專利名稱：一種提升基因克隆效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種基因克隆方法，尤其是涉及ー種提升基因克隆效率的方法。
背景技術(shù)：
RACE技術(shù)以其簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)，目前已逐漸取代了 cDNA文庫(kù)篩選技木，成為克隆新基因的主要手段。但在實(shí)際的操作中，常常會(huì)遇到一些困難，尤其是5’ -RACE,在步驟上略微復(fù)雜，可能遇到的問(wèn)題也較多。隨著RACE技術(shù)日益完善，目前己有各種商業(yè)化RACE技術(shù)產(chǎn)品推出，然而，RACE反應(yīng)實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作中依然存在不少問(wèn)題，需要對(duì)RACE反應(yīng)條件尤其是5’ -RACE進(jìn)行反復(fù)摸索。如對(duì)于經(jīng)典的5’ -RACE來(lái)說(shuō)，主要包含了反轉(zhuǎn)錄、同聚物加尾、cDNA第二條鏈的合成及之后的巢式(嵌套)PCR,這幾個(gè)連續(xù)的酶促反應(yīng)步驟每一歩都可能失敗，從而導(dǎo)致最終擴(kuò)增結(jié)果不理想。許多研究小組([I]鄧雪柯，殷建華，曹毅.3種5’RACE技術(shù)的比較與優(yōu)化[J],成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2007，2 (I) :20-25 ; [2]李關(guān)榮，魯成，夏慶友，等.cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)的優(yōu)化與改良[J].生命科學(xué)研究.2003，7 (3) :189-197 ; [3]羅聰，何新華，陳虎，等.ー種高效獲取基因5'末端的RACE方法[J].植物生理學(xué)報(bào).2011，47(4) :409-414)對(duì)RACE的各個(gè)步驟都進(jìn)行了改良和優(yōu)化(如選擇不同的逆轉(zhuǎn)錄酶、提高逆轉(zhuǎn)錄溫度，采用加尾替代方法，采用熱啟動(dòng)PCR，設(shè)計(jì)不同的擴(kuò)增引物等)，但效果如何，通常需要在最后PCR兩輪擴(kuò)增之后才能判別，對(duì)于影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主效因子及最優(yōu)反應(yīng)條件的尋找效率較低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提升基因克隆效率的方法。本發(fā)明包括以下步驟I)根據(jù)預(yù)先獲得的目標(biāo)基因部分序列片段的5’端，設(shè)計(jì)I對(duì)引物TEST-F和TEST-R，該對(duì)引物需能夠特異地?cái)U(kuò)增出預(yù)先獲得的目標(biāo)基因部分序列片段的5’端，所擴(kuò)增片段要求位于5’ RACE第一輪PCR擴(kuò)增所使用特異性引物GSPl的上游；2)制備陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)模板將引物TEST-F和TEST-R擴(kuò)增獲得的特異片段連接入PMD19-T質(zhì)粒中，獲得含有上述特異片段的PMD19-T重組質(zhì)粒，并以純化后的該重組質(zhì)粒作為檢測(cè)過(guò)程的陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)模板；3)利用引物TEST-F和TEST-R，以5’RACE過(guò)程中的各反應(yīng)產(chǎn)物分別作為模板進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，并以步驟2)中的所述PMD19-T重組質(zhì)粒為模板設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，等體積的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I. 5%瓊脂糖電泳并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析；4)若步驟3)中的擴(kuò)增結(jié)果均呈陰性，則表明是除5’ RACE過(guò)程中的各反應(yīng)產(chǎn)物以外的其他反應(yīng)成分或反應(yīng)條件導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，可通過(guò)變更這些導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的因素來(lái)排除；若通過(guò)步驟3)檢測(cè)后，陽(yáng)性對(duì)照有較亮目的條帶，而對(duì)于被檢測(cè)的5’ RACE過(guò)程中的各反應(yīng)產(chǎn)物，檢測(cè)結(jié)果呈陰性或條帶極微弱的表明其中不含有靶基因或靶基因有效拷貝數(shù)低，不適于后續(xù)的RACE擴(kuò)增；檢測(cè)結(jié)果顯示條帶亮度較高的則表明其中具有一定的靶基因、有效拷貝數(shù)，由于靶基因的有效拷貝數(shù)越多，越有利于后續(xù)的RACE法克隆基因，而不同產(chǎn)物中有效拷貝數(shù)的量可根據(jù)檢測(cè)條帶的亮度進(jìn)行確定。在步驟I)中，所述目標(biāo)基因部分序列片段的5’端為靠近mRNA帶有7_甲基鳥(niǎo)嘌呤帽子結(jié)構(gòu)的一端，也可表示為上游端；所述特異性引物GSPl是根據(jù)預(yù)先獲得的目標(biāo)基因部分序列設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物。所述5’端即mRNA帶有7-甲基鳥(niǎo)嘌呤帽子(cap)結(jié)構(gòu)的一端，也可表示為上游端，3’端即mRNA帶有poly(A)聚腺苷酸尾巴的一端，也可表示為下游端。在步驟2)中，可通過(guò)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證所述陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)模板的可靠性。在步驟3)中，所述5’RACE過(guò)程中的各反應(yīng)產(chǎn)物可包括RACE克隆基因過(guò)程中的反 轉(zhuǎn)錄、加尾及5’ RACE第一輪PCR擴(kuò)增等一系列酶促反應(yīng)產(chǎn)物由此可見(jiàn)，通過(guò)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的比較分析，可實(shí)現(xiàn)從不同的樣品中迅速選擇出適合作為下一歩反應(yīng)的模板的目的。本發(fā)明是一種提高RACE過(guò)程中目的基因擴(kuò)增效率的有效方法，尤其是涉及在運(yùn)用RACE技術(shù)進(jìn)行基因克隆時(shí)，能快速、靈敏地檢測(cè)所用模板中目的基因有效拷貝數(shù)的ー種方法。本發(fā)明結(jié)合RT-PCR可半定量比較不同樣品間的mRNA水平這ー應(yīng)用思路，利用由已知序列的5’末端序列設(shè)計(jì)的引物TEST-F和TEST-R對(duì)各反應(yīng)步驟的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)條帶亮度，其結(jié)果可直觀地反應(yīng)每一反應(yīng)步驟成功與否或效率高低。特別是不同條件下進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增之后的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果具備巢式PCR特異及靈敏的優(yōu)點(diǎn)，能夠更快速地在不同反應(yīng)條件中尋找到影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的主效因子并獲得較適合的條件，進(jìn)而提高基因克隆成功率。以上方法主要針對(duì)難度較高的5’_RACE進(jìn)行說(shuō)明，即使目前有許多更好的RACE改進(jìn)方法出現(xiàn)，本發(fā)明所提及的檢測(cè)方法同樣適用于除上述所描述的經(jīng)典5’ -RACE以外的其他RACE方案中，乃至于涉及多步酶促反應(yīng)的其他相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。


圖I為赤點(diǎn)石斑魚(yú)肝與頭腎的總RNA 1%瓊脂糖膠電泳圖。在圖I中，M為DNA分子量標(biāo)記(DS 2000)，I表示頭腎總RNA，2表示肝總RNA。圖2為實(shí)施例中步驟4的檢測(cè)結(jié)果。在圖2中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為來(lái)源于肝組織的cDNA的檢測(cè)結(jié)果，2為來(lái)源于頭腎的cDNA的檢測(cè)結(jié)果。圖3為實(shí)施例中步驟8的檢測(cè)結(jié)果。在圖3中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為酒精沉淀法純化后的cDNA的檢測(cè)結(jié)果。圖4為實(shí)施例中步驟10的檢測(cè)結(jié)果。在圖4中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，Γ5的結(jié)果來(lái)自不同退火溫度下的產(chǎn)物，I為50°C，2為52°C，3為54°C，4為56°C，5為58°C。圖5為RACE第二輪擴(kuò)增后產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果。在圖5中，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I模板來(lái)自以50°C作為退火溫度的RACE第一輪PCR產(chǎn)物；2模板來(lái)自以58 °C作為退火溫度的RACE第一輪PCR產(chǎn)物；3模板來(lái)自以58°C作為退火溫度的RACE第一輪PCR產(chǎn)物；4為陽(yáng)性對(duì)照(R337 (5，-AGCCTCTCCCCCTTCCTCACTGT-3’)、R167 及 R43 分別與接頭引物 RA 配對(duì)，總共進(jìn)行三次半巢式PCR后的產(chǎn)物，其中，R337引物序列位置位于R167引物序列位置的外側(cè))；5為RA單引物陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以赤點(diǎn)石斑魚(yú)LECT2基因(Genbank登錄號(hào)⑶722597) 5’-RACE為例，本方法根據(jù)EST文庫(kù)中LECT2基因部分片段，在其近5’端設(shè)計(jì)檢測(cè)引物F43(5’-TGCCAGGGAAACCCCAGCAACAC-3’)；R167 (5，-CTGAGCCGTCCTGGCACGCAATG-3，)，擴(kuò)增121bp長(zhǎng)度片段。具體步驟如下實(shí)施例II)提取健康赤點(diǎn)石斑魚(yú)肝與頭腎的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，緩沖體系為O. 5XTBE，結(jié)果如圖I所示，5S、18S及28S條帶明顯，表明提取RNA質(zhì)量良好。2)根據(jù) TaKaRa 公司的 PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。3)利用引物F43和R167對(duì)步驟2的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，PCR反應(yīng)的25 μ L體系組成為10 XBuffer (含 Mg2+) 2. 5 μ L，dNTP(dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各 2. 5mM) O. 5 μ L，引物F47(10yM)和 R167 (10 μ Μ)各 O. 5 μ L，Taq 酶(2. 5U/μ L) O. 5 μ L，模板(步驟 3 的產(chǎn)物稀釋100倍)5 μ L，用雙蒸水補(bǔ)齊到25 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?5°C 5min — (94°C 30s, 52°C 30s，72°C 30s) X 30 — 72°C 5min。4)步驟3的結(jié)果經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，肝組織cDNA檢測(cè)產(chǎn)物出現(xiàn)較亮的目的條帶，如圖2所示，表明肝和頭腎RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均含有目的基因片段，但肝組織中的豐度較高，較有利于后續(xù)目的基因的克隆，因此，選擇肝臟cDNA作為克隆LECT2基因的模板。實(shí)施例2I)利用RNA酶對(duì)來(lái)源于肝組織的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的RNA進(jìn)行降解反應(yīng)。2)酒精沉淀法純化cDNA。3)利用引物F43和R167對(duì)步驟2的純化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)程序及體系組成同實(shí)施例I步驟4。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示，具有較亮的陽(yáng)性條帯，證明成功完成了純化步驟。實(shí)施例3I)以赤點(diǎn)石斑魚(yú)肝第一鏈cDNA為模板，利用TdT末端轉(zhuǎn)移酶和dATP進(jìn)行同聚物加尾。2)選擇 50°C、52°C、54°C、56°C、58°C 5 個(gè)退火溫度進(jìn)行 RACE 5’ 第一輪 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為特異性引物R167 (5，-CTGAGCCGTCCTGGCACGCAATG-3 ’)、接頭引物RA(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，)及帶 oligo-dT 的接頭引物 oligo-dT-RA，序列為 5’_AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC⑴3(IVN_3 ’。產(chǎn)物利用弓I物F43和R167以實(shí)施例I步驟4反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)后，經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖4所示，50°C及58°C擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)條帶最弱，其它幾個(gè)溫度梯度亮度則相對(duì)較強(qiáng)，說(shuō)明溫度為影響反應(yīng)結(jié)果的重要因素之一。此外，這種差異說(shuō)明RACE第一次PCR實(shí)現(xiàn)了有效擴(kuò)增，也同時(shí)證明了之前的同聚物加尾反應(yīng)已順利進(jìn)行。3)取步驟2的其中3個(gè)產(chǎn)物為模板(分別對(duì)應(yīng)退火溫度50°C、56°C及58°C)，利用嵌套特異性引物R43 (5’ -GCTGTCCGAACCTTACGGCATC-3’ )及接頭引物RA，以摸索出的較優(yōu)化的RACE第二輪PCR條件進(jìn)行擴(kuò)増，同時(shí)設(shè)置RA單引物陰性對(duì)照(即反應(yīng)體系中以DDW取代特異性引物R43，使最終體系中只含有RA單條引物)，結(jié)果如圖5所示，擴(kuò)增結(jié)果表明，獲得的目的條帶擴(kuò)増量上具有差別，其結(jié)果也印證了步驟2中的檢測(cè)結(jié)果，證明本發(fā)明所涉及的方法靈敏、有效。權(quán)利要求
1.一種提升基因克隆效率的方法，其特征在于包括以下步驟 1)根據(jù)預(yù)先獲得的目標(biāo)基因部分序列片段的5’端，設(shè)計(jì)I對(duì)引物TEST-F和TEST-R，該對(duì)引物需能夠特異地?cái)U(kuò)增出預(yù)先獲得的目標(biāo)基因部分序列片段的5’端，所擴(kuò)增片段要求位于5’ RACE第一輪PCR擴(kuò)增所使用特異性引物GSPl的上游； 2)制備陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)模板將引物TEST-F和TEST-R擴(kuò)增獲得的特異片段連接入PMD19-T質(zhì)粒中，獲得含有上述特異片段的PMD19-T重組質(zhì)粒，并以純化后的該重組質(zhì)粒作為檢測(cè)過(guò)程的陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)模板； 3)利用引物TEST-F和TEST-R，以5’RACE過(guò)程中的各反應(yīng)產(chǎn)物分別作為模板進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，并以步驟2)中的所述PMD19-T重組質(zhì)粒為模板設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，等體積的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I. 5%瓊脂糖電泳并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析； 4)若步驟3)中的擴(kuò)增結(jié)果均呈陰性，則表明是除5’RACE過(guò)程中的各反應(yīng)產(chǎn)物以外的其他反應(yīng)成分或反應(yīng)條件導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，可通過(guò)變更這些導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的因素來(lái)排除；若通過(guò)步驟3)檢測(cè)后，陽(yáng)性對(duì)照有較亮目的條帶，而對(duì)于被檢測(cè)的5’RACE過(guò)程中的各反應(yīng)產(chǎn)物，檢測(cè)結(jié)果呈陰性或條帶極微弱的表明其中不含有靶基因或靶基因有效拷貝數(shù)低，不適于后續(xù)的RACE擴(kuò)增；檢測(cè)結(jié)果顯示條帶亮度較高的則表明其中具有一定的靶基因有效拷貝數(shù)，由于靶基因的有效拷貝數(shù)越多，越有利于后續(xù)的RACE法克隆基因，而不同產(chǎn)物中有效拷貝數(shù)的量可根據(jù)檢測(cè)條帶的亮度進(jìn)行確定。
2.如權(quán)利要求I所述的一種提升基因克隆效率的方法，其特征在于在步驟I)中，所述目標(biāo)基因部分序列片段的5’端為靠近mRNA帶有7-甲基鳥(niǎo)嘌呤帽子結(jié)構(gòu)的一端。
3.如權(quán)利要求I所述的一種提升基因克隆效率的方法，其特征在于在步驟I)中，所述特異性引物GSPl是根據(jù)預(yù)先獲得的目標(biāo)基因部分序列設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物。
4.如權(quán)利要求I所述的一種提升基因克隆效率的方法，其特征在于在步驟2)中，通過(guò)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證所述陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)模板的可靠性。
5.如權(quán)利要求I所述的一種提升基因克隆效率的方法，其特征在于在步驟3)中，所述5’ RACE過(guò)程中的各反應(yīng)產(chǎn)物包括RACE克隆基因過(guò)程中的反轉(zhuǎn)錄、加尾及5’ RACE第一輪PCR擴(kuò)增一系列酶促反應(yīng)產(chǎn)物。
全文摘要
一種提升基因克隆效率的方法，涉及一種基因克隆方法。于目標(biāo)基因中間片段設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物；對(duì)RACE過(guò)程中不同來(lái)源的模板進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳分析，檢測(cè)產(chǎn)物陽(yáng)性條帶存在與否及其亮度，從而確定RACE待擴(kuò)增模板中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)水平，并確定RACE過(guò)程中各酶促反應(yīng)步驟的效率，獲得最適的用以5’RACE擴(kuò)增的模板，最終達(dá)到提高靶基因擴(kuò)增成功率的目的。是一種通過(guò)快速、靈敏地檢測(cè)不同來(lái)源模板中目的基因有效拷貝數(shù)，高效地選擇出RACE擴(kuò)增最適模板和條件的一種方法。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102660538SQ20121013676
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者丁少雄, 施曉峰, 王軍, 蘇永全 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)