本發明屬于醫學技術領域，尤其涉及一種O-GlcNAc定量檢測方法。

背景技術：

氧連接的N-乙酰葡糖胺（簡稱O-GlcNAc）是由單個N-乙酰葡糖胺（GlcNAc，單糖）以O-糖苷鍵與蛋白質部分的絲/蘇氨酸（Ser/Thr）殘基的羥基氧原子共價結合而成。O-GlcNAc修飾是一種普遍存在的蛋白質翻譯后修飾，大量研究證明O-GlcNAc修飾的水平與神經退行性疾病、糖尿病、癌癥等疾病密切相關。然而O-GlcNAc的修飾糖苷鍵易于斷裂，處于亞化學計量水平，具有動態性，蛋白質多為低豐度蛋白質，這為檢測方法的建立帶來不便， 特別是準確的定量檢測。目前檢測O-GlcNAc的方法大多用于定性和半定量分析，存在末端其它GlcNAc糖的干擾、靈敏度低、樣品前期準備復雜、昂貴、數據處理難、需要標記和富集等問題。因此，迫切需要建立靈敏、免標記和富集的準確定量檢測O-GlcNAc的方法，有助于糖尿病、癌癥等嚴重威脅到人類健康的疾病的早期診斷。

表面等離子體共振儀（SPR）由于具有待測物免標記、靈敏度高、實時監測反應、背景干擾小等優點被廣泛用于物理、化學、生物及生命科學等領域。然而SPR儀難以實現較小折射率變化的檢測，這在很大程度上限制了其實際應用。為了解決這一問題，許多放大技術被引入到SPR生物傳感器的研究中以提高其檢測的靈敏度。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種O-GlcNAc定量檢測方法，旨在解決檢測O-GlcNAc的方法大多用于定性和半定量分析，存在末端其它GlcNAc糖的干擾、靈敏度低、樣品前期準備復雜、昂貴、數據處理難、需要標記和富集等問題。

本發明是這樣實現的，一種O-GlcNAc定量檢測方法，所述O-GlcNAc定量檢測方法包括：在金膜上固定不同濃度的O-GlcNAc，流動注射納米金標記的麥胚凝集素，根據麥胚凝集素WGA與O-GlcNAc在金膜上發生相互結合作用引起折射率的變化來檢測記錄的SPR信號O-GlcNAc，折射率的變化與金膜表面結合的分子質量成正比，折射率變化越大，SPR的信號變化越大；

在金膜上固定不同濃度的O-GlcNAc，采用O-GlcNAc的專一性剪切酶N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶（OGA）在37℃條件下酶切O-GlcNAc 16h，再流動注射納米金標記的麥胚凝集素WGA，剪切后SPR信號的下降與O-GlcNAc的濃度相關；

根據酶處理前得到的SPR的信號減去酶處理后得到的SPR的信號△R（也就是酶切后信號的變化），實現對O-GlcNAc的準確定量檢測。

進一步，金膜上生物分子之間的相互作用引起的變化通過納米金放大的SPR生物傳感器進行檢測。

進一步，所述根據麥胚凝集素WGA與O-GlcNAc在金膜上發生相互結合作用引起折射率的變化記錄的SPR信號來檢測O-GlcNAc中，需對麥胚凝集素WGA進行納米金標記實現靈敏檢測。

本發明的另一目的在于提供一種利用上述的O-GlcNAc定量檢測方法的基于麥胚凝集素識別作用的O-GlcNAc的表面等離子體共振儀。

本發明利用了麥胚凝集素（WGA）對O-GlcNAc特異性識別作用，設計了一種納米金放大SPR生物傳感器，為了避免末端其他的GlcNAc干擾O-GlcNAc的準確測定，本發明采用了O-GlcNAc的專一性剪切酶N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶（OGA），剪切后信號的下降與O-GlcNAc的濃度相關。根據酶切前后信號的變化△R，建立了O-GlcNAc的定量檢測方法，實現了對幾種復雜樣品癌細胞中O-GlcNAc的含量的檢測。

本發明基于麥胚凝集素識別作用的O-GlcNAc的定量檢測方法對樣品的要求不高，經簡單處理就能夠檢測，操作簡單。

本發明采用了納米金放大技術，使檢測方法的靈敏度和檢測范圍均提高了十倍左右，較之前報道的工作具有較寬的線性范圍。

本發明采用了酶切技術，避免了末端其他的GlcNAc干擾，能夠準確的定量檢測癌細胞內O-GlcNAc的含量。

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的O-GlcNAc定量檢測方法流程圖。

圖2是本發明實施例提供的固定不同濃度的O-GlcNAc糖基化的標準多肽，流動注射WGA/AuNPs 的SPR的信號圖。

圖3是本發明實施例提供的固定不同濃度的O-GlcNAc糖基化的標準多肽，酶切后，再流動注射WGA/AuNP的SPR信號圖。

圖4是本發明實施例提供的O-GlcNAc在0.0465nM-465nM范圍內的工作曲線圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

本發明的兩大優點:納米金放大（靈敏）和酶切（準確）。本發明采用O-GlcNAc的專一性剪切酶N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶（OGA），根據酶切前后信號的變化△R，實現對O-GlcNAc的準確定量檢測。

下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細描述。

如圖1所示，本發明實施例提供的O-GlcNAc定量檢測方法，包括：

S101:根據麥胚凝集素WGA與O-GlcNAc在金膜上發生相互結合作用引起折射率的變化記錄的SPR信號來檢測O-GlcNAc；

S102：采用O-GlcNAc的專一性剪切酶N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶（OGA），剪切后信號的下降與O-GlcNAc的濃度相關；

S103：根據酶切前后信號的變化△R，實現對O-GlcNAc的準確定量檢測。

進一步，金膜檢測信號通過納米金放大SPR生物傳感器進行檢測。

進一步，所述根據麥胚凝集素WGA與O-GlcNAc在金膜上發生相互結合作用引起折射率的變化記錄的SPR信號來檢測O-GlcNAc中，需對麥胚凝集素WGA進行納米金標記。

下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。

實施例1：

首先通過金與巰基的相互作用在金膜上修飾巰基酸，再通過氨基羧基交聯反應將不同濃度的O-GlcNAc糖基化的標準多肽修飾在金膜上，在流動注射納米金標記的WGA，利用Navi-200SPR儀，在線實時監測WGA與O-GlcNAc之間的相互結合作用。

實施例2：

由于WGA不僅能夠識別O-GlcNAc，還能夠識別末端為GlcNAc的其它聚糖，為了避免末端GlcNAc的干擾，本發明采用了酶切技術。首先在金膜上修飾巰基酸，再通過氨基羧基交聯反應修飾上不同濃度的O-GlcNAc糖基化的標準多肽，再在37℃條件下酶切16h，再流動注射納米金標記的WGA，利用Navi-200SPR儀記錄信號，根據酶切前后信號的變化△R與O-GlcNAc的濃度建立了檢測O-GlcNAc的工作曲線。相應的SPR信號與工作曲線如附圖2~附圖4所示。

圖2是本發明實施例提供的固定不同濃度的O-GlcNAc糖基化的標準多肽，流動注射WGA/AuNPs 的SPR的信號圖。

圖3是本發明實施例提供的固定不同濃度的O-GlcNAc糖基化的標準多肽，酶切后，再流動注射WGA/AuNP的SPR信號圖。

圖4是本發明實施例提供的O-GlcNAc在0.0465nM-465nM范圍內的工作曲線圖。

本發明基于麥胚凝集素識別作用的O-GlcNAc的定量檢測方法對樣品的要求不高，經簡單處理就能夠檢測，操作簡單。

本發明采用了納米金放大技術，使檢測方法的靈敏度和檢測范圍均提高了十倍左右，較之前報道的工作具有較寬的線性范圍。

本發明采用了酶切技術，避免了末端其他的GlcNAc干擾，能夠準確的定量檢測癌細胞內O-GlcNAc的含量。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。