專利名稱：核殼結構固定化酶顆粒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及ー種核殼結構固定化酶顆粒及其制備方法，屬于固定化酶技木。
背景技術：
酶作為ー種生物催化劑，因其具有高選擇性、催化條件溫和、無污染等特點，廣泛應用于食品加工、醫藥和精細化工等行業。但游離酶穩定性差、在受熱、酸、堿和有機溶劑等條件下易失活、無法重復使用，并且底物產品通常想成均相混合物，純化困難，使其難以在エ業中更為廣泛的應用。而固定化酶技術是目前提高酶使用效率和實現操作連續化最有效的手段之一。納米材料由于其結構的特殊性，表現出ー些特殊的理化特性和生物學特性，被廣泛的應用于生命科學的需要領域，如固定化酶、蛋白質分離、藥物載體、生物傳感器等。用納米材料作為固定化酶載體，較傳統的而言，具有如下優點良好的生物相容性；較大的比表面積，能有效地提高載酶量；較小的顆粒直徑，具很小的擴散限制，在溶液中易分散。納米材料作為新型固定化酶載體已經成功應用于多種酶的固定化。然而，眾所周知，隨著納米材料尺寸的之間減小，其回收問題將愈顯的明顯。目前多采用離心(過濾)、磁性分離和包理法，然而離心法所需轉速通常很高，要在lOOOOr/min以上；磁性分離雖然能節省能源，但目前材料僅局限在鐵系，難以擴展固定化酶載體的材料；將納米顆粒包埋于微米或毫米尺度的載體中雖容易實現回收，但底物產物在載體中的傳質阻力明顯增加，進而極大的降低了催化活性。因此，開發ー種簡便、有效地方法制備具高活性、易回收的固定化酶顆粒具有重要意義和應用價值。

發明內容
本發明目的在于提供ー種核殼結構固定化酶顆粒及其制備方法，該固定化酶顆粒酶催化活性高，易回收，酶活回收率高，穩定性好，適用范圍廣。其制備方法過程簡単。本發明是通過下述技術方案加以實現的，ー種核殼結構固定化酶顆粒，其特征在于，該固定化酶顆粒平均粒徑為50微米，其核材為正十六烷(油相)，殼材為氧化鈦納米顆粒，每克氧化鈦納米顆粒含酸脫氫酶量或含過氧化氫酶量為3(Γ180毫克，該氧化鈦納米顆粒平均粒徑為80納米。上述固定化酶顆粒的制備方法，其特征在于包括以下特征
Cl) 將精氨酸溶于50mM、pH6. 8 7. O的tris_HCl緩沖溶液中，配制濃度為300mM的精氨酸溶液；配制濃度為50 mM的鈦的前驅體(titanium (IV) bis (ammonium lactato)dihydroxide)水溶液；將多巴溶于50mM、pH7. 0 7. 5的tris_HCl緩沖溶液中，配制濃度為
2.5mg/ml的多巴溶液，將酸脫氫酶或過氧化氫酶加入到精氨酸溶液中，使得酸脫氫酶或過氧化氫酶濃度維持在0. 5mg/ml，然后按體積比1:2將鈦前驅體溶液迅速加入到含酸脫氫酶或含過氧化氫酶的精氨酸溶液中，于1500rpm轉速下攪拌lmin，再向反應液中加入與鈦前驅體溶液等體積的多巴溶液，繼續攪拌lOmin。然后在轉速為10000r/min下離心分離，離心后用去離子水洗，重復離心-水洗過程，至上清液不含精氨酸，得到含酶納米顆粒；
(2)將正十六烷與鈦酸丁酯按體積比(10^50) : I混合均勻，按體積比40:1將50mM、pH6. 8^7. O的tris-HCl緩沖液迅速加入到正十六烷-鈦酸丁酯混合液中，得油水混合液，隨后按照油水混合液與含酶納米顆粒質量比2500:1將油水混合液與含酶納米顆粒混合，乳化60s,繼續攪拌6(Tl20min,得到核殼結構固定化酶顆粒。本發明提出的制備方法的優點在于制備方法簡便可控，條件溫和，避免了極端PH對生物分子結構的破壞，該核殼結構固定化酶顆粒因維持原納米顆粒的高分散性以及納米顆粒獨有特性，而表現出高的活性，同時油水密度差異使得該固定化酶顆粒回收非常容易，酶活回收率高，穩定性好。


圖I為實施例I制備的核殼結構固定化酶顆粒的光學顯微鏡照片照片。圖2為實施例2制備的核殼結構固定化酶顆粒的光學顯微鏡照片照片。圖3為實施例3制備的核殼結構固定化酶顆粒的光學顯微鏡照片照片。圖4為對比例I制備的含酶納米顆粒的透射電鏡(TEM)照片。
具體實施例方式實施例一
準確稱取522mg精氨酸粉末溶解于去離子水中，并用去離子水定容至10mL，得到300mM精氨酸溶液，用氫氧化鈉和鹽酸調節溶液pH為6. 8^7. O。取lmL，2M的鈦前驅體溶液(titanium (IV) bis (,ammonium lactato) dihydroxide,從 Sigma-Aldrich 公 ロJ購得)，用去離子水稀釋，定容至40mL，得到50mM的鈦的前驅體溶液,用氫氧化鈉和鹽酸調節溶液pH為6. 8 7. O。準確稱取40mg 3- (3，4-ニ羥基苯)-L-丙氨酸(多巴)溶于去離子水中，配成濃度為2. 5 mg/mL的多巴溶液，用氫氧化鈉和鹽酸調節溶液pH值7. (Γ7. 5 ;將O. 5mg酸脫氫酶，加入到Iml精氨酸溶液中，然后將O. 5ml鈦前驅體迅速加入到上述Iml含酶的精氨酸溶液中，室溫下在轉速1500r/min下混合攪拌I. Omin,向其中加入O. 5mL多巴溶液,繼續反應30min，在轉速為10000r/min下離心分離，去除上清液，用去離子水洗滌離心分離，至上清液不含多巴及精氨酸。冷凍干燥，得到直徑約80nm的含酶納米顆粒。將125μ1正十六烷與I. 25μ1鈦酸丁酯混合均勻，迅速加入到5ml、50mM的tris_HCl緩沖液中，同時向其中加入2mg含酶納米顆粒，乳化60s，然后利用試管搖床緩慢搖60min，得到核殼結構固定化酶顆粒。實施例ニ
本實施例與實施例ー步驟基本相同，與其不同之處在于鈦酸丁酯的用量由I. 25μ1改變為3. 75μ1 ;向油水混合物中加入含酶顆粒并乳化60s后，緩慢搖動時間由60min改變為120mino實施例三
本實施例與實施例ー步驟基本相同，與其不同之處在于鈦酸丁酯的用量由I. 25μ1改變為6. 25μ1 ;向油水混合物中加入含酶顆粒并乳化60s后，緩慢搖動時間由60min改變為120mino實施例三
本實施例與實施例ー步驟基本相同，與其不同之處在于加入到精氨酸溶液中的酸脫氫酶改變為過氧化氫酶。對比案例I
準確稱取522mg精氨酸粉末溶解于去離子水中，并用去離子水定容至10mL，得到300mM精氨酸溶液，用氫氧化鈉和鹽酸調節溶液pH為6. 8^7. O。取lmL，2M的鈦前驅體溶液(titanium (IV) bis (,ammonium lactato) dihydroxide,從 Sigma-Aldrich 公 ロJ購得)，用去離子水稀釋，定容至40mL，得到50mM的鈦的前驅體溶液,用氫氧化鈉和鹽酸調節溶液pH為6. 8 7. O。準確稱取40mg 3- (3，4-ニ羥基苯)-L-丙氨酸(多巴)溶于去離子水中，配成濃度為2. 5 mg/mL的多巴溶液，用氫氧化鈉和鹽酸調節溶液pH值7. (Γ7. 5 ;將O. 5mg酸脫氫酶，加入到Iml精氨酸溶液中，然后將O. 5ml鈦前驅體迅速加入到上述Iml含酶的精氨酸溶液中，室溫下在轉速1500r/min下混合攪拌I. Omin,向其中加入O. 5mL多巴溶液,繼續反應30min，在轉速為10000r/min下離心分離，去除上清液，用去離子水洗滌離心分離，至上 清液不含多巴及精氨酸。冷凍干燥，得到直徑約80nm的含酶納米顆粒。
權利要求
1.ー種核殼結構固定化酶顆粒，其特征在于，該固定化酶顆粒平均粒徑為50微米，其核材為正十六烷，殼材為氧化鈦納米顆粒，每克氧化鈦納米顆粒含酸脫氫酶量或含過氧化氫酶量為3(Γ180毫克，該氧化鈦納米顆粒平均粒徑為80納米。
2.一種按權利要求I所述的核殼結構固定化酶顆粒的制備方法，其特征在于包括以下特征 (1)將精氨酸溶于50mM、pH6.8 7. O的tris-HCl緩沖溶液中，配制濃度為300mM的精氨酸溶液；配制濃度為50 mM的鈦的前驅體水溶液；將多巴溶于50mM、ρΗ7. (Γ7. 5的tris-HCl緩沖溶液中，配制濃度為2. 5mg/ml的多巴溶液，將酸脫氫酶或過氧化氫酶加入到精氨酸溶液中，使得酸脫氫酶或過氧化氫酶濃度維持在O. 5mg/ml，然后按體積比1:2將鈦前驅體溶液迅速加入到含酸脫氫酶或含過氧化氫酶的精氨酸溶液中，于1500rpm轉速下攪拌lmin，再向反應液中加入與鈦前驅體溶液等體積的多巴溶液，繼續攪拌lOmin，然后在轉速為10000r/min下離心分離，離心后用去離子水洗，重復離心-水洗過程，至上清液不含精氨酸，得到含酶納米顆粒； (2)將正十六烷與鈦酸丁酯按體積比(10 50): I混合均勻，按體積比40:1將50mM、pH6. 8^7. O的tris-HCl緩沖液迅速加入到正十六烷-鈦酸丁酯混合液中，得油水混合液，隨后按照油水混合液與含酶納米顆粒質量比2500:1將油水混合液與含酶納米顆粒混合，乳化60s,繼續攪拌6(Tl20min,得到核殼結構固定化酶顆粒。
全文摘要
本發明公開了一種核殼結構固定化酶顆粒及其制備方法。所述的固定化酶顆粒平均粒徑為50微米，其核材為正十六烷，殼材為氧化鈦納米顆粒，每克氧化鈦納米顆粒含酸脫氫酶量或含過氧化氫酶量為30~180毫克，該氧化鈦納米顆粒平均粒徑為80納米。其制備過程包括以含酶的精氨酸為催化劑，多巴為終止劑，協同作用下催化鈦的前驅體形成含酶的氧化鈦納米顆粒，將含酶納米顆粒分散于油水乳化液中乳化并老化一定時間制得核殼結構固定化酶顆粒。本發明優點在于該核殼固定化酶顆粒酶催化活性高，易回收，酶活回收率高，穩定性好，適用范圍廣。其制備方法過程簡單。
文檔編號C12N11/02GK102676494SQ20121013387
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月3日 優先權日2012年5月3日
發明者姜忠義, 王曉莉, 石家福 申請人:天津大學