專利名稱：一種柑橘潰瘍病菌侵染過程實時觀察方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種柑橘潰瘍病菌侵染過程觀察方法，尤其是涉及一種利用增強型綠色熒光蛋白基因egfp對柑橘潰瘍病菌進行標記，實現(xiàn)對柑橘潰瘍病菌侵染過程進行實時觀察的方法。
背景技術：
對柑橘潰瘍病菌入侵途徑的傳統(tǒng)研究手段，主要是掃描電鏡和透射電鏡兩種觀察方法，但是，這兩種方式均費時、費力，且不能實時地進行跟蹤。
利用綠色熒光蛋白基因?qū)Σ≡M行標記，可以對病原菌進行快速、原位、實時、 活體的觀察，有利于觀察病原菌的入侵過程和了解病原菌與寄主的互作。
目前，國內(nèi)外已有不少利用熒光標記這一手段對病原菌進行標記，從而觀察植物病原菌與寄主互作的報道。
但是，在柑橘潰瘍病菌的研究中，由于多種原因，目前僅限于將綠色熒光蛋白基因作為報告基因與目的基因融合，以輔助研究目的基因。迄今為止，尚無利用綠色熒光蛋白標記對柑橘潰瘍病菌侵染過程進行實時觀察的報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是，克服現(xiàn)有技術使用掃描電鏡和透射電鏡等費時費力的不足，提供一種操作簡便快捷的柑橘潰瘍病菌侵染過程實時觀察方法。
本發(fā)明解決所述技術問題所采用的技術方案是，一種柑橘潰瘍病菌侵染過程實時觀察方法，包括以下步驟(1)利用三親本雜交法將廣泛寄主載體PMPM63上的基因?qū)胍吧透涕贊儾【挂吧蜐儾【诓粏适渲虏∧芰Φ那闆r下能產(chǎn)生綠色熒光蛋白，這種EGFP在紫外光激發(fā)下可經(jīng)熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡檢測到綠色熒光信號，從而獲得EGFP標記的潰瘍病菌；(2)將步驟(1)所得EGFP標記的潰瘍病菌通過噴霧方式接種到柑橘葉片表面及通過注射方式接種到柑橘葉肉間隙；(3)于不同的時間點撕取葉表皮或者利用冷凍切片等快速制樣方法制樣，EGFP標記的潰瘍病菌在激發(fā)光的激發(fā)下呈綠色，通過激光共聚焦顯微鏡觀察柑橘潰瘍病菌在葉片表面及葉肉間隙的數(shù)量和分布。
采用本發(fā)明，能夠利用EGFP標記的柑橘潰瘍病菌對該病原菌在侵染柑橘過程中的附著、繁殖和空間分布進行實時觀察，從而獲得柑橘潰瘍病與柑橘互作的時空關系；不同柑橘品種對該病原菌的抗病性也能得到直觀體現(xiàn)；操作簡便、快捷。


圖1是野生型和EGFP標記的柑橘潰瘍病菌菌株熒光顯微鏡觀察到的形態(tài)及活體針刺接種后的癥狀圖；圖2是EGFP標記的潰瘍病菌侵染冰糖橙葉片的過程圖。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。 實施例
本實施例包括以下步驟(1)利用三親本雜交法將供體菌大腸桿菌DH5 α所含廣泛寄主載體ΡΜΡΜ63上的基因?qū)胍吧透涕贊儾【@得EGFP標記的潰瘍病菌；經(jīng)EGFP標記的柑橘潰瘍病菌在紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，經(jīng)熒光顯微鏡檢測到綠色熒光信號，被EGFP標記的柑橘潰瘍病菌，其生長動力學及致病力較野生型沒有顯著差異；所述三親本雜交法使用的供體菌大腸桿菌DH5 α (含egfp質(zhì)粒pMPM63，該質(zhì)粒具有慶大霉素抗性)由華中農(nóng)業(yè)大學微生物重點實驗室提供；輔助菌大腸桿菌DH5 α冶mob 位點的質(zhì)粒PRK2013，該質(zhì)粒具有卡那霉素抗性)由意大利卡塔尼亞大學Vittoria Catara 教授提供；受體菌黃單胞桿菌柑橘致病變種Xac DL509 (Janthomonas axonopodis pv. ciiriXac DL509，具氨芐青霉素抗性)由本發(fā)明者分離得到，該菌株于2012年2月M日保藏于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M 2012034。
(2)將步驟(1)所得EGFP標記的潰瘍病菌通過噴霧方式接種到冰糖橙葉片表面及通過注射方式接種到冰糖橙葉肉間隙；(3)于不同的時間點撕取葉表皮或者利用冷凍切片等快速制樣方法制樣，EGFP標記的潰瘍病菌在激發(fā)光的激發(fā)下呈綠色，通過激光共聚焦顯微鏡可觀察潰瘍病菌在冰糖橙葉表面及葉肉間隙的數(shù)量和分布情況。
熒光觀察所用顯微鏡型號為Nikon SMZ1000。
冰糖橙潰瘍病菌在葉片表面及葉肉間隙的數(shù)量和分布情況觀察所用激光共聚焦顯微鏡型號為Zeiss LSM 710。
圖1中A為EGFP標記的柑橘潰瘍病菌菌株在Nikon SMZ1000顯微鏡明場下的形態(tài)；B為EGFP標記的柑橘潰瘍病菌菌株在Nikon SMZ1000顯微鏡紫外激發(fā)光下的形態(tài)(帶綠色熒光菌落，菌落形態(tài)清晰可見);C為EGFP標記的柑橘潰瘍病菌活體針刺接種后的癥狀; D為野生型柑橘潰瘍病菌菌株在Nikon SMZ1000顯微鏡明場下的形態(tài)；E為野生型柑橘潰瘍病菌菌株在Mkon SMZ1000顯微鏡紫外激發(fā)光下的形態(tài)(非綠色熒光菌落，菌落形態(tài)不清晰)；F為野生型柑橘潰瘍病菌活體針刺接種后的癥狀。
圖2中A為噴霧接種冰糖橙葉面后M小時觀察到潰瘍病菌的分布情況(菌體為白色箭頭所指);B為噴霧接種6天時葉面潰瘍病菌的分布情況(菌體為白色箭頭所指);C為 B的局部放大圖(菌體為白色箭頭所指);D為注射接種2天后冰糖橙葉片葉肉間隙潰瘍病菌數(shù)量少，葉肉細胞保持正常均勻排列；E為注射接種4天后冰糖橙葉片葉肉間隙潰瘍病菌擴散至柵欄組織，葉肉細胞開始出現(xiàn)不規(guī)則；F為注射接種14天后冰糖橙葉片葉肉間隙全被潰瘍病菌占據(jù)，葉肉細胞全部瓦解。
從圖2可見，觀察EGFP標記的潰瘍病菌與感病冰糖橙互作的時空關系，接種前期24小時冰糖橙葉片表面的潰瘍病菌數(shù)量少，接種6天以后葉片表面聚集大量潰瘍病菌，細菌分布于氣孔及氣孔以外的區(qū)域；對于葉肉間隙，接種2天內(nèi)，潰瘍病菌數(shù)目少，主要分布在海綿組織，此時海綿組織細胞規(guī)則排列；接種4天時，細菌已經(jīng)擴散至柵欄組織，且數(shù)量極顯著增加，海綿組織葉綠體分布出現(xiàn)不規(guī)則形狀；接種14天時，細菌占據(jù)了整個葉肉間隙，海綿組織葉綠體細胞全部瓦解。
權利要求
1.一種柑橘潰瘍病菌侵染過程實時觀察方法，其特征在于，包括以下步驟(1)利用三親本雜交法將廣泛寄主載體PMPM63上的增強型綠色熒光蛋白基因egfp基因?qū)胍吧偷母涕贊儾【@得增強型綠色熒光蛋白EGFP標記的潰瘍病菌；(2)將步驟(1)所得EGFP標記的潰瘍病菌通過噴霧方式接種到柑橘葉片表面及通過注射方式接種到柑橘葉肉間隙；(3)撕取葉表皮或者利用冷凍切片方法制樣，在激光共聚焦顯微鏡下觀察柑橘潰瘍病菌在葉片表面及葉肉間隙的數(shù)量和分布情況。
全文摘要
一種柑橘潰瘍病菌侵染過程實時觀察方法，包括以下步驟(1)利用三親本雜交法將廣泛寄主載體pMP2463上的增強型綠色熒光蛋白基因(egfp)導入野生型柑橘潰瘍病菌，獲得增強型綠色熒光蛋白(EGFP)標記的潰瘍病菌；(2)將獲得的EGFP標記的柑橘潰瘍病菌通過噴霧方式接種到柑橘葉片表面，通過注射方式接種到柑橘葉肉間隙；(3)撕取葉表皮或者利用冷凍切片方法制樣，在激光共聚焦顯微鏡下觀察柑橘潰瘍病菌在葉表面及葉肉間隙的數(shù)量和分布情況。采用本發(fā)明，能夠利用EGFP標記的柑橘潰瘍病菌對該病原菌在侵染柑橘過程中的附著、繁殖和空間分布進行實時觀察，從而獲得柑橘潰瘍病與柑橘互作的時空關系；且操作簡便，快捷。
文檔編號C12R1/64GK102559843SQ20121005262
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月2日 優(yōu)先權日2012年3月2日
發(fā)明者劉利平, 李大志, 李建揮, 鄧子牛, 龍桂友 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學