專利名稱：用于檢測食品和飲料中大蒜成分的引物和探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用核酸擴增技術進行植物源性成分快速檢測的方法，具體是一種大蒜成分的實時熒光PCR檢測用的引物和探針序列。
背景技術：
全球經濟一體化和貿易國際化的的不斷擴大，對于發展中的中國，是機遇也是挑戰。目前，我國已成為世界上第五大農產品出口國，農產品進出口貿易持續增長。美國、歐盟、日本等發達國家和地區為了維護本國的經濟利益，爭奪國際市場，竭力通過名目繁多的檢驗項目和嚴格甚至苛刻的技術標準，對進口農產品設置貿易障礙，導致我國農產品出口增長遭受較大壓力。就進出口的農產品而言，合格的產品，不僅要無毒無害，滿足安全衛生要求；而且要無攙雜攙假，滿足品質要求。其中品質合格，又主要包含兩方面的含義1.原料來源與標簽一致。2.組分含量與標簽一致。歐盟自2006年I月I日起開始實施新的食 品衛生法規，新法規突出了食品生產過程中的可追溯管理與食品的可追溯性，強調食品的身份鑒定標識與健康標識。我國國家標準GB 7718-94《食品標簽通用標準》和國家出入境檢驗檢疫局發布的《進出口食品標簽管理辦法》，也明確提出食品標簽標注內容應與食品相符。為此，國家質檢總局專門發文，要求嚴厲打擊制假制劣的違法行為，對假冒偽劣產品要依法沒收并監督銷毀，追查生產源頭和去向，嚴防流入消費環節。在食品和飲料的生產與銷售中，產品無標簽或標簽不規范，利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費者謀取暴利的事件，國內、國外均屢屢發生。各種原料被加工成食品和飲料成品后，已無法從外觀對其組成進行鑒定。生產者受利益驅動，擅自改變產品組成，或摻入價廉的替代品，或直接減少原料用量，導致產品的真實屬性與標簽不符。這種造假行為不僅僅涉及經濟、營養價值，更直接影響著消費者的健康，可能引發食源性過敏反應。大蒜,又名蒜頭、獨蒜、胡蒜,為單子葉植物百合科蔥屬植物蒜的鱗莖。大蒜營養價值十分豐富，據測定大蒜的新鮮鱗莖每IOOg中含蛋白質4. 4克，脂肪0. 2克，碳水化物23. 6丸,I丐5暈克,鐵0. 4暈克，硫胺素0. 24暈克,尼克酸0. 9暈克,抗壞血酸3暈克。大蒜中含有17種氨基酸，其中6種為人體必須氨基酸，尤以精氨酸含量最高，占氨基酸總量的20. 4%，其次是谷氨酸，占氨基酸總量的19. 75%。大蒜中還含有元素鍺(73. 4mg/100g)和硒(0. 3-0. 8mg/100g)。它既能調味，又能助消化和促進食欲，還是神奇的良藥，具有散寒化濕、殺蟲解毒、防癌、保肝、降血脂、降壓等多種功效。隨著人們對大蒜醫療保健作用認識的不斷提高，以大蒜為原料或添加劑開發出的新型食品和飲料在市場上日趨增多。大蒜雖營養豐富，但同時也是一種常見的食物過敏原。因食用大蒜引發的過敏反應時有報道。鑒于此，盡快建立可靠有效的大蒜成分檢測方法，確保食物標簽真實準確，對于減少食源性過敏反應發生，加強食品過敏原標識管理，改進食品安全，保護消費者利益具有重要意義。食品中植物源性成分檢測，常采用DNA檢測的方法。以DNA為測試對象的方法與以蛋白為測試對象的方法相比，在食物成分復雜的情況下，目標DNA可以有效提取，受食物基質的影響較小；此外，DNA比較穩定，不象蛋白質組成那樣受地理條件、季節變化和加工工藝的影響。當前，基于DNA的檢測方法中，實時熒光PCR法以其操作簡便、靈敏、特異、快速、重復性好、定量準確、全封閉反應等優點，得到研究者的普遍認可，成為檢測的重要工具。

發明內容
本發明的目的是針對大蒜蒜氨酸酶基因，設計一組特異性引物和探針，進而建立一種快速檢測大蒜DNA方法，以克服基于蛋白的檢測方法在某些食品檢測中的局限性，為大蒜成分檢測提供有效工具，從而確保食品標簽的一致性和消費者的飲食安全。本發明的主要原理為針對保守序列設計一組引物(上游引物5' -GGAAATGCTGCGAACTATGTGA-3'和下游引物5' -TTGATTGGGCTGTAATGAGGC-3')和一條 Taqman 探針(序列為5' -FAM-TGGCAAGGAGACCTTCTGGGTTGTTAGG-TAMRA-3')。進行核酸檢測時，模板DNA經加熱至94_95°C—定時間后，DNA雙鏈解離，引物及Taqman探針與模板特異性結合。探針的5端標記有報告熒光集團，3端有淬滅熒光集團。當探針完整的時候，報告集團所發射的熒光能量被淬滅集團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中，遇到與模板結合的探針時，其3' —5'外切核酸酶活性就會將探針切 斷，報告集團遠離淬滅集團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號。隨著PCR循環的增加，目的片段成指數增長，熒光信號也同步增強，熒光信號的強弱直接反映模板數量。本發明涉及的大蒜成分實時熒光PCR檢測用的引物和探針，其序列如下(I)上游引物5' -GGAAATGCTGCGAACTATGTGA-3'；⑵下游引物5'-TTGATTGGGCTGTAATGAGGC-3'； (3) TaqMan 探針5' -TGGCAAGGAGACCTTCTGGGTTGTTAGG-3'，其 5'端標記 FAM 報告熒光集團，3'端標記TAMRA淬滅熒光集團；在應用中，上游引物、下游引物、TaqMan探針的體積比為1 :1:1;使用上述試劑盒檢測食品中大蒜成分的方法，依次包括下列步驟(1)-(3)(I)待檢樣品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。(2)大蒜成分的實時熒光PCR擴增A.在反應管中加入2XPCR Master Mix 12. 5 ii L，上游引物和下游引物各1-2 ii L，Taqman探針0. 5-1 u L，IOOng/ u L待測樣品的DNA 1-2 u L，補充雙蒸水至25 u L，混勻；B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增94-95°C 5min, I 個循環,預變性；94-95°C 10-20sec ；60°C 20_40sec，45 個循環，PCR 擴增。擴增時，應設立三個對照陽性對照(取新鮮大蒜提取的基因組DNA)、陰性對照(非大蒜基因組DNA)、空白對照(不含DNA模板，可以水代替)。(3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果。如待測樣品出現擴增曲線，且Ct值小于或等于41，陰性對照、陽性對照和空白對照結果都成立(即陽性樣品出現典型陽性擴增曲線，陰性樣品和空白對照無擴增)，則可判定該樣品檢出大蒜成分。如待測樣品Ct值大于或等于45，陰性對照、陽性對照和空白對照都成立，則可判定該樣品未檢出大蒜成分。
如待測樣品Ct值在41-45之間，應重作實時熒光PCR擴增。再次擴增后的結果Ct值仍小于45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結果都成立，則可判定該樣品檢出大蒜成分；再次擴增后的結果Ct值大于45，且陰性對照、陽性對照和空白對照結果都成立，則可判定該樣品未檢出大蒜成分。大蒜素(Allicin)是百合科蔥屬植物大蒜的主要功效成分，其殺菌力強，抗菌譜廣，且具有抗腫瘤、降膽固醇、抗血小板聚集、預防心血管疾病、降血壓等生理學功能。但是大蒜素并不是大蒜中天然存在的活性成分，它是由大蒜中的蒜氨酸酶(Alliinase)催化底物蒜氨酸形成。蒜氨酸酶是存在于大蒜中的一種內源酶，其化學名稱是S-燒基-L-半胱氨酸亞砜酶，約占蒜中可溶性蛋白質的10% -12%，其分子質量約為10. 2-10. 4萬D，含2個分子質量約為5. 15萬D的亞基。正常情況下蒜氨酸存在于大蒜細胞的液泡中，而蒜氨酸酶存在于細胞質中。當大蒜完整細胞受損時，二者相遇發生酶解反應產生大蒜素。鑒于蒜氨酸酶在大蒜素生成過程中的重要作用，國內為學者對大蒜中的蒜氨酸酶進行了分離純化和基因 克隆。本發明根據大蒜蒜氨酸酶基因的保守序列，使用Biodet軟件和Primer Express 3.0軟件進行了序列分析和引物、探針設計。該保守基因序列通過對Genebank登錄的大蒜、洋蔥、韭菜、蔥等蔥屬植物的蒜氨酸酶的核酸序列的比對獲得，并對設計出的引物和探針進行了在線Blast比對查詢，可保證大蒜的檢出。本發明采用實時熒光PCR技術，該技術特異性強、靈敏度高、操作簡便，特別適用于一些成分復雜的加工食品和飲料中大蒜成分的檢測。


圖I為用實時熒光PCR技術檢測某待測蒜蓉辣醬樣品DNA，樣品的擴增圖譜；圖2為陰性對照(大豆DNA)的擴增圖譜；圖3為空白對照(水)的擴增圖譜；圖4為陽性對照(大蒜DNA)擴增圖譜。圖5為用實時熒光PCR技術檢測某待測豆瓣醬樣品DNA，樣品的擴增圖譜；圖6為陰性對照(大豆DNA)的擴增圖譜；圖7為空白對照(水)的擴增圖譜；圖8為陽性對照(大蒜DNA)擴增圖譜。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步說明。實施例I按下列配方制作大蒜成分的實時熒光PCR檢測試劑盒，其中的試劑包括如下(I) 2 X PCR Master Mix包括0. 05u/ V- L Taq DNA 聚合酶，反應緩沖液，4mmol/L 氯化鎂,0. 4mmol/LdNTP(dATP, dCTP, dGTP,dTTP)；其中反應緩沖液含有20mmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀和2%曲拉通X-100 ；⑵上游引物10iimol/L，序列為5'-GGAAATGCTGCGAACTATGTGA-3'；(3)下游引物10iimol/L，序列為5' -TTGATTGGGCTGTAATGAGGC-3'；(4) Taqman 探針10 y mol/L，序列為5' -TGGCAAGGAGACCTTCTGGGTTGTTAGG-3'，其5'端標記FAM報告熒光集團，3'端標記TAMRA淬滅熒光集團。
按照以下程序進行檢測(I)待測蒜蓉辣醬樣品DNA的提取A.稱取0. Ig蒜蓉辣醬，加至I. 5mL離心管中。加入600 U L預熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 u L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液，混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；D.在沉淀中加入60 ii L RNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300 u L緩沖液,上下顛倒混勻10次；E.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加A 200 u L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；G.在離心柱中加入200ii L70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；I.將離心柱放置在一個新的I. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 ii L洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應的模板。
(2)待測蒜蓉辣醬DNA的實時熒光PCR擴增A.在PCR反應管中加入如權利要求I所述的2XPCR Master Mix 12. 5yL，上游引物和下游引物各I U L，Taqman探針0. 5 y L，IOOng/y L待測樣品的DNA I u L，補充雙蒸水至25 u L，混勻； B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增94°C 5min, I個循環，預變性；94°C 30sec ；60°C 3Osec, 45 個循環，PCR 擴增。(3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果。樣品出現陽性擴增曲線，Ct值為28. 4，陰性對照(大豆DNA)和空白對照(水)無擴增，陽性對照(大蒜DNA)產生典型陽性擴增曲線，見圖I、圖2、圖3、圖4，據此可判定該樣品檢出大蒜成分。實施例2按下列配方制作大蒜成分的實時熒光PCR檢測試劑盒，其中的試劑包括如下(I) 2 X PCR Master Mix包括0.05u/liL Taq DNA 聚合酶 Polymerase,反應緩沖液,4mmol/L 氯化鎂，0.4mmol/L dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)；其中反應緩沖液含有20mmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀和2%曲拉通X-100 ；(2)上游引物10iimol/L，序列為5' -GGAAATGCTGCGAACTATGTGA-3'；(3)下游引物10iimol/L，序列為5' -TTGATTGGGCTGTAATGAGGC-3'；(4) Taqman 探針10 y mol/L，序列為5' -TGGCAAGGAGACCTTCTGGGTTGTTAGG-3'，其5'端標記FAM報告熒光集團，3'端標記TAMRA淬滅熒光集團。按照以下程序進行檢測(I)待測豆瓣醬樣品DNA的提取A.稱取0. Ig豆瓣醬，加至I. 5mL離心管中。加入600 ii L預熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 u L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液，混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；D.在沉淀中加入60 ii L RNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300 u L緩沖液,上下顛倒混勻10次； E.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加A 200 u L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；G.在離心柱中加入200ii L70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；I.將離心柱放置在一個新的I. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 ii L洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應的模板。(2)待測豆瓣醬DNA的實時熒光PCR擴增A.在PCR反應管中加入如權利要求I所述的2 XPCR Master Mix 12. 5yL，上游引物和下游引物各I U L，Taqman探針0. 5 y L，IOOng/y L待測樣品的DNA I u L，補充雙蒸水至25 u L，混勻；B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增94°C 5min, I個循環,預變性；94°C 30sec ；60°C 3Osec, 45 個循環，PCR 擴增。(3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，分析擴增結果。樣品未出現陽性擴增曲線，陰性對照(玉米DNA)和空白對照(水)無擴增，陽性對照(大蒜DNA)產生典型陽性擴增曲線，見圖5、圖6、圖7、圖8，，據此可判定該樣品未檢出大蒜成分。
權利要求
1.一種大蒜成分快速檢測用的上游引物和下游引物，其特征在于 上游引物序列為5' -GGAAATGCTGCGAACTATGTGA-3'； 下游引物序列為5' -TTGATTGGGCTGTAATGAGGC-3'。
2.一種大蒜成分快速檢測用的的Taqman探針，其特征在于 序列為5' -TGGCAAGGAGACCTTCTGGGTTGTTAGG-3'，其 5'端標記 FAM 報告熒光集團，3'端標記TAMRA淬滅熒光集團。
全文摘要
本發明屬于食品和飲料中植物源性成分的定性檢測技術，具體地說是檢測食品和飲料中大蒜成分的引物/探針組。本發明選取大蒜的蒜氨酸酶基因，根據其基因的保守序列，設計一組特異性引物和探針。使用該引物和探針，采用實時熒光PCR技術，可快速、靈敏、特異地檢測食品和飲料中的大蒜成分。該引物和探針也可以試劑盒的形式和其他試劑一起提供，用于核酸擴增反應。該法操作簡便、重復性好。
文檔編號C12N15/11GK102766685SQ20121017695
公開日2012年11月7日 申請日期2012年5月27日 優先權日2012年5月27日
發明者孫敏, 肖西志, 鄧明俊, 龔方 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心