態(tài)等位基因A比等位基因B頻率更高。關(guān)聯(lián)分析顯示魯西牛中AA型比AB型β_球蛋白含量更優(yōu)。結(jié)果還顯示UCP3基因BglI酶切多態(tài)與南陽牛的生長性狀顯著相關(guān)，AB基因型個體優(yōu)于其他個體，表明這一多態(tài)位點與牛的生長性狀相關(guān)。Brennan等(2009)發(fā)現(xiàn)UCP3基因的mRNA水平表達量的提高與脂肪酸β -氧化和牛體重?fù)p失產(chǎn)生的脂肪酸副產(chǎn)物有關(guān)。本發(fā)明提供的檢測方法為UCP3基因SNP與肉質(zhì)性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于肉牛肉質(zhì)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的肉牛種群。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種牛UCP3基因SNP的篩查和檢測方法，利用PCR產(chǎn)物混合測序的方法篩查牛UCP3基因的多態(tài)性位點。通過關(guān)聯(lián)分析尋找與牛肉質(zhì)性狀相關(guān)的SNP作為分子標(biāo)記，以功能SNP作為牛分子育種和輔助選擇的標(biāo)記，加快良種選育速度和提聞種群品質(zhì)。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
本發(fā)明根據(jù)UCP3基因的外顯子設(shè)計引物，分別以8種牛品種的基因組DNA為模版，進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物混合并純化，測序后得到牛UCP3的部分序列。
[0008]一種用于檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態(tài)性的引物，所述的引物對Pl為:
正向引物 5’-TCGGACCGTGAGTGCTGA-3’ ；
反向引物 5’ -ATGCTGGAGTCTGGAGAGGAG-3’。
[0009]一種檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，包括以下步驟: (1)以包含UCP3基因的待測牛基因組DNA為模版，以引物對Pl為引物，PCR擴增牛UCP3基因;
(2)對步驟⑴的擴增產(chǎn)物進行PCR目的片段檢測；
⑶對步驟⑵的目的片段進行PCR-SSCP檢測:首先對目的片段分別用變性劑進行變性處理，然后根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果判定其多態(tài)性位點。
[0010]所述多態(tài)性位點包括:在牛的UCP3基因第5191位為A或G的堿基多態(tài)性位點，表現(xiàn)為ΑΑ、AG、GG三種基因型。
[0011]所述的PCR擴增反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s ;60°C退火40s ；72°C延伸30s ;72°C延伸7min ;4°C保存。
[0012]所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的聚丙烯酰胺凝膠。
[0013]用變性劑對PCR擴增產(chǎn)物進行變性處理，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定牛UCP3基因是否有多態(tài)性。
[0014]所述的聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量濃度為10%。
[0015]所述的根據(jù)PCR-SSCP分析結(jié)合DNA測序結(jié)果顯示，UCP3基因片段5086-5354 (命名為UC-3片段)有AA、AG、GG3種基因型。
[0016]檢測牛UCP3基因單核苷酸多態(tài)性位點的方法在牛輔助選擇和分子育種上的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明對8個牛品種上述SNP進行了基因分型和基因頻率分析，同時也對SSCP多態(tài)位點與牛肉質(zhì)性狀之間進行了關(guān)聯(lián)分析。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明把PCR產(chǎn)物混合測序篩查SNP與PCR-SSCP結(jié)合起來解決了SSCP的不穩(wěn)定性，以防突變點的漏檢，提供了一種簡單、快速、精確度高的方法，便于推廣應(yīng)用在DNA水平上篩查和檢測與牛肉質(zhì)性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，可用于牛的輔助選擇和分子育種。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是引物Pl擴增不同牛個體(牛UCP3基因第5191位多態(tài)位點)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為600bp Marker, 1-9為PCR產(chǎn)物
圖2是本發(fā)明中PCR產(chǎn)物混合測序篩查到的牛UCP3基因序列第5191為A或G突變測序結(jié)果圖。
[0020]圖3是本發(fā)明牛UCP3基因第5191位多態(tài)位點聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。其中I為AG型，2、4、5為AA型，3為GG型。

【具體實施方式】
[0021]為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進一步說明。
[0022]本發(fā)明根據(jù)UCP3基因的外顯子和內(nèi)含子設(shè)計引物，分別以8個牛群體的基因組DNA為模版，進行PCR擴增，混合PCR產(chǎn)物并對其純化，測序。然后，進行測序圖分析和序列比對篩查出SNP位點；其次，對待測群體進行多態(tài)位點的PCR-SSCP檢測；最后，根據(jù)在群體中檢測到的基因型，進行群體遺傳統(tǒng)計分析和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析，篩選出與牛肉質(zhì)性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記。下面對本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述是本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0023]實施例1
一、 牛UCP3基因部分DNA序列的擴增及其多態(tài)性檢測 1、牛樣品的采集和處理
本發(fā)明采用8個牛群體共計318個個體，具體為:(I)安格斯(Angus)牛血液樣品18份，晉南牛(Jinnan)血液樣品23份,利木贊(Limousin)牛血液樣品22份,魯西黃牛(Luxi)血液樣品29份,秦川牛(Qinchuan)血液樣品27份,西門塔爾(Simmental)牛血液樣品30份，夏洛萊(Charolais)牛血液樣品29份，采自河北大廠縣華安肉牛育肥場；(2)安格斯(Angus)牛血液樣品30份,海福特(Hereford)牛血液樣品30份,西門塔爾(Simmental)牛血液樣品28份，采自內(nèi)蒙古通遼三元肉牛育肥場；(3)西門塔爾(Simmental)牛血液樣品，采自內(nèi)蒙古通遼寶龍山肉牛育肥場。從每頭牛的頸靜脈采血8 mL于10 mL管中，加A⑶抗凝劑(血液與ACD體積比為6:1)搖勻，將血樣用加冰塊的泡沫箱帶回實驗室，于_80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0024]2、基因組DNA的提取
(I)冰凍血樣室溫下融化、搖勻，用移液槍吸取1.5mL全血加入5mL離心管中，加入1.5mL (或與血樣等體積)PBS緩沖液,顛倒混勻1min, 12000r/min離心1min,結(jié)束后可看到離心管底部白細(xì)胞沉淀。
[0025](2)棄上清液，重復(fù)(I)的步驟I~2次，至下層白細(xì)胞內(nèi)無紅細(xì)胞。
[0026](3)棄上清液，加入ImL裂解液SET，40 μ L 10% SDS，20 μ L蛋白酶K溶液，振蕩器振蕩2~3min，使之充分混勻，至于恒溫水浴振蕩器中55°C水浴，消化過夜至不見粘稠團塊。
[0027](4)向管中加入與管內(nèi)液體等體積的Tris飽和酚(約1.5mL)，蓋緊管蓋，緩慢連續(xù)顛倒混合不少于1min, 12000r/min離心10min。
[0028](5)小心吸取上清液至新的5 mL離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25: 24:1)混和液,緩慢顛倒離心管不少于1min,使溶液兩相充分混勻，12000r/min離心1min0
[0029](6)轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，混勻，12000r/min 離心 lOmin。
[0030](7)轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，蓋緊管蓋，順一個方向水平搖晃數(shù)次即可看到白色絮狀DNA沉淀，離心4min，使DNA貼附在離心管管壁下部。
[0031](8)用預(yù)冷的75%乙醇洗滌兩次，小心倒出乙醇，室溫放置。
[0032](9)乙醇揮發(fā)后，加入10yL ddH20溶解，4°C放置，24h后，將DNA溶液轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5mL離心管中，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0033]3、DNA濃度和純度檢測
(I)瓊脂糖凝膠電泳檢測
取5 μ L DNA 溶液，與I μ L上樣緩沖液(6X loading buffer)混勻，于1%的瓊脂糖凝膠中以100V電壓電泳30min左右，結(jié)束后利用凝膠成像系統(tǒng)拍照，初步觀察DNA的純度。詳見圖1。
[0034](2)紫外分光光度計檢測
將5 μ I待測DNA溶液充分溶于ddH20，并定容至1ml。利用紫外分光光度計測得其260nm和280nm波長處的OD值。根據(jù)以下公式計算DNA純度和濃度:
DNA 濃度=OD260 X 50ng/ μ I X 200
DNA 純度=0D26Q/0D28。
若DNA純度在1.8-2.0之間，則DNA純度較高；若小于1.8，則樣品中可能存在RNA污染；若大于2.0，則樣品中可能存在蛋白質(zhì)污染。經(jīng)紫外分光光度計測定OD值為1.72，純度較聞。
[0035]擴增引物設(shè)計
根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫提供的牛UCP3基因的DNA序列(序列號:NC_007312.5)和mRNA序列(序列號:NM-174314.2)，利用DNAStar軟件進行比對，確定外顯子和內(nèi)含子，利用Primer 5.0對引物進行設(shè)計和評價；
擴增引物為:
正向引物 F: 5’-TCGGACCGTGAGTGCTGA-3’ ；
反向引物 R: 5’ -ATGCTGGAGTCTGGAGAGGAG-3’。
[0036]二、 PCR 擴增
分別以8個牛品種的DNA為模版，用上述引物進行PCR擴增，PCR總反應(yīng)體系為32 μ L，見表1 ;PCR總反應(yīng)程序，見表2 ；
表1本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系

【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態(tài)性的引物，其特征在于:所述的引物對Pl為: 正向引物 F: 5’-TCGGACCGTGAGTGCTGA-3’ ； 反向引物 R: 5’ -ATGCTGGAGTCTGGAGAGGAG-3’。
2.一種檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)以包含UCP3基因的待測牛基因組DNA為模版，以引物對Pl為引物，PCR擴增牛UCP3基因; (2)對步驟⑴的擴增產(chǎn)物進行PCR目的片段檢測； ⑶對步驟⑵的目的片段進行PCR-SSCP檢測:首先對目的片段分別用變性劑進行變性處理，然后根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果判定其多態(tài)性位點。
3.根據(jù)權(quán)利要 求2所述的一種檢測肉牛UCP3基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于:所述多態(tài)性位點包括:在牛的UCP3基因第5191位為A或G的堿基多態(tài)性位點，表現(xiàn)為AA, AG, GG三種基因型。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測牛UCP3基因單核苷酸多態(tài)性位點的方法，其特征在于，所述的PCR擴增反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s ;60°C退火40s ;72°C延伸30s ;72°C延伸 7min ;4°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測牛UCP3基因單核苷酸多態(tài)性位點的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的聚丙烯酰胺凝膠。
6.一種如權(quán)利要求2所述的檢測牛UCP3基因單核苷酸多態(tài)性位點的方法在牛輔助選擇和分子育種上的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK104131096SQ201410361884
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】甘乾福, 喬慧, 梁學(xué)武, 陳佳欽 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)