原發(fā)性高血壓基因無創(chuàng)檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測原發(fā)性高血壓基因無創(chuàng)檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測ACE基因上I/D、AGTR1基因上A1166C、NOS3基因上G894T、AGT基因上M235T、ADRB2基因上Arg16Gly以及CYP11B2基因上C-344T的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測與原發(fā)性高血壓發(fā)生密切相關(guān)的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型從基因?qū)用鎭碓u估人群原發(fā)性高血壓發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)級別，提早預(yù)防疾病的發(fā)生。本發(fā)明采樣方法是口腔黏膜細(xì)胞采樣，無痛、無創(chuàng)、避免了交叉感染。測序檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可靠，不必購置價(jià)格昂貴的進(jìn)口專用儀器，方法易普及推廣。
【專利說明】原發(fā)性高血壓基因無創(chuàng)檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種原發(fā)性高血壓的基因檢測試劑盒，根據(jù)檢測結(jié)果從基因?qū)用嬖u估人群原發(fā)性高血壓發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)級別，并且指導(dǎo)原發(fā)性高血壓高危人群提早預(yù)防和治療。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性高血壓是危害人類生命健康的世界性公共衛(wèi)生問題之一。作為主要危險(xiǎn)因素，它所導(dǎo) 致的腦卒中、冠心病、心功能不全、腎臟疾病等，在總患病率和總死亡率中所占的比例日趨增高，已上升為各類疾病死亡率的首位，給家庭和社會帶來了很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。預(yù)計(jì)到2020年，冠心病和腦卒中將成為全球排名第一位和第四位的疾病，因此，深入探索高血壓病因，開展高血壓易感基因的研究是十分重要的現(xiàn)實(shí)課題。
[0003]人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)基因全長21kb，包含26個(gè)外顯子，在16號內(nèi)含子存在插入(I)或缺失(D)多態(tài)性，血清ACE活性高低不同在不同ACE基因型人群中依次為DD>DI>II型。血中的ACE影響著血管緊張素I (Ang I)向活性較強(qiáng)的血管緊張素II (AngII)轉(zhuǎn)換，其結(jié)果不但影響內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而且對于血管彈性的維持也具有重要作用。ACE基因還能滅活緩激肽、速激肽等，而這兩種多肽可以降低血壓。
[0004]AGTRl基因能夠介導(dǎo)血管收縮、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，使血管變厚。當(dāng)A1166C位點(diǎn)為AC基因型時(shí)，AGTRl蛋白表達(dá)量增加，血管壁張力增加、血管壁厚度增加，增加高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
[0005]內(nèi)源性一氧化氮合酶(eN0S3/N0S3)是一氧化氮(NO)合成的限速酶，NO是外周與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)，在心血管系統(tǒng)具有維持血管張力，調(diào)節(jié)血壓等功能。一旦eN0S3基因突變，NO生成不足，即可引起高血壓。
[0006]血管緊張素原(AGT)基因定位于lq42 _43，是目前最有代表性、研究最多的血壓調(diào)節(jié)候選基因。能夠介導(dǎo)血管收縮、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，使血管變厚。1992年Jeunemaitre等使用原發(fā)性高血壓家系中同胞患者配對的方法(sib - pair),最先證實(shí)AGT基因M235T多態(tài)性與高血壓相關(guān)基因連鎖。
[0007]ADRB2基因通過改變血管緊張性，調(diào)節(jié)腎素釋放，影響水鹽代謝等途徑調(diào)節(jié)血壓。當(dāng)Argl6Gly位點(diǎn)為AG基因型時(shí)，ADRB2蛋白活性降低，血管擴(kuò)張反應(yīng)減弱，導(dǎo)致血管阻力增加，增加高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
[0008]血中醛固酮水平與醛固酮合成酶活性密切相關(guān)，該酶是體內(nèi)合成醛固酮的重要催化酶。其基因CYP11B2定位于8號染色體上(8q22)，總長約7kb，含8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子。常見的變異位于啟動(dòng)子區(qū)域-344處，發(fā)生C與T的交換。研究表明，CYP11B2基因C-334T多態(tài)性與血中醛固酮水平，高血壓病等密切相關(guān)。
[0009]因此，建立簡單、快速的原發(fā)性高血壓易感基因無創(chuàng)檢測方法，能夠檢測出人群原發(fā)性高血壓疾病發(fā)生相關(guān)的基因單核苷酸位點(diǎn)基因型，及時(shí)篩查出易患原發(fā)性高血壓的高危人群，有針對性的進(jìn)行指導(dǎo)和預(yù)防，對于降低疾病發(fā)生、保障人群的安全健康具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]基于ACE 基因上 I/D、AGTR1 基因上 A1166C、N0S3 基因上 G894T、AGT 基因上 M235T、ADRB2基因上Argl6Gly以及CYPl 1B2基因上C-344T的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型可用來評估原發(fā)性高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)級別，本發(fā)明提供一種原發(fā)性高血壓基因無創(chuàng)檢測試劑盒。
[0011]該試劑盒包括:
檢測ACE基因上I/D、AGTRl基因上A1166C、N0S3基因上G894T、AGT基因上M235T、ADRB2基因上Argl6Gly以及CYPl 1B2基因上C-344T的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對及DNA測序引物；
PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)；
PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA測序反應(yīng)組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0012]本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:
PCR 反應(yīng)體系:10 XPCR 反應(yīng)緩沖液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul ；
PCR 產(chǎn)物純化體系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20 3.875ul ；測序反應(yīng)體系:25%BigDye mix lul ；3.2uM DNA 測序引物 lul ；125mM EDTA 溶液 lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0013]本試劑盒供一人份檢測使用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
[0014]
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0016]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0017]
實(shí)施例1.檢測試劑盒的使用
1、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細(xì)胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
[0018]2、PCR擴(kuò)增反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對:
(1)ACE (Ι/D)正向引物:5’ GAGCCACTCCCATCCTTTCT3’
ACE (Ι/D)反向引物:5’ CCAGCCCTTAGCTCACCTCT3’
(2)AGTRl (A1166C)正向引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’AGTRl (A1166C)反向引物:5’GTGGCTTTGCTTTGTCTTGTT3’
(3 ) N0S3 (G894T)正向引物:5’ ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3’
N0S3 (G894T)反向引物:5’CCTCACCTCCAGGATGTTGT3’
(4)AGT (M235T)正向引物:5’ CTGACAGGCTACAGGCAATC3’
AGT (M235T)反向引物:5’ CACATAGTAGGGCAGCAGGT3’
(5)ADRB2 (Argl6Gly)正向引物:5’ CACATAACGGTGCAGAACG3’
ADRB2 (Argl6Gly)反向引物:5’AGCACATTGCCAAACACG3’
(6)CYP11B2 (C-344T)正向引物:5’AAACCCACAGCATGTTGACC3’
CYPl 1B2 (C-344T)反向引物:5’ CTCCTTTCTCCAGGGCTGA3’
PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5ul ;25mM的dNTP混合液0.2ul、5U/ul Taq 酶 0.125ul、DNA 模板 lul (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ul、ddH2019.175ul ；
反應(yīng)條件為:94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環(huán)28次，最后72°C延長5分鐘以上。
[0019]3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化 使用檢測試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去離子水 3.875ul。
[0020]在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min，72°C、20min。
[0021]4、DNA測序反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測序引物:
(1)ACE(Ι/D)測序引物:5’GAGCCACTCCCATCCTTTCT3’
(2)AGTRl (A1166C)測序引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’
(3)N0S3 (G894T)測序引物:5’ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3’
(4)AGT (M235T)測序引物:5’CTGACAGGCTACAGGCAATC3’
(5)ADRB2 (Argl6Gly)測序引物:5’CACATAACGGTGCAGAACG3’
(6)CYP11B2 (C-344T)測序引物:5’ AAACCCACAGCATGTTGACC3’
反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA測序引物lul，去離子水2ul。
[0022]在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98°C 2min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的960C 30s，55°C 30s,60°C 4min。
[0023]反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。
[0024]5、基因型分析
熟悉DNA測序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點(diǎn)的基因型。
[0025]實(shí)施例2.為人群進(jìn)行預(yù)防原發(fā)性高血壓基因無創(chuàng)檢測的服務(wù)
1.采樣及抽提DNA由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用酚氯仿法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提
2.基因型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的ACE基因上I/D、AGTRl基因上A1166C、N0S3 基因上 G894T、AGT 基因上 M235T、ADRB2 基因上 Argl6Gly 以及 CYPl 1B2 基因上C-344T的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分別進(jìn)行DNA測序，確定這6個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型。
[0026]3.原發(fā)性高血壓高危人群風(fēng)險(xiǎn)評估分析
通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具原發(fā)性高血壓風(fēng)險(xiǎn)評估分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說明了受檢者ACE基因上I/D、AG TRl基因上A1166C、N0S3基因上G894T、AGT基因上M235T、ADRB2基因上Argl6Gly以及CYPl 1B2基因上C-344T的6個(gè)SNP位點(diǎn)基因檢測信息以及遺傳風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果。除此之外，根據(jù)受檢者的風(fēng)險(xiǎn)級別，并由醫(yī)師向受檢者詳細(xì)說明和解讀人群原發(fā)性高血壓基因無創(chuàng)檢測報(bào)告單。
【權(quán)利要求】
1.一種篩查原發(fā)性高血壓高危人群的基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于:檢測ACE基因上I/D、AGTRl基因上Al 166C、N0S3基因上G894T、AGT基因上M235T、ADRB2基因上Argl6Gly以及CYP11B2基因上C-344T的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對是指針對ACE基因上I/D、AGTRl基因上Al 166C、N0S3基因上G894T、AGT基因上M235T、ADRB2基因上Argl6Gly以及CYP11B2基因上C-344T的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，能特異性擴(kuò)增出包含這6個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的DNA測序引物是針對ACE基因上I/D、AGTRl 基因上 A1166C、N0S3 基因上 G894T、AGT 基因上 M235T、ADRB2 基因上 Argl6Gly以及CYPl 1B2基因上C-344T的6個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過DNA測序技術(shù)特異性檢測出上述6個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的DNA測序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的6對特異性引物序列如下: (1)ACE (Ι/D)正向引物:5’ GAGCCACTCCCATCCTTTCT3’ ACE (Ι/D)反向引物:5’ CCAGCCCTTAGCTCACCTCT3’ (2)AGTRl (A1166C)正向引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’ AGTRl (A1166C)反向引物:5’GTGGCTTTGCTTTGTCTTGTT3’
(3 ) N0S3 (G894 T)正向引物:5’ ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3’
N0S3 (G894T)反向引物:5’CCTCACCTCCAGGATGTTGT3’ (4)AGT (M235T)正向引物:5’ CTGACAGGCTACAGGCAATC3’
AGT (M235T)反向引物:5’ CACATAGTAGGGCAGCAGGT3’ (5)ADRB2 (Argl6Gly)正向引物:5’ CACATAACGGTGCAGAACG3’
ADRB2 (Argl6Gly)反向引物:5’AGCACATTGCCAAACACG3’ (6)CYP11B2 (C-344T)正向引物:5’AAACCCACAGCATGTTGACC3’ CYPl 1B2 (C-344T)反向引物:5’ CTCCTTTCTCCAGGGCTGA3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的6條DNA測序引物序列如下: (1)ACE(Ι/D)測序引物:5’GAGCCACTCCCATCCTTTCT3’ (2)AGTRl (A1166C)測序引物:5’AAGCCAAATCCCACTCAAAC3’ (3)N0S3 (G894T)測序引物:5’ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3’ (4)AGT (M235T)測序引物:5’CTGACAGGCTACAGGCAATC3’ (5)ADRB2 (Argl6Gly)測序引物:5’CACATAACGGTGCAGAACG3’ (6)CYP11B2 (C-344T)測序引物:5’AAACCCACAGCATGTTGACC3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括: (1)?0?反應(yīng)體系:10父？0?反應(yīng)緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 產(chǎn)物純化體系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH20.3.875ul ； (3)測序反應(yīng)體系:25%BigDye mixlul, 3.2uM DNA測序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul,70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本試劑盒供一 人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468782SQ201210184472
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月6日
【發(fā)明者】鄭俊斌 申請人:解碼（上海）生物醫(yī)藥科技有限公司