專利名稱：Stat4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及牛的分子標記輔助選擇技術領域，尤其是一種STAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記及其應用。
背景技術：
作為奶牛生產重要的經濟性狀，乳質性狀主要包括乳蛋白量、乳蛋白率、乳脂量和乳脂率等方面，屬典型的微效多基因控制的數量性狀，可直接影響牛奶的營養、風味和牛奶產業的經濟效益。雖然正常情況下乳成分基本保持穩定，但乳脂和乳蛋白等成分會因生理和遺傳因素在一定范圍內產生波動并影響乳 品質，因此亟需依據市場和人類營養學的需求，利用功能基因和功能性單核苷酸多態性分子標記改善牛奶品質。哺乳動物的信號轉導與轉錄激活因子(signal transduction and activator oftranscriptions, STATs)家族介導了多種生物學反應，可與酪氨酸磷酸化信號通路偶聯，直接聯系細胞外信號、參與目的基因表達調控，從而調控包括細胞生長、分化、凋亡及免疫反應等多種重要的生物過程。作為Jak蛋白酪氨酸激酶(Janus protein tyrosine kinase,JAK)的靶蛋白，在哺乳動物中已發現7種STAT蛋白，即STATl、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。與其他STAT蛋白不同，STAT4是STAT蛋白家族中惟一限定組織分布的成員，主要分布在淋巴和髓系組織中。該蛋白主要由IL-12激活，在Thl/Th2的分化調控及因此失調引發的各種炎癥性疾病中發揮著重要的作用。目前的研究顯示乳腺組織中可檢測到除STAT2外的其他6種STAT蛋白，且乳腺發育過程中的STAT蛋白以STAT1-STAT4-STAT6-STAT5-STAT3-STAT1的方式被連續激活，每個成員均在該過程中發揮各自特有的功能。在乳腺發育過程中，STAT4基因的表達存在變化，雖然人們尚不確定STAT4在乳腺發育過程中的特定功能，但是該蛋白與乳腺發育過程密切相關。另外，在該基因內已經發現了存在與牛乳質性狀相關的分子標記。因此，申請人開展了牛STAT4基因內含子19序列的克隆、SNP篩查與檢測及其與牛乳質性狀的關聯分析。

發明內容
本發明的目的正是要解決上述技術存在的不足，而提供一種STAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記及其應用，一種作為牛標記輔助選擇的、與牛乳質性狀相關的分子標記的克隆及應用，本發明的分子標記與STAT4基因有關。本發明目的在于克隆與牛乳質性狀相關的分子標記，利用該分子標記作為牛標記輔助育種的應用。本發明解決其技術問題采用的技術方案本發明克隆得到一種與牛乳質性狀相關的分子標記，它是序列表SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。在序列表SEQ ID NO 1的146bp處有一個G146-A146的堿基替換，280bp處有一個G280-C280的堿基顛換。所發現的G146-A146的堿基替換和280bp處G280-C280的堿基顛換為2個單核苷酸連鎖突變，因此這2個突變僅出現GGGG、GAGC和AACC這3種單倍型。其中克隆牛STAT4基因的引物對的DNA序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所本發明建立一種制備上述分子標記和檢測上述分子標記的方法，該方法的步驟如下用牛STAT4基因設計引物，擴增得到目的片段；從牛外周血中提取基因組DNA，以牛STAT4基因DNA序列為模板設計引物，PCR擴增，PCR產物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，應用PCR-SSCP方法檢測牛STAT4基因的多態性，并初步進行了其基因型與牛乳質性狀之間的關聯分析的應用，為牛的分子標記輔助選擇提供了一個新的分子標記。本發明有益的效果是從牛STAT4基因中克隆獲得一種作為分子標記應用的與牛乳質性狀相關的基因片段，公開了擴增STAT4基因部分內含子區所用的引物以及用于分子標記的檢測方法。本發明為牛的標記輔助選擇提供了 2個新的分子標記。


圖I :是本發明的技術流程圖。圖2:是本發明中牛STAT4基因內含子19擴增序列的電泳圖譜，片段大小為310bp (瓊脂糖膠濃度為1.5% )0圖中M為DNA分子量標記(DL2000plus)。圖3 :中國荷斯坦奶牛STAT4基因內含子19突變純合型BB基因型個體序列的與牛全基因組數據庫BLAST比對結果。圖4:是本發明中牛STAT基因內含子19突變純合型個體測序發現SEQ ID N01的146bp處有一個G146-A146的堿基替換，280bp處有一個G280-C280的堿基顛換，兩個突變為兩個單核苷酸連鎖突變。圖5 :是本發明中牛STAT4基因內含子19PCR-SSCP的3種基因型(AA、AB和BB各對應146bp處和280bp處GGGG、GAGC和AACC這3種基因型。)
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明序列表SEQ ID NO 1是本發明克隆及用于PCR-SSCP檢測的牛乳質性狀相關基因STAT4基因內含子19的DNA序列。序列表SEQ ID NO 2是本發明中用于克隆及PCR-SSCP檢測牛乳質性狀相關基因STAT4基因內含子19DNA突變的PCR-SSCP上游引物。序列表SEQ ID NO 3是本發明中用于克隆及PCR-SSCP檢測牛乳質性狀相關基因STAT4基因內含子19DNA突變的PCR-SSCP下游引物。實施例I :STAT4基因內含子19序列的克隆(制備實施例)I.引物設計利用牛STAT4基因DNA序列(GenBank收錄號NC 007300. 5)設計了一對用于擴增牛STAT4內含子19的引物。引物由美國Invitrogen英杰生命技術有限公司上海辦事處合成，引物對的DNA序列如下
正向引物5'-GAGCGGTTAGTAATCAGTAGCTAGA-3'(對應 SEQ ID NO :2)，反向引物5'-GGAGGGGATGAAGCATAAAGACC-3'(對應 SEQ ID NO :3)。2. PCR產物的擴增、純化和測序(I) PCR 擴增25 μ L 的反應體系中加入 50ng/y L 的 DNA 模板 2 μ L，10XPCR Buffer 2. 5 μ L,
2.5mMdNTP I μ L，IOmM正、反向引物各0. I μ L，Taq酶1U，雙蒸水至25 μ L。PCR反應程序如下94°C預變性 5min ;94°C變性 10sec，6rC復性 10sec，72°C延伸 20sec，35 個循環；72°CIOmin ;4°C保存。PCR產物經I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)。、(2) PCR產物的純化和測序足量的PCR產物經I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，在瓊脂糖凝膠中切割分子量為310bp的目的片段,利用E.Z.N.A8.膠回收試劑盒(Omega)進行純化后,送美國Invitrogen英杰生命技術有限公司上海辦事處進行測序。(3) DNA序列同源性檢索鑒定及突變位點的確定通過NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，將測序后獲得的序列與GenBank牛全基因組數據庫中公布的數據進行比對，結果顯示克隆的序列位于牛STAT4基因內含子19(圖3)。而該基因在2個位點發生了基因突變。這2個位點分別是在SEQ ID NO 1的146bp處有一個G146-A146的堿基替換，280bp處有一個G280-C280的堿基顛換(圖4)。所發現的G146-A146的堿基替換和280bp處G280-C280的堿基顛換為2個單核苷酸連鎖突變，因此這2個突變僅出現野生純合型GGGG、突變雜合型GAGC和突變純合型AACC這3種單倍型。實施例2 STAT4PCR-SSCP基因型檢測方法的建立取5 μ L正、反向引物的PCR擴增產物，與10 μ L上樣緩沖液(98 %甲酰胺、O. 025 %二甲苯氰、2%甘油、O. Olmmol · L-1EDTA)混合，瞬時離心后放于PCR儀中99°C變性lOmin，并立即置于冰上，冰浴30min后上樣于15%非變性聚丙烯酰胺凝膠，4°C，180V、200mA條件下電泳12 15h。電泳結束后，取膠進行銀染顯帶，判定基因型。PCR擴增產物的SSCP分析發現AA、AB和BB 3種基因型，其中AA型為野生純合型，對應GGGG單倍型；BB型為突變純合型，對應AACC單倍型；AB為突變雜合型，對應GAGC單倍型(圖5)。實施例3 STAT4PCR-SSCP多態性在中國荷斯坦牛中的分布狀態檢測利用PCR-SSCP檢測了中國荷斯坦牛STAT4內含子19內突變的基因型和等位基因頻率。結果顯示，檢測中國荷斯坦牛群體中STAT4基因內含子19內的突變以等位基因A (即野生型，146G和280G)為主，達到0. 6667，等位基因B (即突變型，146A和280C)的等位基因頻率為0. 3333 (表I)。STAT4基因內含子19SNPs多態信息含量為0. 3457，屬中度多態，表明STAT4基因內含子19SNPs的遺傳變異較大，可望獲得更多的選擇效果。SNPs x 2適合性檢驗結果表明，中國荷斯坦群體在該位點已經達到Hardy-Weinberg平衡狀態(P > 0. 05)。表I中國荷斯坦牛STAT4基因內含子19突變的基因型和等位基因頻率
實施例4 :本發明克隆的分子標記在牛乳質性狀關聯分析中的應用(應用實施例)(I)基因型掃描用于關聯分析的乳質性狀分析的219頭I 3胎中國荷斯坦奶牛尾靜脈血液樣品(EDTANa抗凝)均采自浙江省金華市伊康乳業奶牛場核心群。試驗個體在泌乳期內均參加了奶牛群體改良計劃(Dairy herd improvement, DHI),具有完整泌乳期生產數據,試驗個體每月進行一次DHI測定，日擠奶3次。試驗個體均使用丹麥FOSS的CombiFoss FT+乳成分及體細胞分析儀測定體細胞數、乳蛋白率、乳蛋白量等泌乳性狀。其中試驗個體的產奶量及泌乳性狀測定值均已校正為305天校正產奶量及泌乳性狀測定值。由于未轉換的的體細胞數(somatic cell count, SCC)廣泛偏離正態性和齊性分布，需將體細胞數轉化為體細胞評分后進行關聯分析。體細胞評分(Somatic cell score,SCS) = [log2(SCC/100)]+3，其中 SCC 單位為 1000/mL。應用PopGen32軟件計算STAT4突變基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量。使用統計軟件包SPSS17. O中的Generalized Linear Models構建STAT4突變位點與中國荷斯坦奶牛乳脂率、乳蛋白率、305天校正產奶量、305天校正乳脂量、305天校正乳蛋白量及體細胞評分6個性狀的一般線性模型Yij = μ i+Mj+eijk ①其中Yij為中國荷斯坦奶牛乳脂率、乳蛋白率、305天校正產奶量、305天校正乳脂量、305天校正乳蛋白量及體細胞評分測定值；μ i為群體最小二乘均值;Mj為基因型(3個水平AA、AB和BB)的固定效應；eijk為殘差效應。由于用于基因型效應分析的個體均來自于同一飼養場的同一群體，因此模型中不包含場效應和品種效應?；蛐托治鲋屑有孕?additive effect, a) = (AA-BB)/2,顯性效應(dominant effect, d) = AB-(AA+BB)/2。A等位基因的平均效應al = q [a+d (q-p) ] ;B等位基因的平均效應α 2=-p[a+d(q_p) ] ,A等位基因代替B等位基因的平均效應α = a I-a 2 = a+d (q-p),其中P為A的等位基因頻率；q為B等位基因頻率。以模型①分析中國荷斯坦奶牛受試群體STAT4基因內含子19突變與乳質性狀的關聯分析結果表明，各基因型與奶牛305天校正乳蛋白量呈現顯著關聯(P < 0. 05)，與乳脂率呈現極顯著關聯(P < 0. 01)，各基因型305天校正乳蛋白量呈現出GAGC > GGGG > AACC的趨勢，乳蛋白率、乳脂率呈現出AACC > GAGC > GGGG的趨勢(表2)。單基因效應分析表明，STAT4基因內含子19突變對305天校正產奶量、305天校正乳蛋白量和305天校正乳脂量表現為正的加性效應和正的顯性效應，但是加性效應和顯性效應均不顯著(P > 0. 05)。表2STAT4基因內含子19突變基因型對中國荷斯坦牛乳質性狀的影響
權利要求
1.一種STAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記，其特征在于其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1所示，在序列表SEQ ID NO 1的第146bp處有一個G146-A146的堿基替換，序列表SEQ ID NO 1的第280bp處有一個G280-C280的堿基顛換。
2.根據權利要求I所述的TAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記，其特征在于擴增所述分子標記的引物對，其DNA序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
3.根據權利要求I所述的TAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記，其特征在于所述的分子標記在牛分子標記輔助育種中的應用。
4.根據權利要求2所述的TAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記，其特征在于所述的引物對在牛分子標記輔助育種中的應用。
全文摘要
本發明屬于家畜分子標記制備技術領域，具體涉及一種STAT4基因作為牛乳質性狀相關的分子標記及其應用，從牛STAT4基因中克隆獲得一種作為分子標記應用的與牛乳質性狀相關的基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，在SEQ ID NO1的146bp處有一個G146-A146的堿基替換，280bp處有一個G280-C280的堿基顛換。所發現的G146-A146的堿基替換和280bp處G280-C280的堿基顛換為2個單核苷酸連鎖突變，因此這2個突變僅出現GGGG、GAGC和AACC這3種單倍型。本發明有益的效果公開了擴增STAT4基因部分內含子區所用的引物以及用于分子標記的檢測方法。本發明為牛的標記輔助選擇提供了2個新的分子標記。
文檔編號C12Q1/68GK102660541SQ20121013411
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月2日 優先權日2012年5月2日
發明者姜俊芳, 宋雪梅, 張磊, 蔣永清 申請人:浙江省農業科學院