一種產5-酮基米爾貝霉素的鏈霉菌及生產5-酮基米爾貝霉素的方法
【專利摘要】本發明涉及基因重組【技術領域】，尤其涉及一種產5-酮基米爾貝霉素的鏈霉菌及生產5-酮基米爾貝霉素的方法。本發明提供了一種用于敲除鏈霉菌milF基因的重組載體，包括milF基因同源片段，該片段的序列為在如SEQ?ID?NO:2所示核苷酸序列中第158～924位核苷酸間缺失105～767個核苷酸。并提供了該重組載體的構建方法，以及采用該重組載體敲除鏈霉菌中milF基因的方法，及milF基因被敲除的鏈霉菌。該鏈霉菌可以直接發酵產生5-酮基米爾貝霉素，簡化了米爾貝肟的合成工藝，并避免了傳統的化學合成方法帶來的污染。
【專利說明】—種產5-酮基米爾貝霉素的鏈霉菌及生產5-酮基米爾貝霉素的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因重組【技術領域】，尤其涉及一種產5-酮基米爾貝霉素的鏈霉菌及生產5-酮基米爾貝霉素的方法。
【背景技術】
[0002]米爾貝霉素是一種大環內酯類驅蟲藥物，日本三共株式會社于1967年發現，經過多年的改良于1986年正式以商品名米爾貝廂(milbemycin oxime)上市。米爾貝廂是米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4的肟衍生物，米爾貝肟對控制和預防大部分常見寄生蟲疾病都有很好的效果。通常用來預防惡絲蟲病，控制線蟲、鉤蟲引發的犬、貓疾病及犬的鞭蟲病。由于米爾貝肟殺蟲活性高、毒性小，LD5tl是臨床推薦用量的2000倍以上，同時對阿維菌素類藥物敏感的犬毒性較小，所以具有很好的市場前景。
[0003]目前，米爾貝肟是通過半合成的方法生產。首先，產米爾貝霉素的鏈霉菌經過發酵，從發酵產物中提取得到米爾貝霉素A3和A4。然后米爾貝霉素A3或A4的C-5羥基被氧化成酮。這種5-酮基米爾貝霉素與鹽酸羥胺在二噁烷-甲醇-水中發生反應，得到米爾貝月虧。
[0004]其中，米貝爾霉素A3具有式I所示結構，米貝爾霉素A4具有式II所示結構，5-酮基米爾貝霉素A3的結構如式III所示，5-酮基米爾貝霉素A4的結構如式IV所示。
[0005]`
【權利要求】
1.用于敲除產米爾貝霉素A3和/或米爾貝霉素A4的原始鏈霉菌milF基因的基因敲除質粒，其特征在于，其包含milF基因同源片段，該片段與SEQ ID NO:2相比，缺失了 SEQID N0:2所示核苷酸序列中第158~924位核苷酸間的105~767個核苷酸。
2.根據權利要求1所述的基因敲除質粒，其特征在于，包含抗性標記基因，還包含順序連接的以下核苷酸片段:上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段； 其中，所述上游核苷酸片段為如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第η~2467個核苷酸，I≤η≤2178，η為整數； 所述milF基因同源片段為在如SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列中第158~924位核苷酸間缺失105~767個核苷酸的序列； 所述下游核苷酸片段為如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第I~m個核苷酸，997≤m≤3108，m為整數。
3.根據權利要求1或2所述的基因敲除質粒，其特征在于，所述milF基因同源片段的序列如 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 或 SEQ ID NO:9 所示。
4.根據權利要求3所述的基因敲除質粒，其特征在于，所述上游核苷酸片段、milF基因同源片段、下游核苷酸片段共同形成SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16所示核苷酸片段。
5.根據權利要求2所述的基因敲除質粒，其特征在于，所述抗性標記基因為壯觀霉素抗性基因。
6.根據權利要求2所述的基因敲除質粒，其特征在于，所述基因敲除質粒的骨架為:pMD19 (Simple)、pBlueScript SK(+)或 pSTV28。
7.根據權利要求2所述的基因敲除質粒，其特征在于，所述基因敲除質粒的序列如SEQID NO:37、SEQ ID NO:38 或 SEQ ID NO:39 所示。
8.如權利要求1~7任一項所述的基因敲除質粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1:將抗性標記基因連接入骨架質粒，獲得第一載體； 步驟2:以鏈霉菌總DNA為模板，擴增第一核苷酸片段，將所述第一核苷酸片段連接入所述第一載體，獲得第二載體； 步驟3:取所述第二載體，用限制性內切酶切除所述第一核苷酸片段中milF基因第158~924位核苷酸間的105~767個核苷酸，制得所述基因敲除質粒； 其中，所述第一核苷酸片段為順序連接的上游核苷酸片段、milF基因、下游核苷酸片段； 所述上游核苷酸片段為如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第η~2467個核苷酸，I≤η≤2178，η為整數； 所述milF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 所述下游核苷酸片段為如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的第I~m個核苷酸，997≤m≤3108，m為整數。
9.如權利要求1~7任一項所述的基因敲除質粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1:以鏈霉菌總DNA為模板，擴增第二核苷酸片段，所述第二核苷酸片段連接入骨架質粒，獲得第三載體； 步驟2:以鏈霉菌總DNA為模板，擴增第三核苷酸片段，所述第三核苷酸片段連接入第三載體，獲得第四載體； 步驟3:將抗性標記基因連接入第四載體，得基因敲除質粒； 其中，所述第二核苷酸片段為順序連接的上游核苷酸片段和milF基因5’端片段； 所述第三核苷酸片段為順序連接的milF基因3’端片段和下游核苷酸片段； 所述上游核苷酸片段為如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中的第η~2467個核苷酸，.1≤η≤2178，η為整數； 所述下游核苷酸片段為如SEQ ID Ν0:3所示核苷酸序列中的第I~m個核苷酸，.997≤m≤3108，m為整數； 所述milF基因5’端片段的核苷酸序列為如SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列中的第I~χ個核苷酸，157 ≤ χ≤ 761，χ為整數； 所述milF基因3’端片段的核苷酸序列為如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列中的第y~.936個核苷酸，866 ≤ y ≤ 925，y為整數；
.105 ≤y-x ≤767。
10.產5-酮基米爾貝霉素的重組鏈霉菌，其特征在于，其通過同源雙交換，將產米爾貝霉素A3或米爾貝霉素A4的原始鏈霉菌的milF基因敲除而制得。
11.根據權利要求10所述的重組鏈霉菌，其特征在于，所述原始鏈霉菌為鏈霉菌(Streptomyces milbemycinicus)或冰城鏈霉菌(Streptomyces bingchengsis),優選鏈霉菌(Streptomyces milbemycinicus) HS023CGMCC N0.7677、鏈霉菌(Streptomycesmilbemycinicus sp.nov) NRRL N0.5739 或冰城鏈霉菌(streptomyces bingchengsissp.nov)CGMCC N0.1734。
12.根據權利要求10所述的重組鏈霉菌，其特征在于，所述敲除除掉的是:SEQIDN0:2所示核苷酸序列中第158~924位核苷酸間的105~767個核苷酸。
13.根據權利要求10、11或12所述的重組鏈霉菌，其特征在于，其制備方法包括以下步驟: 步驟1:取權利要求1~6任一項所述的基因敲除質粒，轉化入大腸桿菌，獲得轉化子；步驟2:以原始鏈霉菌孢子或菌絲體為受體，與所述轉化子進行接合轉移，篩選出milF基因被敲除的菌株，即得產5-酮基米爾貝霉素的重組鏈霉菌。
14.根據權利要求13所述的重組鏈霉菌，其特征在于，所述大腸桿菌為ET12567(pUZ8002)。
【文檔編號】C12N15/66GK103789339SQ201310541829
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年11月4日 優先權日:2013年11月4日
【發明者】黃雋, 徐賽珍, 周敏 申請人:浙江海正藥業股份有限公司