專利名稱：一種檢測脫水蒜制品中沙門氏菌的方法
技術領域：
本發明屬于微生物檢測技術領域，具體涉及一種采用免疫磁珠分離技術檢測脫水蒜制品中沙門氏菌的方法。
背景技術：
食品衛生與安全問題同每個人的身體健康息息相關，歷來被世界各國政府和主流傳媒所關注。近年來隨著人們對食品安全的關注度越來越高，特別是在近年來我國食品安全事故頻發，與中國出口產品有關的食品質量安全事件時常見諸報端的大背景下，進口國對來自中國的食品檢測越來越嚴格。我國是世界上最大的大蒜(Allium sativum L.)及其制品生產與出口國，已成為我國首位出口換匯蔬菜，其出口逐年增加。其中脫水蒜制品就是安徽省傳統大宗出口農產品，產品主要出口日韓、歐美市場，出口量一直穩居全國前列。加強出口脫水蒜制品衛生檢驗監管不僅關系到單一產品出口，更是保護農產品全行業貿易正常進行。然而脫水蒜制品至今沒有相關微生物檢驗標準出臺，長期借用食品微生物GB4789 系列標準檢驗，但因為脫水蒜制品具有獨特的產品特性，實際檢測中暴露出大量問題，表現出明顯的不適宜。沒有合適檢驗標準對確保產品質量，消費者安全、保障農產品出口貿易順暢構成很大隱患。因此開展脫水蒜制品的安全衛生檢測技術的研發對于確保農產品貿易安全和消費者食用安全都有著重要的意義。脫水蒜制品主要為蒜粉、蒜粒和蒜片，是上好的調味品和保健食品原料，該廣品選用優質大蒜，經過去皮、清洗、烘干、精選、磨粉、包裝等多道工序加工而成。水分含量低于6%，不添加任何食品添加劑，不添加防腐劑。研究表明作為保健食品，對于消化不良、感冒、呼吸道感染、消化道潰瘍、血脂偏高、血管硬化、患癌癥的成年人士和中老年人心臟病、心腦血管疾病者；免疫力低下者均有輔助治療的效果。蒜粉具有廣譜抗菌和抑菌、殺菌作用可有效抑制大腸桿菌、沙門氏等有害菌類的生長、繁殖，對畜禽因革蘭氏陰性及陽性菌感染引起的呼吸道、消化道疾病及其并發癥顯著療效。大蒜素可有效刺激動物體內產生香味的氨基酸的形成，增加肉蛋中的香味成分，使肉蛋鮮味更美。加入飼料中可提高畜禽及魚蝦抗病能力，加快生長速度。有清瘟、解毒、活血化瘀的功能，可顯著降低飼料中有效物質的毒性。脫水蒜制品蒜味濃烈、純正，不產生抗藥性，無毒無害，體內無殘留。正是因為脫水蒜制品的優良品性，被越來越廣泛的運用和消費，加強對其衛生安全研究才顯得越發重要。脫水蒜制品的生產要經過多個環節，其中很多環節都存在微生物污染與繁殖的可能。那么為什么現行GB4789系列標準不適合脫水蒜制品的安全衛生檢測呢？因為大蒜中含有一種天然植物抑菌劑大蒜素，蒜素是大蒜瓣和蒜精油中含硫化合物的總稱，具有不同程度的殺(抑)菌作用，被譽為天然殺菌劑，有報道稱它殺菌的能力幾乎是青霉素的100倍！1/80000的大蒜素能抑制或殺滅葡萄球菌、鏈球菌、傷寒、痢疾桿菌等。大蒜鱗莖提取液對青霉、根霉、曲霉、木霉有明顯的抑制作用。免疫磁珠分離技術(Immunomagnetic Separation, IMS)整合了免疫反應的高度特異性和磁性分離的快速、簡單優點，廣泛用于細胞的分離提純、體外擴增、HLA分型、靶向釋藥、微生物檢測等。免疫磁性分離技術不但廣泛用于醫學的各個領域而且在食品衛生檢測方面的應用也初見端倪。免疫磁珠分離技術能夠有效分離純化環境水樣中的病原微生物，腸出血性大腸桿菌0157 H7等病原菌及兩蟲(賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲)，此外該技術在病毒檢測中也有良好應用前景。由于食品檢樣常為固液多相混合體，采用常規方法難以將少量的致病微生物分離出來。借助免疫磁性分離技術，可以達到快速分離的目的。免疫磁性分離方法，是將特異性抗體偶聯在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病微生物發生特異性結合，載有致病微生物的磁性顆粒在外加磁場的作用下，向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，使致病微生物不但得到分離，而且也得到濃集。免疫磁性分離技術以其特有的性能，在食品衛生檢測和研究中取得了較好的結果。免疫磁分離技術就是將直徑為0. 02 5 y m具有超順磁性的微粒的表面經化學修飾，使之與特異性抗體牢固結合，成為能與特異性抗原(待測菌)結合且有磁性的微珠，即免疫磁珠。在磁板背景下混合，如果有相應抗原存在，免疫磁珠就會將其捕獲，形成菌體一免疫磁珠復合物。接著在適當的磁場條件下，菌體一免疫磁珠復合物會分離出來，最后用其他方法進行測量，如傳統的平板培養法、PCR、ELISA、光學傳感器、電化學方法等。免疫磁珠分離技術最突出的優點是特異性強，可以明顯提高檢測靶細菌的準確性，此外，在有些情況下可以節約12 18 h的培養時間。免疫磁分離技術是目前最具推廣價值的技術之一。

發明內容
本發明的目的旨在提供一種快速、有效地檢測脫水蒜制品中沙門氏菌的方法。發明人認為針對脫水蒜制品中沙門氏菌的檢測，應當解決樣品中抑菌物質的干擾。故而，本發明提出以下技術方案
檢測脫水蒜制品中沙門氏菌方法的具體操作步驟如下
(1)取蒜粉25g，加入225mL滅菌稀釋液均質，經過有濾膜的均質袋過濾，吸取濾液，移A 500 mL離心瓶中，并得濾渣；
(2)對濾渣進行第一次洗滌，即在濾渣中加入50mL滅菌稀釋液邊振蕩邊洗滌，振蕩速率為70次/分鐘，振蕩時間為20分鐘，得到第一次洗滌液和第一次濾渣，對第一次濾渣按第一次洗滌條件進行洗滌，得到第二次洗滌液和第二次濾渣，對第二次濾渣按第一次洗滌條件進行洗滌，得到第三次洗滌液和第三次濾渣，合并第一次洗滌液、第二次洗滌液和第三次洗滌液，得到合并液；
(3)在合并液中加入濃度為lOmg/mL的沙門氏菌免疫磁珠緩沖液10-40y L，在溫度25°C下振蕩，振蕩速率為70次/分鐘，振蕩時間為30分鐘，得振蕩物；
(4)將振蕩物在轉速1800轉/分鐘條件下離心分離5分鐘，接著在轉速10000轉/分鐘條件下離心分離10分鐘，除去上清液，得到離心沉淀物；
(5)在離心沉淀物中加入500mL緩沖蛋白胨水增菌液(參照國標GB4789系列)，溫度 36°C培養24小時，得到培養液；
(6)在ImL培養液中加入10mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(參照國標GB4789系列)，溫度36 °C下培養24小時，所得培養物用全自動細菌檢測系統(VIDAS )檢測其中沙門氏菌的含量，檢測得到的沙門氏菌含量即為脫水蒜制品中沙門氏菌的含量。所述滅菌稀釋液的配置方法稱取34. Og的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用175mL的lmol/L氫氧化鈉溶液調節pH7. 2，用蒸餾水稀釋至IOOOmL定容作為貯存液備用。取貯存液I. 25mL，用蒸餾水稀釋至IOOOmL,分裝于適宜容器中，121°C高壓滅菌15分鐘。所述濾膜孔徑為330 u m、直徑50mm。本發明的有益技術效果
(1)本發明通過免疫磁珠捕獲樣液中少量的目標菌，再將其從脫水蒜制品樣品均質液中分離出來，以解決該檢測難題。免疫磁珠分離技術很好地解決了脫水蒜制品中大蒜素抑菌作用對沙門氏菌檢測的影響； (2)免疫磁珠分離技術檢測靶細菌特異性強、靈敏度高，可以明顯提高檢測靶細菌的準 確性；
(3)本發明實現了脫水蒜制品中沙門氏菌的快速檢測，檢測時間僅需48小時。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明作進一步地說明。I材料與儀器
I.I材料
沙門氏菌菌種{salmonella )由北京蘭波瑞公司提供，沙門氏菌免疫磁珠緩沖液購自上海嘉禾生物科技有限公司，各種培養基由北京路橋公司提供，樣品來自安徽東乾食品有限公司送檢樣品留樣；緩沖蛋白胨水增菌液和亞硒酸鹽胱氨酸增菌液配置參照國標GB4789系列；
1.2儀器
臺式高速冷凍離心機(BECKMAN 64R)，立式高速冷凍離心機(BECKMAN J30I )，微量加樣器0. 5 ii L 10 ii L，10 ii L 100 ii L，高壓滅菌鍋，VIDAS 30全自動細菌檢測系統BAX Q7微生物檢測系統，恒溫搖床。2方法與結果
2.I免疫磁分離技術條件優化
取蒜粉25g，人工定量添加(一個麥氏單位)沙門氏菌菌種，加入225mL滅菌稀釋液，均質后經過帶濾膜的均質袋過濾，濾膜孔徑為330 V- m、直徑50mm,吸取濾液,移入500 mL離心瓶中。對濾渣進行第一次洗滌，即在濾渣中加入50mL滅菌稀釋液邊振蕩邊洗滌，振蕩速率為70次/分鐘，振蕩時間為20分鐘，得到第一次洗滌液和第一次濾渣，對第一次濾渣按第一次洗滌條件進行洗滌，得到第二次洗滌液和第二次濾渣，對第二次濾渣按第一次洗滌條件進行洗滌，得到第三次洗滌液和第三次濾渣，合并第一次洗滌液、第二次洗滌液和第三次洗滌液，得到合并液；
在合并液中加入濃度為lOmg/mL沙門氏菌免疫磁珠緩沖液(Dynabeads) 10_40iiL，在溫度25°C下柔和振蕩，振蕩速率為70次/分鐘，振蕩時間為30分鐘，得振蕩物；將振蕩物在轉速1800轉/分鐘條件下離心分離5分鐘，接著在轉速10000轉/分鐘條件下離心分離10分鐘，除去上清液，得到離心沉淀物；
在離心沉淀物中加入500 mL緩沖蛋白胨水增菌液，溫度36°C培養24小時，得到培養液；
在ImL培養液中加入10 mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，溫度36°C下培養24小時，所得培養物用全自動細菌檢測系統(VIDAS)檢測其中沙門氏菌的含量，檢測得到的沙門氏菌含量即為脫水蒜制品中沙門氏菌的含量。表I免疫磁分離技術捕獲沙門氏菌條件優化
2.2檢測方法靈敏度測定
取蒜粉25g，人工定量添加(一個麥氏單位)沙門氏菌菌種，加入225mL滅菌稀釋液，均質后經帶濾膜的均質袋過濾(濾膜孔徑為330 V- m、直徑50mm),吸取濾液,移入500 mL離心瓶中。在濾渣中加入50mL滅菌稀釋液邊振蕩邊洗滌(振蕩速率為70次/分鐘，振蕩時間為20分鐘)得到第一次洗滌液和第一次濾渣，對第一次濾渣按第一次洗滌條件進行洗滌，得到第二次洗滌液和第二次濾渣，對第二次濾渣按第一次洗滌條件進行洗滌，得到第三次洗滌液和第三次濾渣，將第一次洗滌液、第二次洗滌液和第三次洗滌液合并為合并液；
合并液中加入濃度為lOmg/mL沙門氏菌免疫磁珠緩沖液40 u L，在溫度25°C下振蕩(振蕩速率為70次/分鐘，振蕩時間為30分鐘)得振蕩物；
將振蕩物在轉速1800轉/分鐘條件下離心5分鐘，接著在轉速10000轉/分鐘條件下離心10分鐘，除去上清液，得到離心沉淀物；在離心沉淀物中加入500 mL緩沖蛋白胨水增菌液，溫度36°C培養24小時，得到培養液；
在ImL培養液中加入10 mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，溫度36°C下培養24小時，所得培養物用全自動細菌檢測系統(VIDAS)檢測其中沙門氏菌的含量。表2免疫磁珠法檢測方法靈敏度測定2.3研究顯示在使用沙門氏菌免疫磁珠時，用量為40ii L、孵育時間達到20分鐘，既可滿足檢測要求，又相對節省試劑 和時間。菌量稀少時適當延長孵育時間，增加免疫磁珠用量會有正面意義。
權利要求
1.一種檢測脫水蒜制品中沙門氏菌的方法，其特征是 (1)取蒜粉25g，加入225mL滅菌稀釋液均質，經過有濾膜的均質袋過濾，吸取濾液，并得到濾渣； (2)對濾渣進行第一次洗滌，即在濾渣中加入50mL滅菌稀釋液邊振蕩邊洗滌，振蕩速率為70次/分鐘，振蕩時間為20分鐘，得到第一次洗滌液和第一次濾渣，對第一次濾渣按第一次洗滌條件進行洗滌，得到第二次洗滌液和第二次濾渣，對第二次濾渣按第一次洗滌條件進行洗滌，得到第三次洗滌液和第三次濾渣，合并第一次洗滌液、第二次洗滌液和第三次洗滌液，得到合并液； (3)在合并液中加入濃度為lOmg/mL的沙門氏菌免疫磁珠緩沖液10-40y L，在溫度.25°C下振蕩，振蕩速率為70次/分鐘，振蕩時間為30分鐘，得振蕩物； (4)將振蕩物在轉速1800轉/分鐘條件下離心分離5分鐘，接著在轉速10000轉/分鐘條件下離心分離10分鐘，除去上清液，得到離心沉淀物； (5)在離心沉淀物中加入500mL緩沖蛋白胨水增菌液(參照國標GB4789系列)，溫度.36°C培養24小時，得到培養液； (6)在ImL培養液中加入10mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(參照國標GB4789系列)，溫度.36 °C下培養24小時，所得培養物用全自動細菌檢測系統(VIDAS )檢測其中沙門氏菌的含量，檢測得到的沙門氏菌含量即為脫水蒜制品中沙門氏菌的含量。
2.如權利要求I所述一種檢測脫水蒜制品中沙門氏菌的方法，其特征在于所述滅菌稀釋液的配置方法稱取34. Og的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用175mL的lmol/L氫氧化鈉溶液調節PH7. 2，用蒸餾水稀釋至IOOOmL定容作為貯存液備用； 取貯存液I. 25mL，用蒸餾水稀釋至IOOOmL,分裝于適宜容器中，121°C高壓滅菌15分鐘。
3.如權利要求I所述一種檢測脫水蒜制品中沙門氏菌的方法，其特征在于所述濾膜孔徑為330 u m、直徑50mm。
全文摘要
本發明公開了采用免疫磁珠分離技術檢測脫水蒜制品中沙門氏菌的方法。該方法包括如下操作步驟(1)將蒜粉加入滅菌稀釋液，均質后經帶濾膜的均質袋過濾，得濾渣；(2)用滅菌稀釋液邊振蕩邊洗滌濾渣三次，合并三次的洗滌液；(3)將沙門氏菌免疫磁珠緩沖液和合并的洗滌液振蕩；(4)離心分離，得到離心沉淀物；(5)在離心沉淀物中加入緩沖蛋白胨水增菌液，培養24小時；(6)移取培養液，再加入亞硒酸鹽胱氨酸增菌液進行增菌培養，培養結束后使用全自動細菌檢測系統(VIDAS)檢測脫水蒜制品中沙門氏菌。本發明利用免疫磁珠技術建立脫水蒜制品中沙門氏菌的快速檢測，這一技術具有特異性強、靈敏度高的優點。
文檔編號C12Q1/10GK102703571SQ201210181068
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月5日 優先權日2011年6月29日
發明者嚴軼, 余曉峰, 姚劍, 孫娟娟, 宗凱, 李云飛, 鄭海松, 陳雪嬌 申請人:安徽出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心