專利名稱：一種來源于新疆沙冬青的i型液泡膜焦磷酸酶的基因序列及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因及其對應(yīng)編碼的氨基酸，此外本發(fā)明也涉及到這些基因的克隆方法。
背景技術(shù)：
新疆沙冬青新疆沙冬青(Ammopiptanthus nanus Cheng f.)又名矮沙冬青、小沙冬青、矮黃花木，屬于豆科(Leguminosae)、黃華族(Thermopsideae)、沙冬青屬(Ammopiptanthus Cheng f.),為第三紀孑遺植物,被列為國家一級保護植物。主要分布在海拔1800 2800m的干旱荒山和石質(zhì)戈壁類型的內(nèi)蒙古西部和寧夏、甘肅、新疆的部分沙 漠、荒漠地帶，是該區(qū)唯一的常綠闊葉灌木，分布區(qū)內(nèi)氣候干旱，降水量遠小于蒸發(fā)量，年平均氣溫6. 8°C，氣溫變化極值可達70°C以上。沙冬青具有很強的抗逆性，在相對瘠薄的土壤條件下仍能在高達70°C左右的地表沙溫和低至零下20°C 30°C的環(huán)境中正常生長發(fā)育。有很強的抗寒、抗旱和耐鹽堿等抗逆特性。國內(nèi)外關(guān)于沙冬青屬植物的報道包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱機理及相關(guān)的超微結(jié)構(gòu)；染色體數(shù)目及核型、減數(shù)分裂期染色體行為、開花物候、和引種栽培試驗等。這些研究都證實了沙冬青抗旱耐凍的特性，因此它是珍貴的抗旱耐凍遺傳資源。I型液泡膜焦磷酸酶是由單個亞基組成的位于液泡膜上利用焦磷酸鹽(PPi)勢能作為能量在細胞內(nèi)部各個腔室形成質(zhì)子梯度的蛋白。I型液泡膜焦磷酸酶基因的表達與非生物脅迫有關(guān)，能提高植物耐鹽和干旱脅迫的耐受力型液泡膜焦磷酸酶能夠調(diào)節(jié)植物激素的轉(zhuǎn)運，進而調(diào)節(jié)由這些植物激素所介導的生長發(fā)育過程，并且受到植物激素(如，脫落酸)的調(diào)控。新疆沙冬青作為優(yōu)秀的抗逆植物，克隆以上抗逆基因?qū)A(chǔ)和應(yīng)用研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是針對荒漠抗逆植物新疆沙冬青的抗逆基因開發(fā)研究的局限性，提供來源于植物新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列及其開放閱讀框序列，以期應(yīng)用于其它轉(zhuǎn)基因作物中使之具有相應(yīng)的優(yōu)良的抗逆性能。本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述基因序列的克隆方法。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種來源于新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，該序列具有如SEQ IDNO. I所述的核苷酸序列以及該基因?qū)?yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。上述核苷酸序列，可通過包括下述步驟的方法，從植物新疆沙冬青葉片中提取總RNA、設(shè)計引物、進行PCR擴增、測序等克隆得到(I)總RNA的提取和純化
可采用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物新疆沙冬青葉片中提取得到純化的新疆沙冬青葉片總RNA;常用的RNA提取方法很多，如試劑盒法、熱硼酸法、異硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸鈉法、十六烷基三甲基溴化銨法、及各種改進方法等，均可用于新疆沙冬青葉片總RNA的提取；本發(fā)明中可優(yōu)選試劑盒法(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAot2. O提取試劑盒，CAT#90404-50)，進行新疆沙冬青葉片總RNA提取。純化主要是為了去除總RNA中的DNA污染，獲得純化的新疆沙冬青葉片總RNA，以滿足后續(xù)對目的基因的表達進行定量檢測等需要。常用的RNA純化方法包括DNA酶消化法(簡稱D法)、酸酚變性法(簡稱S法)、EDTA法(簡稱E法)等；本發(fā)明中可優(yōu)選DNA酶(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAqut2. O提取試劑盒，CAT#90404-50)消化法。
(2)中間片段的克隆A、中間片段cDNA第一鏈的合成以上述步驟(I)純化的新疆沙冬青葉片總RNA作為模板，使用TaKaRa公司3' -Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code D314)試劑盒中 3' RACE Adaptor 進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的模板；B、PCR 擴增以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為模板，利用下述兼并上游引物(jf3)和兼并下游引物(jx3)，進行PCR擴增。I型液泡膜焦磷酸酶基因中間片段擴增引物jf3 5/ -GGTCTTCTATGGCTTTGTTYGG-3'，jx3 5/ -TRGCAGARAACCAGTAAGGRAG-3'；擴增得到新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因cDNA中間片段，通過克隆測序，得到中間片段序列。本步驟中，擴增體系可優(yōu)選為TaqPlusPCR Master Mix20 μ L,cDNA 模板2 μ L，2X 引物(jx3/jf3)I μ L，ddH2016 μ L。擴增程序可優(yōu)選為95 °C, 3min ；95°C，30s, 58。。，30s, 72°C，Imin (35 個循環(huán))；72°C，8min ;4°C 保溫。(3)3'端的克隆C、3' -outer PCR 擴增根據(jù)上述步驟(2)得到的中間片段序列，設(shè)計并合成特異性上游引物GSP3-3' outer,以前述步驟(2) A所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上游引物GSP3-3' -outer 和 TaKaRa 公司 3' Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code D314)試劑盒中3'端下游引物3' RACE outer,進行3'端outer PCR擴增:I型液泡膜焦磷酸酶基因3'端的特異性上游outer引物
GSP3-3' -outer :5' -TCGCTGTTGGTCTCTGGGCAGGGCTTAT-3'；3'端下游引物 3' -RACE outer 3' -RACE outer 5/ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'；擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 3'端；本步驟中，擴增體系可優(yōu)選為IXcDNA Dilution Buffer II8 μ L,cDNA 模板2yL，2X 引物(GSP3-3, -outer/3' -RACE-outer)I μ L,10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2 (25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq(5U/μ I)0. 25 μ L,ddH2028. 75 μ L0擴增程序可優(yōu)選為95 °C, 3min ；95°C，30s ；55°C, 30s ；72°C，Imin 30s (35 個循環(huán))72°C, 8min ；4°C 保溫。D、3' -inner PCR 擴增根據(jù)前述步驟⑵所得中間片段端序列，設(shè)計并合成特異性上游引物GSP3-3;-inner，以前述步驟C所得:V端的outer PCR產(chǎn)物模板，利用特異性上游引物GSP3-3'-inner 和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)試劑盒中3'端下游引物3' -RACE inner,進行3'端inner PCR擴增I型液泡膜焦磷酸酶基因3'端的特異性上游inner引物GSP3-3/ -i nner 5/ -CCATTGGTTCTGCCGCCCTTGTGTCTTT-3'；3'端下游引物 3' -RACE inner 3' -RACE i nner :5' -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'；擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 3'端inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測序，得到3'端完整序列；本步驟中，擴增體系可優(yōu)選為dNTP Mixture (2. 5mM each)8 μ L,31 -outer PCR 產(chǎn)物2 μ L,2X 引物(GSP3-3, -inner/3' -RACE-inner)I μ L,10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2(25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq(5U/μ I)0. 25 μ L,ddH2028. 75 μ L0擴增程序可優(yōu)選為95 °C, 3min ；
、
95°C，30s ；55°C, 30s ；72°C，Imin 30s (35 個循環(huán))72°C,8min ;4°C保溫。
(4)5'端的克隆E、合成5'端的cDNA第一鏈以上述步驟(I)純化的新疆沙冬青葉片總RNA作為模板，經(jīng)過Ambion公司FirstChoice RLM-RACE Kit，SKU# :AM1700 試劑盒對 RNA 處理，加入下述 5' RACE Adapter后，以Random Decamers進行反轉(zhuǎn)錄5 ' RACE Adapt er :5 , -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAk-3'；
合成得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5'端的cDNA第一鏈；F、5' -outer PCR 擴增根據(jù)上述步驟(2)得到的中間片段序列，設(shè)計并合成特異性下游引物GSP3-5' -outer,以前述步驟E所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下游引物 GSP3-5' -outer 和FirstChoice RLM-RACE Kit 試劑盒中的 5'端上游引物 5' -RACEouter,進行 5'端 outer PCR 擴增I型液泡膜焦磷酸酶基因5'端的特異性下游outer引物GSP3-5' -outer 5/ -TAAGCAAGCAAACAAGGATACCCACAG-3'；5'端上游引物 5' -RACE outer 5' -RACE outer 5/ -GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3'；擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 5'端；本步驟中，擴增體系可優(yōu)選為
cDNA 模板IyL
10X PCR Buffer5 μ L
dNTP Mix4 μ L
2X 引物(GSP3-5,-outer/5'-RACE outer)2 μ L
ThermostabLe DNA poLymerase(0. 25 μ L of 5U/μ L) I.25 μ L
ddH2034.75 μ L。擴增程序可優(yōu)選為95 °C, 3min ；95°C，30s ；60°C，30s ；72°C，lmin/kbp (35 個循環(huán))；72°C，8min ;12°C保溫。G、5' -inner PCR 擴增根據(jù)前述步驟(2)所得中間片段序列，設(shè)計并合成特異性下游引物GSP3-5; -inner，以前述步驟F所得Y端的outer PCR產(chǎn)物模板，利用特異性下游引物GSP3-5' -inner和FirstChoice RLM-RACE Kit試劑盒中 5'端上游引物5' -RACE inner,進行5 ’端inner PCR擴增I型液泡膜焦磷酸酶基因5'端的特異性下游inner引物GSP3-5' -inner 5/ -GGAAGCAACAACGAGAGCGGCACAGGA-3'；
5'端上游引物 5' -RACE inner 5' -RACE i nner 5/ -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3'；擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 5'端inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測序，得到5'端完整序列；本步驟中，擴增體系可優(yōu)選為
5'-outer PCR 產(chǎn)物I μ L
IOX PCR Buffer5 μ L
dNTP Mix4 μ L
2X 引物(GSP3-5'-inner/5^-RACE inner)2 uL
ThermostabLe DNA poLymerase(0. 25 μ L of 5U/μ L) I. 25 μ L
ddH2034. 75 μ L。擴增程序可優(yōu)選為95 °C, 3min ；95°C，30s ；60°C，30s ；72°C，lmin/kbp (35 個循環(huán))；72°C，8min，12°C 保溫。(5)全長序列拼接和基因分析將上述步驟⑵所得中間片段、步驟(3)所得3'端inner PCR擴增序列和述步驟
(4)所得5'端inner PCR擴增序列用DNAman軟件進行完整序列的拼接，然后通過NCBI里ORF finder工具分析開放閱讀框，即完整的基因序列。(6) I型液泡膜焦磷酸酶基因的克隆將上述步驟(5)所分析的完整基因序列作為模板，設(shè)計上游引物0RF3-S和下游引物0RF3-A，并進行PCR擴增I型液泡膜焦磷酸酶基因擴增引物0RF3-S 5/ -ATGGGTGCAGCCATTCTCCC-3'，0RF3-A 5/ -TTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACCATG-3;；擴增得到的產(chǎn)物為完整的新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，通過克隆測序，即得其基因序列。本步驟中，擴增體系可優(yōu)選為dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ L,2 X 引物(0RF3-S/0RF3-A)I μ L，cDNA 模板lyL，5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)10 μ L,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2. 5U/ μ L) 0. 5 μ L,ddH2032. 5 μ L0I型液泡膜焦磷酸酶基因擴增程序可優(yōu)選為98°C,30s ；62°C,30s ；72°C,2min 30s (35 個循環(huán))；
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明是一種來源于植物新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列是新的基因序列，使人們對這些基因的研究對象從細菌及其他植物體進一步擴展到新疆沙冬青。并且，根據(jù)在新疆沙冬青植物的這些基因所具備的優(yōu)良的抗旱、耐鹽等性能可以預(yù)料如果將其通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導入玉米等其他植物的基因中，將可培育出具有相應(yīng)的優(yōu)良的抗旱、耐鹽等性能的植物新品種。


圖I為AnVPl基因電泳檢測結(jié)果圖，圖2為AnVPl基因中間片段電泳檢測結(jié)果圖， 圖3為AnVPl基因3'端inner PCR電泳檢測結(jié)果圖，圖4為AnVPl基因5'端inner PCR電泳檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容作進一步的詳細描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實施例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在下述各實施例中，將新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶簡稱為AnVPl。通過各實施例，最終得到來源于新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶核苷酸序列(如SEQ ID NO. I所述)及其對應(yīng)的氨基酸序列(如SEQ ID NO. 2所述)。實施例I本實施例為新疆沙冬青葉片總RNA的提取和純化，總RNA提取使用北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAOUIVci提取試劑盒，CAT#90404-50，包括下述步驟(I)估算組織細胞的用量。每次微量提取一般需要100-200mg植物葉片或50-100mg植物種子或200-500mg植物果實。 (2)先將新鮮植物組織剪切成小塊(保存在RNAL0CKER中的植物組織需用紙吸去RNAL0CKER液體后再剪切成小塊)，放入10_15mL塑料離心管中，加入ImL 65°C預(yù)熱的溶液A(用前需要搖晃混勻)，然后用勻漿器勻漿5-20秒。勻漿時會產(chǎn)生泡沫，但不影響提取效果。也可以使用液氮硯磨法破碎植物組織，硯磨完后加入ImL溶液A,但效果比較差，因為研缽本質(zhì)是二氧化硅，在溶液A存在時會吸附RNA。(3)將勻漿物或硯磨物轉(zhuǎn)移至干凈的I. 5mL塑料離心管中(可以不必轉(zhuǎn)移非液體的細胞碎片)。有的植物組織(比如果實)含有大量水份，勻漿液會多于lmL，轉(zhuǎn)移時也只取 ImL。(4)在離心管中加入O. 3mL的溶液B和O. 2mL自備氯仿，在振蕩器上振蕩30秒混勻，此時溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。(5)室溫12000rpm離心3-5分鐘，兩相間有約5mm厚的細胞破碎物。(6)將上清液(約0.6mL)轉(zhuǎn)移到另一干凈的I. 5mL塑料離心管中，下層有機相和中間層含有DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，避免觸及或吸取。最好留下IOOuL上清液不取。
(7)加入等體積的溶液C，充分顛倒混勻。(8)將一半溶液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱(60911B)中，12000rpm室溫離心半分鐘，棄穿透液。注意不要跟用于RNA提取的吸附柱(60911D)混用。(9)將剩下的一半溶液轉(zhuǎn)移到同一離心吸附柱中，12000rpm室溫離心半分鐘，棄
穿透液。(10)將O. 7mL通用洗柱液加入到離心吸附柱中，12000rpm室溫離心10-30秒，棄
穿透液。(11) 12000rpm室溫離心10秒以便去除殘留液體。 (12)將 IOuL(IOU)的 RNase-free DNase 加入到 50uL37°C預(yù)熱的DNA膜反應(yīng)液中，吹打混勻配制成DNase工作液。(13)將DNase工作液在37°C預(yù)熱I分鐘，然后全部加入到離心吸附柱中，室溫放置5分鐘。注意5分鐘一般足夠降解大多數(shù)情況下的DNA污染。如果DNA沒有徹底降解(可能由于樣品中殘留的雜質(zhì)抑制了 DNase的活性)，此步的保溫時間可以適當延長到10分鐘或15分鐘。(14)直接在離心吸附柱中加入O. 7mL通用洗柱液，蓋上蓋后顛倒數(shù)次混勻。(15) 12000rpm室溫離心半分鐘,棄穿透液。(16)再加O. 3mL通用洗柱液到離心吸附柱，12000rpm室溫離心半分鐘,棄穿透液。(17) 12000rpm室溫離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留乙醇會影響RNA的使用。(18)將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到RNase-free收集管中，加入30_50uL RNA洗脫液，室溫放置1-2分鐘。(19) 12000rpm室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品。本產(chǎn)品提供的離心吸附柱吸附力較強，一次洗脫不能全部將膜上RNA洗下，如有必要，可以再加入30-50uLRNA洗脫液一次。實施例2本實施例為新疆沙冬青總RNA的反轉(zhuǎn)錄，其反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈用于基因中間片段和3'端擴增的模板，按照Takara公司的3' -Full RACE Core Set Ver. 2. 0, Code D314試劑盒說明書進行cDNA第一鏈合成。實施例3本實施例為AnVPl基因中間片段的克隆，方法如下以蒺藜苜蓿(FJ176929. I)為詢問序列，參考百脈根(EF440187. I)、綠豆(AB009077. I)、大豆(AK285283. I)和豇豆(U31467. I)序列設(shè)計兼并引物 jf3/jx3 jf3:5' -GCCCAAARGAGCTTTCACTY-3 ；jx3:5' -GAAGMARGTGACCRGGAAGG-3'。以實施例2的cDNA第一鏈為模板，以設(shè)計的兼并引物jf3和jx3進行AnVPl基因cDNA中間片段的擴增。TaqPlusPCR Master Mix20 μ L
cDNA 模板2 μ L擴增體系為
2Χ引物(jx3/jf3)I UL
ddH2016 μ L擴增程序為95°C，5min；95°C，30s，58°C，30s，72t，lmin(35 個循環(huán))；
72°C，8min ;4°C 保溫。取所得擴增產(chǎn)物20 μ L經(jīng)I %非變性瓊脂糖凝膠100V電泳30min，GoLdenView染色后紫外線檢測擴增片段，結(jié)果如圖2所示。擴增得到的產(chǎn)物為AnVPl基因cDNA中間片段，通過包括下述步驟的方法克隆測序，得到的中間片段序列如SEQ ID NO. 3所述①目的片段的回收與純化將擴增出來的特異條帶用干凈刀片在紫外光下快而準確的從瓊脂糖中挖出，置于I. 5mL離心管中，用凝膠回收試劑盒(OMEGA公司的E. Z. N. A. TM GeL Extraction Kit)回收膠中的DNA片段；②連接反應(yīng)將回收的DNA片段克隆于TaKaRa公司的pMD19_T載體中。連接反應(yīng)采用連接試劑盒(Takara公司)，擴增體系總體積10 μ L，16°C連接過夜；③感受態(tài)細胞的制備I、從LB平板上挑取新活化的E. coLi DH5 α單菌落，接種于3_5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C，225r/min振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以I : 100-1 50的比例接種于IOOmL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)2_3h至0D600 = O. 35-0. 5左右；II、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管，冰上放置lOmin，然后于4°C下3000r/min離心IOmin ；III、棄去上清，用預(yù)冷的O. 05moL/L的CaCL2溶液IOmL輕輕懸浮細胞，冰上放置15_30min 后，4°C下 3000r/min 離心 IOmin ； IV、棄去上清，加入4mL預(yù)冷含15%甘油的O. 05moL/L的CaCL2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細胞懸液；V、感受態(tài)細胞分裝成100μ L的小份，貯存于-70°C可保存半年；④質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化I、從_80°C冰箱中取出一管大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5ci，置于冰上融化；II、在無菌條件下加入10 μ L連接反應(yīng)液，輕輕震搖混勻后，在冰上放置30min ；
III、42°C水浴熱擊90s，不要搖動，之后迅速放入冰浴冷卻2_3min ；IV、加入890 μ L無Amp的LB液體培養(yǎng)基，混勻后，37°C、150r/min搖床振搖培養(yǎng)，溫育Ih ；V、取100 μ L已轉(zhuǎn)化的菌液涂于一個LB/Amp的培養(yǎng)平板上，正面朝上放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，用封口膜封住，然后倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，37°C避光培養(yǎng)12-16h ;隨后篩選陽性菌落；⑤重組菌落的鑒定與保存
從外觀上看，一般白色且圓的菌落為陽性，通過菌液PCR進一步鑒定I、在過夜培養(yǎng)的平板上用滅菌的小槍頭挑取幾個白色菌落，分別點種于含O. lg/LAmp的LB液體培養(yǎng)基的I. 5mL離心管中，37°C，150r/min振搖培養(yǎng)4_6h ；II、取I μ L菌懸液作為模板，用引物jfl/jxl進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件中裂解時間延長至5min，用I %的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。如果產(chǎn)物為目的條帶時，此菌落為陽性克隆，否則為陰性。同時設(shè)不加菌懸液的陰性對照；III、取已經(jīng)鑒定的陽性克隆的菌落懸浮液750 μ L，加入250 μ L的滅菌甘油，混勻后，用液氮速凍，置于-80°C冰箱中保存?zhèn)溆?；IV、最后送英俊生物技術(shù)公司測序，所得序列在NCBI的BLastn進行比對分析，驗證克隆片段是否正確。
實施例4本實施例為AnVPl基因3'端的克隆，方法如下(1)3/ -outer PCR 擴增根據(jù)實施例3得到的中間片段序列，設(shè)計并合成特異性上游引物GSP3-3' outer,以實施例2所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上游引物GSP3-3' -outer和 TaKaRa 公司 3' Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code :D314)試劑盒中 3'端下游引物3' -RACE outer,進行 3'端 outer PCR 擴增GSP3-3/ -outer :5' -TCGCTGTTGGTCTCTGGGCAGGGCTTAT-3'；3' -RACE outer 5/ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'；擴增體系為IXcDNA Dilution Buffer II8 μ L,cDNA 模板2yL，2X 引物(GSP3-3, -outer/3' -RACE-outer)I μ L,10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2 (25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq (5U/ μ I)0. 25 μ L,ddH2028. 75 μ L0擴增程序為95 °C, 3min ；95°C, 30s ；55°C, 30s ；72°C, Imin 30s (35 個循環(huán))72°C,8min ； 4°C保溫。(2) 3' -inner PCR 擴增根據(jù)實施例3得到的中間片段序列，設(shè)計并合成特異性上游引物GSP3-3' inner,以上述(I)所得outer PCR產(chǎn)物為模板，利用特異性上游引物GSP3-3' -inner和TaKaRa公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)試劑盒中 3'端下游引物 3' RACEinner,進行 3'端 inner PCR 擴增GSP3-3' -inner 5/ -CCATTGGTTCTGCCGCCCTTGTGTCTTT-3'；3' -RACE inner 5/ -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3 ；擴增體系為
dNTP Mixture (2. 5mM each)8 μ L,cDNA 模板2 μ L，2X 引物(GSP3-3, -inner/3' -RACE-inner) I μ L,10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2 (25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq (5U/ μ I)0. 25 μ L,ddH2028. 75 μ L0
擴增程序為95 °C, 3min ；95°C, 30s ；60°C, 30s ；72°C, Imin 30s (35 個循環(huán))；72°C，8min ;4°C 保溫。取所得擴增產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示。擴增得到的產(chǎn)物為AnVPl基因3 ^端cDNA完整序列inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測序(同實施例3)，得到的3'端cDNA完整序列如SEQ ID NO. 4所述。實施例5本實施例為5^端擴增的cDNA第一鏈合成以實施例I純化的新疆沙冬青葉片總RNA作為模板，經(jīng)過Ambion公司FirstChoice RLM-RACE Kit，SKU# :AM1700 試劑盒對 RNA 處理，加入下述 5' RACE Adapter后，以Random Decamers進行反轉(zhuǎn)錄5 ' RACE Adapt er :5 , -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAk-3'；合成得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5'端的cDNA第一鏈；實施例6本實施例為AnVPl基因5'端的克隆，包括下述步驟(I) 5' -outer PCR 擴增根據(jù)實施例3得到的中間片段序列，設(shè)計并合成特異性下游引物GSP3-5'-outer,以實施例5所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下游引物GSP3-5'-outer 和試劑盒FirstChoice RLM-RACE Kit，SKU# :AM1700 中上游引物5' -RACEouter,進行 5'端 outer PCR 擴增GSP3-5' -outer 5/ -TAAGCAAGCAAACAAGGATACCCACAG-3'；5' -RACE outer 5/ -GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3'；擴增體系為cDNA 模板I μ L
IOX PCR Buffer5 μ L
dNTP Mix4 μ L
2X引物(GSP3-5,-outer/5'-RACE outer)2 uL
ThermostabLe DNA poLymerase(0. 25 μ L of 5 U/μ L)I. 25 μ L
ddH2034. 75 μ L。擴增程序為95 °C, 3min ；95°C，30s ；60°C，30s ；72°C，2min 30s (35 個循環(huán))；72°C，8min ;12°C保溫。(2) 5' -inner PCR 擴增根據(jù)實施例3得到的中間片段序列，設(shè)計并合成特異性下游引物GSP3-5丨-inner,以上述⑴所得outer PCR產(chǎn)物為模板，利用特異性下游引物GSP3-5' -inner和試劑盒FirstChoice RLM-RACE Kit，SKU# :AM1700 中上游引物5' -RACEinner,進行 5'端 inner PCR 擴增GSP3-5' -inner 5/ -GGAAGCAACAACGAGAGCGGCACAGGA-3;；5' -RACE inner 5/ -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3 ；擴增體系為
b' -outer PCR 產(chǎn)物IuL
10X PCR Buffer5 μ L
dNTP Mix4 μ L
2Χ引物(GSP3-5'-inner/5^-RACE inner)2 yL
ThermostabLe DNA poLymerase(0. 25 μ L of 5U/μ L) I.25 μ L
ddH2034.75 μ L。擴增程序為95°C，3min;95°C，30s ；60°C，30s ；72°C，2min 30s (35 個循環(huán))；72°C，8min ;12°C 保溫。取所得擴增產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示。擴增得到的產(chǎn)物為AnVPl基因5'端cDNA完整序列inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測序(同實施例3)，得到的5'端cDNA完整序列如SEQID NO. 5所述。實施例7本實施例為AnVPl基因全長序列序列拼接和基因分析，包括下述步驟將上述實施例3所得中間片段、實施例4所得3'端inner PCR擴增序列和實施例6所得5'端inner PCR擴增序列用DNAman軟件進行完整序列的拼接，然后通過NCBI里ORF finder工具分析開放閱讀框，即完整的基因序列。實施例8本實施例為AnVPl基因克隆,方法如下以實施例7的基因分析設(shè)計上游引物0RF3-S和下游引物0RF3-A，以實施例5所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增0RF3-S :5' -ATGGGTGCAGCCATTCTCCC-3'，0RF3-A :5' -TTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACCATG-3'；擴增體系為
dNTP Mixture (2. 5mM each)4 U L,2X 引物(0RF3-S/0RF3-A)IU L,cDNA 模板luL，5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)10 U L,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2. 5U/ U L) 0. 5 U L,ddH2032. 5 U L0擴增程序為98°C，30s ；62°C，30s ；72°C，2min 30s (35 個循環(huán))；取所得擴增產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖I所示。擴增得到的產(chǎn)物為完整的AnVPl基因序列，如SEQ ID NO. I所述；其對應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
權(quán)利要求
1.一種來源于新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，該基因具有如SEQ ID NO. I所述的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的序列，其特征在于該基因的所述的核苷酸序列對應(yīng)的氨基酸序列如SEQID NO. 2所述。
3.依照權(quán)利要求I所述的一種來源于新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步驟 (1)總RNA的提取和純化 采用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物新疆沙冬青葉片中提取得到純化的新疆沙冬青葉片總RNA ； (2)中間片段的克隆 A、中間片段cDNA第一鏈的合成 以上述步驟(I)純化的新疆沙冬青葉片總RNA作為模板，使用TaKaRa公司3' -FullRACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)試劑盒中 3' RACE Adaptor 進行反轉(zhuǎn)錄，得到的 cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的模板； B、PCR擴增 以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為模板，利用下述上游引物(jf3)和下游引物(jx3)，進行PCR擴增。
I型液泡膜焦磷酸酶基因中間片段擴增引物 jf3 5/ -GGTCTTCTATGGCTTTGTTYGG-3'， jx3 5/ -TRGCAGARAACCAGTAAGGRAG-3,； 擴增得到新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因cDNA中間片段，通過克隆測序，得到中間片段序列。
(3)3'端的克隆 C、3'-outer PCR 擴增 根據(jù)上述步驟(2)得到的中間片段序列，設(shè)計并合成特異性上游引物GSP3-3' outer,以前述步驟(2)A所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上游引物GSP3-3' -outer和TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)試劑盒中 3 '端下游引物3' RACE outer,進行 3'端 outer PCR 擴增 I型液泡膜焦磷酸酶基因3'端的特異性上游outer引物GSP3-3' -outer 5/ -TCGCTGTTGGTCTCTGGGCAGGGCTTAT-3'； 3'端下游引物3' -RACE outer 3' -RACE outer 5/ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'； 擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 3'端； D、3'-inner PCR 擴增 根據(jù)前述步驟(2)所得中間片段端序列，設(shè)計并合成特異性上游引物GSP3-3' inner,以前述步驟C所得:V端的outer PCR產(chǎn)物模板，利用特異性上游引物GSP3-3' -inner和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code :D314)試劑盒中 3'端下游引物3' RACE inner,進行 3'端 inner PCR 擴增 I型液泡膜焦磷酸酶基因3'端的特異性上游inner引物GSP3-3' -inner :5' -CCATTGGTTCTGCCGCCCTTGTGTCTTT-3'； 3'端下游引物3' -RACE inner 3' -RACE inner :5' -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'； 擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 3'端inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測序，得到3'端完整序列； (4)5'端的克隆 E、合成5'端的cDNA第一鏈 以上述步驟(I)純化的新疆沙冬青葉片總RNA作為模板，經(jīng)過Ambion公司FirstChoice RLM-RACE Kit，SKU# :AM1700 試劑盒對 RNA 處理，加入下述 5' RACE Adapter后，以Random Decamers進行反轉(zhuǎn)錄5' RACE Adapt er :5, -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3,；合成得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5'端的cDNA第一鏈； F、5'-outer PCR 擴增 根據(jù)上述步驟(2)得到的中間片段序列，設(shè)計并合成特異性下游引物GSP3-5' outer,以前述步驟E所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下游引物GSP3-5' -outer和FirstChoice RLM-RACE Kit試劑盒中的5'端上游引物5' RACE outer，進行5'端outer PCR 擴增 I型液泡膜焦磷酸酶基因5'端的特異性下游outer引物GSP3-5' -outer :5' -TAAGCAAGCAAACAAGGATACCCACAG-3'； 5'端上游引物5' -RACE outer 5' -RACE outer :5' -GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3'； 擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 5'端； G、5'-inner PCR 擴增 根據(jù)前述步驟(2)所得中間片段序列，設(shè)計并合成特異性下游引物GSP3-5' -inner,以前述步驟F所得5'端的outer PCR產(chǎn)物模板，利用特異性下游引物GSP3-5' -inner和FirstChoice RLM-RACE Kit 試劑盒中 5'端上游引物 5' -RACE inner，進行 5'端 innerPCR擴增 I型液泡膜焦磷酸酶基因5'端的特異性下游inner引物GSP3-5' -inner :5, -GGAAGCAACAACGAGAGCGGCACAGGA-3,； 5'端上游引物5' -RACE inner 5' -RACE inner :5' -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3'； 擴增得到的產(chǎn)物為cDNA 5'端inner PCR產(chǎn)物，通過克隆測序，得到5'端完整序列； (5)cDNA全長序列拼接和克隆 將上述步驟⑵所得中間片段、步驟⑶所得3'端inner PCR擴增序列和步驟(4)所得5'端inner PCR擴增序列用DNAman軟件進行完整序列的拼接，然后通過NCBI里ORFfinder工具分析開放閱讀框，即完整的基因序列。
(6)I型液泡膜焦磷酸酶基因的克隆 將上述步驟(4)合成5'端的cDNA第一鏈作為模板，根據(jù)上述步驟(5)的基因分析設(shè)計上游引物0RF3-S和下游引物0RF3-A，并進行PCR擴增 I型液泡膜焦磷酸酶基因擴增引物0RF3-S :5' -ATGGGTGCAGCCATTCTCCC-3'， 0RF3-A :5' -TTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACCATG-3'； 擴增得到的產(chǎn)物為完整的新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，通過克隆測序，即得其基因序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步驟(I)中，采用的RNA提取方法為試劑盒法(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAott2. O提取試劑盒，CAT#90404-50);純化方法為DNA酶(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAQUT2. O提取試劑盒，CAT#90404-50)消化法。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步驟⑵中進行PCR擴增時，擴增體系可優(yōu)選為 TaqPlusPCR Master Mix20U L, cDNA 模板2 u L, 2X 引物(jf3/jx3)IuL, ddH2016u L ； I型液泡膜焦磷酸酶基因中間片段擴增程序分別可優(yōu)選為95°C,3min ；95°C，30s, 58°C，30s, 72°C，Imin (35 個循環(huán))； 72°C，8min ;4°C保溫。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步驟(3)中進行3'-outerPCR擴增時， 擴增體系可優(yōu)選為 IXcDNA Dilution Buffer II8 u L, cDNA 模板2 u L, 2X 引物(GSP3-3, -outer/3' -RACE-outer) I u L, 10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4u L, MgC12(25mM)3u L, TaKaRa LA Taq(5U/U I)0. 25U L, ddH2028. 75 u L0 擴增程序可優(yōu)選為95°C,3min ；95°C, 30s ；55°C,30s ；72°C, Imin 30s (35 個循環(huán)) 72°C，8min ;4°C保溫。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步驟(3)中進行3'-innerPCR擴增時， 擴增體系可優(yōu)選為 dNTP Mixture(2. 5mM each)8 u L, 3' -outer PCR 產(chǎn)物2 y L， 2X 引物(GSP3-3, -inner/3' -RACE-inner) I u L, 10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4u L,MgCl2 (25mM)3 u L, TaKaRa LA Taq (5U/U I)0. 25U L, ddH2028. 75 u L0 擴增程序可優(yōu)選為95°C,3min ；95°C, 30s ；55°C,30s ；72°C, Imin 30s (35 個循環(huán)) 72°C，8min ;4°C保溫。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步驟(4)中進行5'-outerPCR擴增時， 擴增體系可優(yōu)選為 cDNA 模板I u L IOX PCR Buffer5 n L dNTP Mix4 uL 2X引物(GSPS-Sf-Outer/^'-RACE outer)2 uLThermostabLe DNA poLymerase (0. 25 u Lof 5U/ u L) I. 25 ii L ddH2034. 75 P L； 擴增程序可優(yōu)選為95°C,3min ；95°C, 30s ；60°C,30s ；72°C,2min 30s (35 個循環(huán))；72°C，8min ;12°C 保溫。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步驟(4)中進行5'-innerPCR擴增時， 擴增體系可優(yōu)選為 5'-outer PCR 產(chǎn)物I u L IOX PCR Buffer5 u L dNTP Mix4 u L 2 X 引物(GSPS-S'-inner/S'-RACE inner)2 uL ThermostabLe DNA poLymerase個(0.25 y L of 5U/U L)I.25 P L ddH2034. 75 u L； 擴增程序可優(yōu)選為95°C,3min ；95°C, 30s ；60°C,30s ；72°C,2min 30s (35 個循環(huán))；72°C，8min，12°C 保溫。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步驟(6)中進行PCR擴增時，擴增體系可優(yōu)選為dNTP Mixture(2. 5mM each)4 μ L,.2 X 引物(0RF3-S/0RF3-A)I μ L，cDNA 模板I μ L,.5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)10 μ L,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase(2. 5U/μ L)0. 5 μ L, ddH2032. 5 μ L0I型液泡膜焦磷酸酶基因擴增程序可優(yōu)選為.98°C, 30s ；62°C,30s ；72°C,2min 30s (35 個循環(huán))。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來源于新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，該基因具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。上述基因編碼的I型液泡膜焦磷酸酶具有如SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。此核苷酸序列是新的基因序列。本發(fā)明還公開了一種上述來源于新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因序列的克隆方法。
文檔編號C12N9/14GK102676556SQ201210148680
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者于好強, 付鳳玲, 劉艷萍, 李晚忱, 鄧龍群, 雍太明 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學