專利名稱：用于檢測白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相對表達量的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬生命科學和生物技術領域，特別是ー種基因檢測試劑盒，采用探針實時熒光定量PCR技術，能夠對人類急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性粒細胞白血病(AML)以及少數慢性粒細胞白血病(CML)患者體內BCR/ABL(m-bcr)融合基因表達水平進行檢測，可有效的節約檢測時間，提聞檢測精度。
背景技術：
白血病是ー類造血干細胞異常的克隆性惡性疾病。其克隆中的白血病細胞失去進一歩分化成熟的能力而停滯在細胞發育的不同階段。在骨髄和其他造血組織中白血病細胞大量增生積聚并浸潤其他器官和組織，同時使正常造血受抑制，臨床表現為貧血、出血、感染及各器官浸潤癥狀。根據白血病細胞的成熟程度和自然病程，白血病可分為急性和慢性兩大類。急性白血病病情進展迅速，自然病程僅有數周至數月。一般可根據白血病細胞系列歸屬分為急性髓系白血病(AML)和急性淋巴細胞白血病(ALL)兩大類。而慢性白血病的發生是由于有功能的已分化成熟細胞過度增生，因此慢性白血病是ー種由于信號傳導不良或細胞增殖失控所至的疾患，而非成熟障礙所至。慢性白血病常見有慢性粒細胞性白血病(CML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。由于白血病類型不同，治療方案及預后亦不盡相同，因此診斷成立后，應進一歩分型。關于人類白血病的病因與發病機理，至今仍未完全明了。已知病因有感染因素、電離輻射、化學物質，遺傳因素及免疫功能異常等。目前認為白血病病因是以上各種因素相互作用的結果。近十余年來慢性粒細胞白血病(CML)的分子生物學研究不斷有新的進展，其中之一就是陸續報道了二十余例BCR (breakpoint cluster region)基因上的斷裂點小在 M-bcr unajorbreakpoint cluster regionノ 而位 T* m-ber (minor breakpointdusterregion)、表達相對分子質量為 190000 BCR/ABL 融合蛋白的 CML(P190 CML)。P190CML是ー個罕見的CML分子亞型。除了 20% -50%的Ph+ALL表達與CML—樣的P210以外，50% -80%的PML-ALL患者BCR基因中的斷裂點不在M_bcr內，而位于其5’端上游至少30kb處，即長70 kb的第I內含子3’端的一半序列上，這ー長35 kb的區域，最初又確定了兩個片段bcr_2和bcr-3,其中bcr_3位于bcr_2的5端上游16kb,現該兩個片段已統稱為m-bcr或mbcrl,融合方式為ela2連接,轉錄成7. 5 kb或7. 0 kb的mRNA,翻譯成相對分子質量為190 000或185 000的蛋白產物P190b『abl或P185bc^ab1。由于早期僅發現ALL和急性髓系白血病(AML)表達P190，因此m-bcr被稱為ALL型斷裂點(ALL-type breakpoint),P190被認為是特有的(ALL-specific，稱為Ph+bcr-ALL或P190 ALL)或急性白血病相關的(AL-associated)。P190CML發現后不久，即有報道P210 CML患者進入加速期、急變期時也可出現P190，提示P190可能與P210 CML疾病進展有夫。后又發現70 %以上慢性期P210CML患者初診時也可檢測到數量不等的P190。因而，導致產生P190的BCR-ABL連接類型并非是Ph+AL特有的。但是P190比P210的致癌能力更高，表達更傾向于導致AL表型是無疑的。因此，從CML中篩選出P190個體對于后期的治療顯得尤為重要。在實際應用中，用于檢測BCR/ABL(m-bcr)融合基因表達水平的方法主要為突光原位雜交，盡管該法較為直觀，但是試驗過程過于繁瑣，需要的試劑種類繁多，費時費力，且試驗結果需要經驗豐富的專家來判讀，結果判讀存在較大的主觀性，因而一定程度上限制了該法的應用。實時熒光定量PCR法具有較高的靈敏度和特異性，而且能對PCR進行實時檢測，可準確反映患者體內BCR/ABL (m-bcr)的表達情況，節約了大量的檢測時間，還避免了殘留污染的發生。常見的方法有SYBR GreenI染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術等。其中SYBR GreenI由于是非飽和染料,特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法,必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本研究采用實時熒光PCR技術結合Taqman探針法應用于BCR/ABL (m-bcr))的基因檢測
發明內容

鑒于現有技術中檢測BCR/ABL (m-bcr)的不足，本發明設計了檢測內參/目的基因用引物、探針序列，用熒光定量PCR技術檢測白血病BCR/ABL (m-bcr)融合基因相對表達量。通過調整兩個基因的引物探針濃度及比例，優化PCR的反應體系和反應條件，開發了ー種用于檢測白血病BCR/ABL (m-bcr)融合基因相對表達量的試劑盒。用于檢測白血病BCR/ABL (m-bcr)融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水こ醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于檢測體系PCR反應液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、檢測目的基因用上下游引物m-bcr-F, m_bcr-R,探針m-bcr-Probe,檢測內參基因Abl用引物為abl_F, abl_R,探針ab I-Probe ;其中，m-bcr-F GGCGCCTTCCATGGAGACm-bcr-R TCCTTGGAGTTCCAACGA m-bcr-Probe TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAabl-F GCCGTGAAGACCTTGAAGGAGabl-R ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe :FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG_TAMRA。所述陽性對照品分別為含有BCR/ABL (m-bcr)基因的溶液；所述陰性對照品為無BCR/ABL (m-bcr)基因的溶液。其中的ReverTra Ace qPCR RT Kit為T0Y0B0公司生產的qPCR用cDNA試劑盒產品。THUNDERBIRD qPCR MIX為T0Y0B0公司生產的定量PCR試劑，產品規格為QPS-101。使用本發明的試劑盒，將實時熒光PCR技術結合采用Tapman探針，可以對BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因的表達水平進行檢測，檢測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節約檢測時間。采用雙標準曲線法，通過構建BCR/ABL(m-bcr)和內參基因abl的標準定量曲線，精確定量樣本的內參基因拷貝數和BCR/ABL (m-bcr)拷貝數，相比于以往的免疫組化方法和現今的ACT法，該試劑盒具有精度高，結果便于判讀等優點。加之該試劑盒將反應體系所需的引物、探針進行合理配比和優化，使實驗條件達到最佳，從而省去了繁瑣的條件摸索環節，大大提升了實驗效率。該試劑盒經測試特異性好，靈敏度高，操作簡便。有助于臨床上急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性粒細胞白血病(AML)早期預防、早期診斷的輔助性指標；還可對于疑似進入慢性粒細胞白血病(CML)加速期、急變期的高危人群進行較為準確的篩查。


圖I :陽性結果示意圖。圖2:陰性結果示意圖。
具體實施例方式實施例I本發明的用于檢測白血病BCR/ABL(m_bcr)融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液；TRIzol ；氯仿；無水乙醇；ReverTra Ace qPCR RT Kit(T0Y0B0 公司);檢測體系PCR 反應液THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2X)、BCR/ABL(m_bcr)上、下游引物各 0. 8uM>BCR/ABL (m-bcr)探針 0. 4uM ；abl 上、下游引物各 0. 8uM、abl_prob e (探針)0. 4uM;其中m-bcr-F GGCGCCTTCCATGGAGACm-bcr-R TCCTTGGAGTTCCAACGAm-bcr-Probe TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAabl-F GCCGTGAAGACCTTGAAGGAGabl-R ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe :FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG_TAMRA。陽性對照品分別含BCR/ABL (m-bcr)基因組溶液；陰性對照品不含BCR/ABL (m-bcr)基因組溶液。實施例2本發明試劑盒的使用方法(I)抽提血液中的組織RNA :在潔凈的I. 5ml的離心管中加入Iml紅細胞裂解液，取抗凝血0. 5ml混勻。室溫靜置IOmin ;5000rpm離心5min,棄上清,收集底部的細胞；再次加入0. 5ml紅細胞裂解液，5000rpm離心5min，棄上清，收集底部的細胞；向細胞中加入ImlTRIzol，反復吹打直至沉淀完全溶解，室溫靜止5min ;加入0. 2ml氯仿，震蕩均勻；14000rpm4°C離心lOmin，吸取上清層轉移至另一新的離心管中；加入等體積的異丙醇，上下充分混勻，室溫靜置IOmin ；14000rpm 4°C離心IOmin,棄上清,加入75%乙醇Iml,輕輕上下顛倒洗漆管壁；14000rpm 4°C離心5min,棄乙醇；室溫干燥10_15min,加入20ulRNase-free水溶解沉淀。
(2)參考T0Y0B0公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA反轉為 cDNA。(3)試劑配置按檢測人份數配置檢測體系PCR反應液各X ul，每人份23ul分裝X = 23ul反應液X (8份內參(標準曲線)+8份目的基因(標準曲線)+n份標本+1份陽性對照+1份陰性對照+1份空白對照)；(4)加樣加入檢測體系PCR反應液中2ulcDNA ;陽性對照和陰性對照直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2ul生理鹽水或不加任何物質。(5)檢測檢測在實時熒光PCR儀上進行，可用儀器包括ABI7300，7500(美國Applied Biosystems 公司)等。反應條件95°C預變性 Imin ；95°C 15s, 58°C 35sec 40 個循環，突光信號于58°C 35sec時米集。(6)結果判斷將閾值線調整至背景信號及陰性擴增線以上，系統根據標準曲線和CT值自動計算出拷貝數。I)內參陽性時，檢測結果才認為有效；2)陽性判斷標準，Ct < 36，為陽性；35 ^ Ct ^ 38，為疑似陽性，需要再次驗證；Ct > 38，為陰性。實施例3采用本發明核酸檢測試劑盒檢測臨床標本取送檢的急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性粒細胞白血病(AML)以及少數慢性粒細胞白血病(CML)患者抗凝血標本共50例，按實施例2所述方法提取基因組RNA、配制試劑并檢測。每份標本加入檢測體系PCR反應液中2ul。同時做陽性，陰性，空白對照，內參基因/目的基因的標準曲線各一份。一臺96孔的熒光PCR儀可同時檢測38份樣品，每個樣本2次重復，一份陽性對照，一份陰性對照和一份空白對照。檢測時間僅為100分鐘。實驗結果與特檢實驗室的報告結果相比較，確定樣品檢測的準確率。部分陽性結果如下表
權利要求
1.用于檢測白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水こ醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于 檢測體系PCR反應液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、檢測目的基因用上下游引物m-bcr-F, m-bcr-R,探針 m-bcr-Probe,檢測內參基因 Abl 用引物為 abl_F, abl-R,探針ab I-Probe ;其中，m-bcr-F: GGCGCCTTCCATGGAGACm-bcr-R: TCCTTGGAGTTCCAACGAm-bcr-Probe: TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAabI-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAGabl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述陽性對照品分別為含有BCR/ABL(m-bcr)基因的溶液；所述陰性對照品為無BCR/ABL(m-bcr)基因的溶液。
全文摘要
本發明公開了用于檢測白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于檢測體系PCR反應液包括THUNDERBIRDqPCRMIX、檢測目的基因用上下游引物m-bcr-F，m-bcr-R，探針m-bcr-Probe，檢測內參基因Abl用引物為abl-F，abl-R，探針abl-Probe；其中，m-bcr-F:GGCGCCTTCCATGGAGAC；m-bcr-R:TCCTTGGAGTTCCAACGA；m-bcr-Probe:TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAA；abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG；abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC；abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
文檔編號C12Q1/68GK102649977SQ20121012998
公開日2012年8月29日 申請日期2012年4月27日 優先權日2012年4月27日
發明者周曉犢, 徐建成, 方國偉, 王淑一 申請人:南京艾迪康醫學檢驗所有限公司