專利名稱：一種ema與pcr結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測飼料中沙門氏菌活細胞的方法及試劑盒，特別是涉及一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
動物飼料是“從農(nóng)場到餐桌”食品安全鏈的重要環(huán)節(jié)，食用受病原菌污染飼料的動物或動物產(chǎn)品或?qū)е氯祟惣膊。虼藴蚀_、快速地檢測飼料中的沙門氏菌，對于防止畜禽和人類沙門氏菌污染具有十分重要的意義。傳統(tǒng)沙門氏菌檢測方法，由于其檢測周期長、漏檢 率高、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點已遠遠不能滿足現(xiàn)代檢測要求。實時PCR技術(shù)被應(yīng)用多年，用于檢測食品或飼料中的病原微生物。傳統(tǒng)的PCR檢測方法可以對沙門氏菌等特定微生物DNA的單條基因片段進行放大，放大后，特定的DNA片段被成千上萬倍的復(fù)制，運用可視技術(shù)按照細菌基因序列探測和識別復(fù)制后細菌的遺傳物質(zhì)可以更加容易。然而，目前的PCR檢測方法容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，這造成了巨大的浪費和不必要的召回事件的發(fā)生。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因是，PCR技術(shù)跟其它的DNA法一樣，均不能將活的跟死的沙門氏菌區(qū)分開，因此這導(dǎo)致PCR技術(shù)提供了錯誤的結(jié)果。為了克服以上PCR技術(shù)的弱點，有效區(qū)分死細菌及活細菌，可用疊氮溴化已啶(EMA)對待檢樣品進行前處理，使死的沙門氏菌細胞不能進行PCR擴增，從而有效區(qū)分沙門氏菌死細胞及活細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的方法及試劑盒，成本低廉，操作方便快捷，能客觀反映飼料中沙門氏菌活細胞的存在情況，可為飼料中沙門氏菌的快速、準確檢測提供有效手段。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的試劑盒，其中，所述試劑盒包括以下成分沙門氏菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照、Taq預(yù)混酶及引物混合物、DL Marker2000、EMA溶液和共價交聯(lián)曝光裝置。進一步，所述Taq預(yù)混酶及引物混合物中，預(yù)混酶濃度為20u/mL，引物濃度為100pmol/mL，其保存條件為-20° C。進一步，所述引物的序列為SE-I:GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG ;SE-2:CATCGCACCGTCAAAGGAAC。
進一步，疊氮溴化已唳濃度為O. 5mg/mL。進一步，所述共價交聯(lián)曝光裝置包括箱體，其特征在于所述箱體上設(shè)有活動門、鹵素?zé)糸_關(guān)、紫外燈管開關(guān)和總電源開關(guān)，所述箱體內(nèi)頂部設(shè)有齒素?zé)簦潴w兩側(cè)內(nèi)壁上分別設(shè)置有至少一個紫外燈管。進一步，所述的紫外燈管為兩個。
進一步，所述箱體上還設(shè)有可視窗口。一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的方法,其中，包括如下步驟
I)將飼料樣品用BPW肉湯增菌，分別吸取500ul菌懸液于四個I. 5mL離心管中，其中兩份作為制備好的活細胞菌懸液，兩份進行100° C水浴10 min制成死細胞懸浮液。取活細胞菌懸液及死細胞菌懸液各一份，分別加入4ul O. 5mg/mL的疊氮溴化已啶溶液，搖勻，將 其置于冰盒上，在共價交聯(lián)裝置內(nèi)曝光3min。2)對四支離心管內(nèi)的菌懸液分別提取細菌DNA。3)PCR擴增沙門氏菌invA基因取試劑盒中預(yù)混酶及引物混合物，50ul體系吸取40ul，加入提取的細菌DNAlO ul進行PCR擴增，擴增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，56°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，33 個循環(huán)，最后 72°C終延伸 10 min。4)電泳分析將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)進行成像分析。本發(fā)明的有益效果為
本發(fā)明經(jīng)過大量研究，研制出了用于檢測飼料樣品中沙門氏菌活細胞的快速檢測試劑盒，采用了 EMA與PCR結(jié)合技術(shù)用疊氮溴化乙錠染料對飼料樣品的菌懸液進行處理，疊氮溴化乙錠在強光照的環(huán)境下進入死的細菌體內(nèi)后與DNA分子進行結(jié)合，使得細菌在染色后不能被溶解，但不能穿透活細胞，因此不影響飼料中沙門氏菌活細胞的PCR擴增，但可阻斷飼料中沙門氏菌死細胞的PCR擴增，這種改進的PCR技術(shù)可為飼料中沙門氏菌的快速、準確檢測提供有效手段。共價交聯(lián)曝光裝置可提供約200001UX的強光，進而使PMA與菌懸液混合均勻后在本裝置內(nèi)進行光照交聯(lián)，PMA所帶的光敏性疊氮基團轉(zhuǎn)化為高活性的氮賓自由基，并與結(jié)合位點附近的任意碳氫化合物反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價氮碳基，致使死細胞DNA分子的永久修飾，最后阻斷死細胞DNA分子的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增。本發(fā)明的其他優(yōu)點、目標和特征在某種程度上將在隨后的說明書中進行闡述，并且在某種程度上，基于對下文的考察研究對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的，或者可以從本發(fā)明的實踐中得到教導(dǎo)。本發(fā)明的目標和其他優(yōu)點可以通過下面的說明書所特別指出的結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)和獲得。


圖I為本發(fā)明共價交聯(lián)曝光裝置的結(jié)構(gòu)示意 圖2為本發(fā)明實施例I的電泳 圖3為本發(fā)明實施例2的電泳 圖4為本發(fā)明實施例3的電泳 圖5為本發(fā)明實施例4的電泳圖。
具體實施例方式 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述
如圖I所示，本發(fā)明的共價交聯(lián)曝光裝置的箱體I上設(shè)有可視窗口 3、活動門5、鹵素?zé)糸_關(guān)6、紫外燈管開關(guān)7和總電源開關(guān)8，活動門5與箱體I鉸接，箱體I頂部的內(nèi)壁上設(shè)有500W的鹵素?zé)?，箱體I兩側(cè)的內(nèi)壁上分別安裝有兩個紫外燈管2，兩個平行的紫外燈管2分別左右對稱設(shè)置于箱體I的內(nèi)側(cè)面。鹵素?zé)?提供強光，紫外燈管2用于殺菌，為了提高殺菌效果，在箱體I兩側(cè)的內(nèi)壁上分別安裝兩個紫外燈管2。通過可視窗口 3觀察內(nèi)部的光照交聯(lián)效果。本發(fā)明可用于永久性修飾細菌死細胞的DNA分子，阻斷DNA分子的聚合酶鏈式反應(yīng)，從而有效區(qū)分樣品中細菌的死活狀態(tài)，降低PCR檢測樣品中致病菌的假陽性率。本發(fā)明可提供約200001UX的強光，進而使EMA與菌懸液混合均勻后在本裝置內(nèi)進行光照交聯(lián)，EMA所帶的光敏性疊氮基團轉(zhuǎn)化為高活性的氮賓自由基，并與結(jié)合位點附近的任意碳氫化合物反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價氮碳基，致使死細胞DNA分子的永久修飾，最后阻斷死細胞DNA分子的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增。實施例I :
本發(fā)明的試劑盒包括沙門氏菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照、適宜濃度的Taq預(yù)混酶及引物混合物、DL Marker 2000、適宜濃度的EMA溶液和共價交聯(lián)曝光裝置。預(yù)混酶為20u/mL，引物濃度為lOOpmol/mL，其保存條件為-20° C。引物的序列為SE_1:GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG SE-2: CATCGCACCGTCAAAGGAAC 。EMA 溶液，其濃度為O. 5mg/mL。本發(fā)明的方法包括如下步驟
1)將飼料樣品用BPW肉湯增菌，分別吸取500ul菌懸液于四個I.5mL離心管中，其中兩份作為制備好的活細胞菌懸液，兩份進行100° C水浴10 min制成死細胞懸浮液。取活細胞菌懸液及死細胞菌懸液各一份，分別加入4ul O. 5mg/mL的疊氮溴化已啶溶液，搖勻，將其置于冰盒上，在共價交聯(lián)裝置內(nèi)曝光3min ；
2)對四支離心管內(nèi)的菌懸液分別提取細菌DNA；
3)PCR擴增沙門氏菌invA基因取試劑盒中預(yù)混酶及引物混合物，50ul體系吸取40ul，加入提取的細菌DNAlO ul進行PCR擴增，擴增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，56°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，33 個循環(huán)，最后 72°C終延伸 10 min ；
4)電泳分析將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)進行成像分析。電泳圖見圖2。由左至右分別為DL Marker 2000、沙門氏菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照、空白對照、沙門氏菌活細胞PCR產(chǎn)物、沙門氏菌死細胞PCR產(chǎn)物、經(jīng)疊氮溴化已啶處理的沙門氏菌活細胞PCR產(chǎn)物、經(jīng)疊氮溴化已啶處理的沙門氏菌死細胞PCR產(chǎn)物。由圖可以看到，沙門氏菌死細胞、沙門氏菌活細胞、經(jīng)疊氮溴化已啶處理的沙門氏菌活細胞PCR擴增效率相同，經(jīng)疊氮溴化已啶處理的沙門氏菌死細胞不能擴增出沙門氏菌相應(yīng)條帶。可見疊氮溴化已啶可選擇性修飾沙門氏菌死細胞的DNA分子，而對沙門氏菌活細胞的DNA分子PCR擴增效率無影響，因此應(yīng)用本方法可有效區(qū)分飼料中沙門氏菌死細胞及活細胞，從而為飼料中沙門氏菌的監(jiān)測提供有效的監(jiān)管手段。實施例2
試劑盒包括沙門氏菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照、適宜濃度的Taq預(yù)混酶及引物混合物、DL Marker 2000、適宜濃度的EMA溶液和共價交聯(lián)曝光裝置。預(yù)混酶為20 u/mL，引物濃度為100 pmol/mL，其保存條件為-20° C。引物的序列為SE_1:GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG SE-2: CATCGCACCGTCAAAGGAAC。EMA溶液，其濃度為 O. 5mg/mL。本發(fā)明的檢測方法包括以下步驟1)將取滅菌的空白濃縮飼料及配合飼料2份，每25克添加ICFU的沙門氏菌，于滅菌好的BPW肉湯增菌，分別吸取500ul菌懸液于四支I. 5mL離心管中，其中兩支離心管中分別加入4ul O. 5mg/mL的疊氮溴化已啶溶液，將離心管置于冰盒上，在共價交聯(lián)裝置內(nèi)曝光3min ；
2)提取細菌DNA;
3)PCR擴增沙門氏菌invA基因取試劑盒中預(yù)混酶及引物混合物，50ul體系吸取40ul，加入提取的細菌DNAlO ul進行PCR擴增，擴增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，56°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，33 個循環(huán)，最后 72°C終延伸 10 min ；
4)電泳分析將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)進 行成像分析，電泳圖見圖3。由左至右分別為DL Marker 2000、沙門氏菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照、空白對照、濃縮飼料沙門氏菌陽性添加PCR產(chǎn)物、配合飼料沙門氏菌陽性添加PCR產(chǎn)物、經(jīng)疊氮溴化已啶處理的濃縮飼料沙門氏菌陽性添加PCR產(chǎn)物、經(jīng)疊氮溴化已啶處理的配合飼料沙門氏菌陽性添加PCR產(chǎn)物。由圖可以看到，經(jīng)疊氮溴化已啶處理后的樣品其PCR擴增效率與未經(jīng)疊氮溴化已啶的樣品PCR擴增效率一致。可見疊氮溴化已啶對沙門氏菌活細胞的DNA分子PCR擴增效率無影響，本方法可檢測出濃縮料或配合料中1CFU/25克濃度的沙門氏菌活細胞。實施例3
1)將取滅菌的空白濃縮飼料及配合飼料4份，每25克分別添加104CFU/mL及IO5CFU/mL的沙門氏菌，于滅菌好的BPW肉湯增菌，分別吸取500ul菌懸液于四支I. 5mL離心管中，100° C水浴10 min制成死細胞懸浮液,分別加入4ul O. 5mg/mL的疊氮溴化已唳溶液,將離心管置于冰盒上，在共價交聯(lián)裝置內(nèi)曝光3min ；
2)提取細菌DNA；
3)PCR擴增沙門氏菌invA基因取試劑盒中預(yù)混酶及引物混合物，50ul體系吸取40ul，加入提取的細菌DNAlO ul進行PCR擴增，擴增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，56°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，33 個循環(huán)，最后 72°C終延伸 10 min ；
4)電泳分析將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)進行成像分析，電泳圖見圖4。由左至右分別為DL Marker 2000、沙門氏菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照、空白對照、經(jīng)疊氮溴化已啶處理的濃縮飼料沙門氏菌104CFU/mL陽性添加PCR產(chǎn)物、經(jīng)疊氮溴化已啶處理的配合飼料沙門氏菌104CFU/mL陽性添加PCR產(chǎn)物、經(jīng)疊氮溴化已啶處理的濃縮飼料沙門氏菌105CFU/mL陽性添加PCR產(chǎn)物、經(jīng)疊氮溴化已啶處理的配合飼料沙門氏菌105CFU/mL陽性添加PCR產(chǎn)物、由圖可以看到，經(jīng)疊氮溴化已啶處理后的樣品其PCR擴增被抑制，即便是濃縮飼料及配合飼料中沙門氏菌死細胞濃度很高，經(jīng)疊氮溴化已啶處理后均未擴增出對應(yīng)的沙門氏菌條帶。實施例4
1)將從市場上隨機抽取的樣品I(肉雞濃縮料)、樣品2 (發(fā)酵豆柏)、樣品3 (豆柏)、樣品4 (血粉)、樣品5 (魚粉)、樣品6 (枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑)、樣品7 (蛋白酶制劑)，各稱取25g于滅菌好的BPW肉湯增菌，分別吸取500ul菌懸液于7支I. 5mL離心管中，分別加入4ul O. 5mg/mL的疊氮溴化已啶溶液，將離心管置于冰盒上，在共價交聯(lián)裝置內(nèi)曝光3min ；
2)提取細菌DNA；3)PCR擴增沙門氏菌invA基因取試劑盒中預(yù)混酶及引物混合物，50ul體系吸取40ul，加入提取的細菌DNAlO ul進行PCR擴增，擴增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，56°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，33 個循環(huán)，最后 72°C終延伸 10 min ；
4)電泳分析將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)進行成像分析，電泳圖見圖5。由左至右分別為DL Marker 2000、沙門氏菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照、空白對照、樣品I至樣品7。由圖5可以看到，樣品I有對應(yīng)的沙門氏菌條帶擴增出，樣品2-樣品7未擴增出沙門氏菌對應(yīng)條帶。可見樣品I中存在沙門氏菌活細胞，樣品2-樣品7中不存在沙門氏菌活細胞。根據(jù)此檢測結(jié)果，可對樣品I的沙門氏菌污染來源進行追溯，從飼料原料、生產(chǎn)工藝、環(huán)境等方面進行監(jiān)控，阻止沙門氏菌的交叉污染，避免沙門氏菌陽性的飼料流入養(yǎng)殖環(huán)節(jié)對食品安全鏈造成威脅。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案所做的其他修改或者等同替換，只要不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括以下成分沙門氏菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照、Taq預(yù)混酶及引物混合物、DLMarker 2000、EMA溶液和共價交聯(lián)曝光裝置。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的試劑盒，其特征在于所述Taq預(yù)混酶及引物混合物中，預(yù)混酶濃度為20u/mL，引物濃度為100pmol/mL，其保存條件為-20° C。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的試劑盒，其特征在于所述引物的序列為SE-1 GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG ；SE-2:CATCGCACCGTCAAAGGAAC。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的試劑盒，其特征在于疊氮溴化已啶濃度為O. 5mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的試劑盒，其特征在于所述共價交聯(lián)曝光裝置包括箱體，所述箱體上設(shè)有活動門、齒素?zé)糸_關(guān)、紫外燈管開關(guān)和總電源開關(guān)，所述箱體內(nèi)頂部設(shè)有鹵素?zé)簦潴w兩側(cè)內(nèi)壁上分別設(shè)置有至少一個紫外燈管。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的試劑盒，其特征在于所述的紫外燈管為兩個。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的試劑盒，其特征在于所述箱體上還設(shè)有可視窗口。
8.—種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的方法，其特征在于包括如下步驟 1)將飼料樣品用BPW肉湯增菌，分別吸取500ul菌懸液于四個I.5mL離心管中，其中兩份作為制備好的活細胞菌懸液，兩份進行100° C水浴10 min制成死細胞懸浮液； 取活細胞菌懸液及死細胞菌懸液各一份，分別加入4ul O. 5mg/mL的疊氮溴化已啶溶液，搖勻，將其置于冰盒上，在共價交聯(lián)裝置內(nèi)曝光3min ； 2)對四支離心管內(nèi)的菌懸液分別提取細菌DNA； 3)PCR擴增沙門氏菌invA基因取試劑盒中預(yù)混酶及引物混合物，50ul體系吸取40ul，加入提取的細菌DNAlO ul進行PCR擴增，擴增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30sec，56°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，33 個循環(huán)，最后 72°C終延伸 10 min ； 4)電泳分析將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)進行成像分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種EMA與PCR結(jié)合快速檢測飼料中沙門氏菌活細胞的方法及試劑盒，其中，所述試劑盒包括以下成分沙門氏菌陽性對照、沙門氏菌陰性對照、Taq預(yù)混酶及引物混合物、DLMarker2000、EMA溶液和共價交聯(lián)曝光裝置。本發(fā)明成本低廉，操作方便快捷，能客觀反映飼料中沙門氏菌活細胞的存在情況，可為飼料中沙門氏菌的快速、準確檢測提供有效手段。
文檔編號C12Q1/10GK102643926SQ20121015949
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者劉宏偉, 周紅霞, 宋志超, 張發(fā)旺, 朱松波, 李華岑, 李金磊, 焦玉萍, 班付國, 舒暢, 董鵬, 賈振民, 陳曉鴿, 韓立, 馬俊, 高小玲, 高延玲, 黃京燕 申請人:河南省獸藥監(jiān)察所