高血壓易感性無創檢測試劑盒（gnb3等基因）的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種檢測高血壓易感基因無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測GNB3基因上C825T(rs5443)、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、TGF-Β1基因上T869C(rs1982073)的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應組件、PCR產物純化組件、DNA測序反應組件等。本發明的試劑盒通過檢測與高血壓發生密切相關的3個單核苷酸多態性位點的基因型從基因層面來評估高血壓發病的風險級別，指導人群提早預防疾病發生。本發明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛無創、避免了交叉感染。測序檢測結果準確可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
【專利說明】高血壓易感性無創檢測試劑盒(GNB3等基因)
【技術領域】
[0001]本項目屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體涉及一種高血壓易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因層面評估高血壓發病的風險級別，并作為預防和治療高血壓的方向指導。
【背景技術】
[0002]高血壓是指在靜息狀態下動脈收縮壓和/或舒張壓增高為主要臨床表現的綜合癥，可分為病因不明的原發性高血壓和由明確獨立疾病所引起的繼發性高血壓。其中，原發性高血壓患者占高血壓患者總數的95%以上。有調查結果顯示，59%的原發性高血壓患者都有家族史，說明遺傳因素對于高血壓的發生具有重要影響。長期高血壓是造成心腦血管疾病死亡的重要原因。因此開發出一種高效、便捷的高血壓易感性檢測技術將對于預防和治療高血壓具有積極的意義。目前已經有研究表明G蛋白β3亞基(GNB3)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和轉化生長因子β I (TGFβ I)等基因的多態性均與高血壓的易感性有直接關聯，在預防和治療高血壓中具有一定的預測價值。
[0003]G蛋白是一種重要的細胞信號轉導蛋白，在細胞膜受體和效應蛋白間的信號傳遞中起著重要的中介作用。GNB3的第825位C — T突變(C825T)會導致表達產生一個截短型的但是具有功能活性的剪接變異體GNB3s。在高加索人群中攜帶有825Τ等位基因的人患高血壓的危險性顯著增加。在漢族人群的單基因分析中尚未發現GNB3基因C825T基因多態性與高血壓的直接相關性，但是在GNB3基因235Τ等位基因攜帶者中卻發現GNB3基因825Τ等位基因會顯著增加高血壓的發病危險。因此GNB3基因825Τ等位基因被認為是高血壓發病的一個危險因素。`
[0004]MTHFR是同型半胱氨酸(Hcy)代謝途徑中的關鍵酶。MTHFR基因的第677位C — T突變(C677T)會使其編碼的氨基酸從丙氨酸變為纈氨酸，從而影響酶的活性及熱穩定性并使血漿中Hcy濃度升高，而Hcy水平的升高與高血壓的發病密切相關。研究顯示原發性高血壓患者中MTHFR基因C677T位點的TT基因型頻率和T等位基因頻率均高于正常人群且677ΤΤ基因型對Hcy型高血壓的發病危險有顯著貢獻。因此MTHFR是高血壓發病的一個易感基因。
[0005]TGF^ I是具有多種生物活性的細胞因子，可調控內皮素生成并影響腎素-血管緊張素系統使血壓升高，在介導心血管疾病的發生中起著重要的作用。研究發現TGFii I第869位T — C突變(T869C)可使TGF0 I的血清水平上升并且在高血壓患者中C等位基因頻率有顯著增高。因此認為TGF β I基因的869C等位基因是通過上調了 TGF β I的表達水平而增加了高血壓的發病風險，是高血壓發病的一個危險因素。
[0006]綜上所述，鑒于GNB3基因、MTHFR基因和TGF^ I基因在高血壓疾病中體現出來的疾病相關性，可以通過檢測這些高血壓發生相關基因單核苷酸位點基因型及時篩查出易患高血壓的高危人群，從而有針對性地預防和治療，這對于降低高血壓的發病率有非常重要的意義。
【發明內容】

[0007]基于GNB3 基因上 C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF-B I 基因上T869C (rsl982073)的3個單核苷酸多態性位點基因型可用來評估高血壓發病風險級另O，本發明提供一種高血壓基因無創檢測試劑盒。
[0008]該試劑盒包括:
檢測 GNB3 基因上 C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF-B I 基因上T869C (rsl982073)的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)。
[0009]PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)。
[0010]DNA測序反應組件(包括BigDye mix, EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。
[0011]本發明試劑盒的組分和含量包括:
PCR 反應體系:10 XPCR 反應緩沖液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0012]PCR 產物純化體 系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
.3.875ul。
[0013]測序反應體系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 測序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0014]本試劑盒供一人份檢測使用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
【具體實施方式】
[0015]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0016]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0017]實施例1.檢測試劑盒的使用。
[0018]1、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
[0019]2、PCR擴增反應
使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對:
(1)GNB3 (C825T )正向引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’
GNB3 (C825T)反向引物:5’AAATGCCAGGAACCCAGAA3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’
(3 ) TGF- B I (T869C)正向引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’
TGF- B I (T869C)反向引物:5’ GCTTCCGCTTCACCAGCT3’。[0020]PCR擴增的反應體系為:10 X PCR反應緩沖液2.5ul ；25mM的dNTP混合液0.2ul、5U/ul Taq酶0.125ul、DNA模板lul (12_15ng左右)、20uM正向引物反向引物各
0.25ul、ddH20 19.175ul。
[0021]反應條件為:94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環28次，最后72°C延長5分鐘以上。
[0022]3、PCR擴增產物純化
使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去離子水 3.875ul。
[0023]在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min，72°C、20min。
[0024]4、DNA測序反應
使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物:
(1)GNB3 (C825T)測序引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’
(2)MTHFR (C677T)測序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
(3)TGF-B I (T869C)測序引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’
反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA測序引物lul，去離子水2ul。
[0025]在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0026]反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。
[0027]5、基因型分析
熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。
[0028]實施例2.為人群進行預防高血壓基因無創檢測的服務。
[0029]1.采樣及抽提DNA
由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。
[0030]2.基因型檢測
使用本發明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的GNB3基因上C825T (rs5443) ,MTHFR基因上C677T(rsl801133)、TGF-B I基因上T869C (rsl982073)的3個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這3個SNPs位點的基因型。
[0031]3.高血壓高危人群風險評估分析
通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具高血壓風險評估分析報告單。報告中詳細說明7受檢者 GNB3 基因上 C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF- B I 基因上T869C (rsl982073)的3個SNP位點基因檢測信息以及遺傳風險評估結果。除此之外，根據受檢者的風險級別，并由醫師向受檢者詳細說明和解讀高血壓基因無創檢測報告單。
【權利要求】
1.一種篩查高血壓高危人群的基因無創檢測試劑盒，其特征在于:檢測GNB3基因上C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF-B I 基因上 T869C (rsl982073)的3個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對是指針對GNB3基因上 C825T (rs5443)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、TGF- B I 基因上 T869C(rsl982073)的3個單核苷酸多態性位點，能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的DNA測序引物是針對GNB3基因上C825T (rs5443)、MTHFR基因上C677T (rsl801133)、TGF_B I 基因上T869C (rsl982073)的3個單核苷酸多態性位點而設計，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述3個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據權利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對特異性引物序列如下:
(I) GNB3 (C825T )正向引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’ GNB3 (C825T)反向引物:5’AAATGCCAGGAACCCAGAA3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’
(3)TGF- B I (T869C)正向引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’ TGF- B I (T869C)反向引物:5’ GCTTCCGCTTCACCAGCT3’。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下: (1)GNB3 (C825T)測序引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’ (2)MTHFR (C677T)測序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ (3)TGF-B I (T869C)測序引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括: (1)?0?反應體系:10父？0?反應緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 產物純化體系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)測序反應體系:25%BigDye mixlul, 3.2uM DNA測序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK103710425SQ201210373802
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年10月2日 優先權日:2012年10月2日
【發明者】石慧林 申請人:解碼（上海）生物醫藥科技有限公司