專利名稱：小鼠卵巢表面上皮細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學領(lǐng)域，具體的涉及一種小鼠卵巢表面上皮細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定技術(shù)。
背景技術(shù)：
卵巢癌是婦科三大腫瘤之一，由于目前尚無較好的檢測指標，其早期診斷率低，致死率高，預后差。大約80%-90%的卵巢癌起源于卵巢表面上皮細胞。為了更深入了解上皮細胞性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制，需要建立一個小鼠卵巢表面上皮細胞的體外研究模型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種小鼠卵巢表面上皮細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定技術(shù)，更深入了解上皮細胞性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制，提供一種較好的卵巢癌檢測指標。樣處理廠的告知系統(tǒng)為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
一種小鼠卵巢表面上皮細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定技術(shù)，包括以下步驟:
a.小鼠卵巢表面上皮細胞的分離與培養(yǎng)
步驟1:在超凈臺下，取4只6 - 8周齡未生育過的健康雌性C57BL/6小鼠的卵巢，放置在含400 IU/ml青霉素、鏈霉素的PBS (1000 ml雙蒸水，NaCl 8.0 g, KCl 0.2 g ,Na2HPO4.12H20 3.58 g , KH2PO4 0.2 g , PH 為 7.4)緩沖液中；
步驟2:用無菌的PBS溶液 輕輕沖洗卵巢3次，剝離卵巢被膜、脂肪組織及殘留的輸卵管組織，將剝離后的卵巢放置在裝有胰酶(0.25 %胰酶+EDTA，271:預熱)的1.5 ml EP管中，在37°C含有5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中消化，為使卵巢表面充分接觸胰酶，應盡量使卵巢分離開來；
步驟3:30 min后，從培養(yǎng)箱中取出1.5 ml EP管，上下?lián)u動10次左右，取出卵巢并將其轉(zhuǎn)移到另一個裝有胰酶(0.25 %胰酶+EDTA)的1.5 ml EP管中進行第二次消化。在原1.5ml EP管中加入完全培養(yǎng)基終止消化，將包含有上皮細胞的液體離心(1000r/min，5 min),棄上層液，加入I ml完全培養(yǎng)基緩慢吹打6 - 10次，收集含小鼠卵巢表面上皮細胞的懸液，移入35 mm培養(yǎng)皿，在37°C含有5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中孵育；第二次消化的步驟與第一次相同；
步驟4:實驗的第2 d應盡量避免移動培養(yǎng)皿，利于細胞貼壁生長，同時能夠維持細胞周圍的微環(huán)境穩(wěn)定。在實驗的第3 d根據(jù)細胞生長情況換液。早期傳代細胞培養(yǎng)間隔8 -10 d按1:2比例傳代，晚期傳代細胞培養(yǎng)間隔為3 - 5 d按1:5傳代；
b.免疫熒光法定性定量鑒定小鼠卵巢表面上皮細胞純度
步驟1:在無菌超凈臺中將第2代的MOSEC用胰酶(0.25 %胰酶+EDTA)消化，接種到24孔板中的爬片上，在37°C含有5 % 二氧化碳的培養(yǎng)箱中孵育，待細胞密度達到80 %時，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次；步驟2:用4 %的多聚甲醛溶液固定細胞30 min后，用I % TritonX-1OO穿透10 min再用5%封閉液室溫封閉30 min ；
步驟3:加入1:500稀釋的一抗pan ant1-cytokeratin,在4°C濕盒中過夜,用PBS漂洗 3 X 3 min ；
步驟4:加入1:1000稀釋的二抗山羊抗小鼠IgG，37°C避光反應1.5 h，再用PBS漂洗3X3 min ；
步驟5:加入10μ g/ml稀釋的DAPI，染色15 min,用PBS漂洗3X3 min，用抗淬滅劑封固，在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察，在100倍視野下每孔隨機取20個視野檢測，計數(shù)每個視野內(nèi)的陽性細胞數(shù)(NI)和細胞總數(shù)(N)比值，計算細胞陽性率，陽性率=NI/NX 100%。進一步的，所述完全培養(yǎng)基是包含5 % FBS、1 % Penicillin-Streptomycin、10ng/ml mEGF、10 % Insulin-Transferrin-selenium-A 和 0.5 mg/ml hydrocortisone 的DMEM/F12培養(yǎng)液。c.免疫組織化學法檢測小鼠卵巢表面上皮細胞分離效果
步驟1:同一批次的未處理過的完整小鼠卵巢和用胰酶消化過的小鼠卵巢分別放到4%甲醛中4°C過夜；
步驟2:用石蠟包被卵巢后切成10 μ m組織切片；
步驟3:將脫石蠟的卵巢標本放到0.01 M檸檬酸鈉緩沖液中煮沸10 min, PBS漂洗； 步驟4:滴加正常山羊血清封閉液，待30 min甩去多余液體；
步驟 5:滴加 1:100 的一抗 pan ant1-cytokeratin 150 μ 1,4°C過夜，PBS 漂洗；步驟6:滴加1:100 0的二抗山羊抗小鼠IgG 150 4 1，置于37°〇I h，PBS漂洗；步驟7:DAB顯色5 - 10 min，PBS漂洗10 min，蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化，PBS漂洗10 - 15 min ,脫水、透明、封片、鏡檢。
權(quán)利要求
1.一種小鼠卵巢表面上皮細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定技術(shù)，其特征在于，包括以下步驟 a.小鼠卵巢表面上皮細胞的分離與培養(yǎng) 步驟I :在超凈臺下，取4只6 - 8周齡未生育過的健康雌性C57BL/6小鼠的卵巢，放置在含400 IU/ml青霉素、鏈霉素的PBS (1000 ml雙蒸水，NaCl 8.0 g, KCl O. 2 g ,Na2HPO4 · 12H20 3. 58 g , KH2PO4 O. 2 g , PH 為 7. 4)緩沖液中； 步驟2 :用無菌的PBS溶液輕輕沖洗卵巢3次，剝離卵巢被膜、脂肪組織及殘留的輸卵管組織，將剝離后的卵巢放置在裝有胰酶(O. 25 %胰酶+EDTA，271預熱)的1.5 ml EP管中，在37°C含有5 % 二氧化碳的培養(yǎng)箱中消化，為使卵巢表面充分接觸胰酶，應盡量使卵巢分離開來； 步驟3:30 min后，從培養(yǎng)箱中取出I. 5 ml EP管，上下?lián)u動10次左右，取出卵巢并將其轉(zhuǎn)移到另一個裝有胰酶(O. 25 %胰酶+EDTA)的1.5 ml EP管中進行第二次消化，在原1. 5 ml EP管中加入完全培養(yǎng)基終止消化，將包含有上皮細胞的液體離心(1000r/min，5min)，棄上層液，加入I ml完全培養(yǎng)基緩慢吹打6 - 10次，收集含小鼠卵巢表面上皮細胞的懸液，移入35 mm培養(yǎng)皿，在37°C含有5 % 二氧化碳的培養(yǎng)箱中孵育；第二次消化的步驟與第一次相同； 步驟4:實驗的第2 d應盡量避免移動培養(yǎng)皿，利于細胞貼壁生長，同時能夠維持細胞周圍的微環(huán)境穩(wěn)定，在實驗的第3 d根據(jù)細胞生長情況換液，早期傳代細胞培養(yǎng)間隔8 -·10 d按I :2比例傳代，晚期傳代細胞培養(yǎng)間隔為3 - 5 d按I :5傳代；· b.免疫熒光法定性定量鑒定小鼠卵巢表面上皮細胞純度 步驟I :在無菌超凈臺中將第2代的MOSEC用胰酶(O. 25%胰酶+EDTAM^t接種到24孔板中的爬片上，在37°C含有5 %二氧化碳的培養(yǎng)箱中孵育，待細胞密度達到80 %時，棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次； 步驟2 :用4%的多聚甲醛溶液固定細胞30 min后，用1% TritonX-IOO穿透10 min再用5%封閉液室溫封閉30 min ； 步驟3 :加入I :500稀釋的一抗pan anti-cytokeratin,在4°C濕盒中過夜,用PBS漂洗 3 X 3 min ； 步驟4 :加入I :1000稀釋的二抗山羊抗小鼠IgG，37°C避光反應I. 5 h，再用PBS漂洗·3X3 min ； 步驟5:加入10μ g/ml的DAPI，染色15 min，用PBS漂洗3X3 min，用抗淬滅劑封固，在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察，在100倍視野下每孔隨機取20個視野檢測，計數(shù)每個視野內(nèi)的陽性細胞數(shù)(NI)和細胞總數(shù)(N)比值，計算細胞陽性率，陽性率=NI/ NX100 %， c.免疫組織化學法檢測小鼠卵巢表面上皮細胞分離效果 步驟I :同一批次的未處理過的完整小鼠卵巢和用胰酶消化過的小鼠卵巢分別放到4%甲醛中4°C過夜； 步驟2 :用石蠟包被卵巢后切成10 μ m組織切片； 步驟3 :將脫石蠟的卵巢標本放到0. 01 M檸檬酸鈉緩沖液中煮沸10 min, PBS漂洗； 步驟4 :滴加正常山羊血清封閉液，待30 min甩去多余液體； 步驟 5 :滴加 I 100 的一抗 pan anti-cytokeratin 150 μ 1,4°C過夜,PBS 漂洗； 步驟6:滴加I :1000的二抗山羊抗小鼠IgG 150 μ 1，置于37°C I h，PBS漂洗；步驟7:DAB顯色5 - 10 min，PBS漂洗10 min，蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化，PBS漂洗10 - 15 min ,脫水、透明、封片、鏡檢。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小鼠卵巢表面上皮細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定技術(shù)，其特征在于所述完全培養(yǎng)基是包含 5% FBS> 1% Penicillin-Streptomycin, 10ng/mlmEGF, 10%InsuIin-Transferrin-selenium-A 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小鼠卵巢表面上皮細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定技術(shù)，包括步驟為小鼠卵巢表面上皮細胞的分離與培養(yǎng)；免疫熒光法定性定量鑒定小鼠卵巢表面上皮細胞純度；免疫組織化學法檢測小鼠卵巢表面上皮細胞分離效果。本發(fā)明提供了一種較好的小鼠卵巢表面上皮細胞分離、培養(yǎng)和鑒定的方法，為更好地了解小鼠卵巢表面上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的特征提供了實驗模型，為更深入研究上皮細胞性卵巢癌的發(fā)病原因、發(fā)生發(fā)展機制，提供了新的實驗手段，有助于進一步尋找卵巢癌的早期篩查指標。
文檔編號C12N5/071GK103255099SQ20121018391
公開日2013年8月21日 申請日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者李冰燕, 張增利, 張鶴美, 胡志勇, 劉華清 申請人:蘇州大學