專利名稱：柑橘潰瘍病的pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種柑橘潰瘍病的檢測方法，尤指一種檢測柑橘潰瘍病(Xanthomonasaxonopodis pv. citri)的PCR(聚合酶鏈式反應)方法。
背景技術：
柑橘潰瘍病(CirtusBacterial Canker Disease, CBCD)是一種在部分柑橘栽培地區嚴重發生的由地毪草黃單胞柑橘致病變種[Xanthomonas axonopodi spv. citrri (Hasse)Dye]所引起的檢疫性細菌病害。在自然條件下，該病菌可隨風雨傳播、擴散，主要侵染途徑為氣孔、皮孔或傷口，可侵染植物的葉片、葉莖、枝條以及果實，導致植物體的衰弱和枯死，嚴重的情況下能造成植株大量落葉、落果，甚至全株死亡；染病果實即使未脫落，也會在其表皮形成開裂、結疤狀潰瘍斑，大大降低果實的外觀、品相，對其銷售和出口造成不良影響。且該病菌傳播能力強，一旦在新區發生，則需要大量的人力物力進行防治，造成很大的經濟損失。目前，該病菌已經被列為我國進境和國內檢疫性有害生物。美國、巴西、阿根廷、土耳其、伊朗、西班牙、意大利等全球30多個許多國家和地區，都將其列為檢疫性有害生物，對柑橘潰瘍病菌實施檢疫，并禁止其出口和輸入。商業化生產中，柑橘潰瘍病近距離和中距離傳播的主要途徑是風雨、蟲害產生的傷口和植株之間的相互摩擦。此外，在果園管理維護中的嫁接、修剪、噴灌等人為活動也有利于柑橘潰瘍病在植株間的傳播。其遠距離傳播則主要通過種苗、接穗、砧木的運輸交易來實現，含細菌的包裝物、集裝箱、園藝工具也有一定的傳播可能。因此，建立快速、高效的柑橘潰瘍病菌檢測技術，是防治柑橘潰瘍病的重要基礎。目前，通過PCR技術檢測柑橘潰瘍病，主要是利用王中康等人根據柑橘潰瘍病菌全基因組中獨有的保守蛋白基因序列而篩選到特異引物(YF5 :5，-TTC GGC GTC AAC AAC CTG-3，JYR5 :5，-AAC TCC AGC ACA TACGGG TC-3’)。王中康等人建立的柑橘潰瘍病菌檢測方法雖然具有較高的靈敏度，但有時會擴增到3條大小不同的片段，影響了該引物的適用性。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種能準確鑒定柑橘潰瘍病的PCR檢測方法。該方法所使用的一對引物是基于柑橘潰瘍病菌的促旋酶B亞單位基因(gyrase subunit B)的核苷酸序列,本檢測方法所使用的這對引物有別于其它檢測技術。為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是一種柑橘潰瘍病的PCR檢測方法，該方法是以柑橘潰瘍病菌的特異性引物對待測樣品進行PCR擴增，最后電泳鑒定。該特異性引物為正向引物(XCGlF):5，-CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT-3’ (如 SEQID No 1 所示)，反向引物(XCG2R):5，-GGTTGACCGTGGTTTCCCATA-3’ (如 SEQID No 2 所示)。
上述特異性引物的設計是基于柑橘潰瘍病菌的促旋酶B亞單位基因(gyrasesubunit B)的核苷酸序列，PCR產物大小為750bp。對本發明方法詳細敘述如下一、引物設計本發明人利用原核生物進化過程中核酸序列的保守性，從NCBI搜索并下載柑橘潰瘍病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri strain ICMP 10022)的促旋酶 B 亞單位基因(gyrase subunit B)的核苷酸序列(序列號為EU499045),運用Premier軟件得到一些候選引物，最后通過篩選，設計出一對引物 引物I(XCGlF) :5，-CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT-3，引物2 (XCG2R) 5，-GGTTGACCGTGGTTTCCCATA-3，。將引物I和引物2分別經BLAST檢索，見下表I及表2，結果表明，與引物I和引物2的序列100%覆蓋且100%相同的全部是柑橘潰瘍病菌的核苷酸序列。表I柑橘潰瘍病菌引物I (XCGlF)的BLAST結果
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權利要求
1.一種柑橘潰瘍病的PCR檢測方法，其特征在于該方法是以柑橘潰瘍病菌特異性引物對待測樣品進行PCR擴增，最后電泳鑒定；該特異性引物為 正向引物5’ - CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT -3’ 反向引物5’ - GGTTGACCGTGGTTTCCCATA -3’。
2.如權利要求I所述的柑橘潰瘍病的PCR檢測方法，其特征在于所述特異性引物的設計是基于柑橘潰瘍病菌的促旋酶B亞單位基因的核苷酸序列，PCR產物大小為750bp。
全文摘要
一種柑橘潰瘍病的PCR檢測方法，是以柑橘潰瘍病菌特異性引物對待測樣品進行PCR擴增，最后電泳鑒定；該特異性引物是基于柑橘潰瘍病菌的促旋酶B亞單位基因(gyrase subunit B )的核苷酸序列設計的。本檢測方法所使用的這對引物有別于其它檢測方法，可以用于快速檢測出柑橘潰瘍病。
文檔編號C12R1/64GK102634603SQ20121014336
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者戴良英, 易圖永, 楊泓威, 肖啟明 申請人:湖南農業大學