專利名稱：與冠心病相關的6號染色體易感區域標簽單核苷酸多態性位點及其組成的單體型與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及與冠心病相關的6號染色體易感區域標簽單核苷酸多態性位點及其組成的單體型與應用，具體涉及染色體6p21. 32上在C6orflO-BTNL2基因間的一段緊密連鎖區域內一系列區域標簽單核苷酸多態性位點、所述單核苷酸多態性位點組成的單體型及其檢測方法以及用于檢測人群冠心病患病風險中的應用。
背景技術：
動脈粥樣硬化性心腦血管病已成為世界范圍關注的主要健康問題。2004年的世界衛生組織(WHO)報告顯示，全世界每年心血管疾病以冠心病和腦卒中為主導致的死亡人數 達高達1720萬，占所有死亡人數的三分之一。預計2020年這一數字將進一步增加50%，高達2500萬，心血管疾病是全球人類的“頭號殺手”。在中國進行的一項大規模前瞻性研究也顯示，心臟疾病已經成為中國人群的主要死亡原因，分列男、女性死亡原因的第2位和第I位。我國每年新發心肌梗死50萬人，隨著生活方式的改變以及動脈粥樣硬化相關的危險因素持續增加，冠心病與心肌梗死發病也還將呈持續上升趨勢。大量的研究資料表明，冠心病是一種復雜疾病，是由多個微效基因與環境因素長期相互作用所致。因此鑒定出與冠心病相關的易感基因或致病基因，在人群中進一步篩選增加疾病風險的易感基因確定易感個體，將有助于冠心病的發病風險預測、新藥開發、診斷和個體化治療。從基礎到臨床，人們對此進行了大量的研究，并在冠心病的危險因素和冠心病發生的病理生理學方面積累了大量的知識，但是關于冠心病與心肌梗死發生的確切遺傳分子機制卻知之甚少，對于怎樣鑒定遺傳易感基因以及鑒定受試者的冠心病遺傳易感性，一直缺乏全面系統有效的識別方法。

發明內容
針對上述問題，本發明的一個目的是提供一種染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點；本發明的另一個目的是提供一種由染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點組成的染色體6p21. 32區域基因單體型，特別是提供一種由染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點組成的染色體6p21. 32區域基因危險性單體型；本發明的另一個目的是提供一種檢測本發明的染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點的方法；本發明的另一目的是提供一種檢測染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點的試劑在制備檢測染色體6p21. 32區域基因單體型的制劑或試劑盒中的應用；本發明的另一個目的是提供一種檢測染色體6p21. 32區域基因單體型的方法；本發明的另一目的是提供一種體外檢測冠心病相關基因的方法；本發明的另一目的是提供一種檢測染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點的試劑在制備用于體外檢測冠心病相關基因的制劑或試劑盒中的應用；本發明的另一目的是提供一種檢測染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點的試劑在制備用于體外檢測待測樣品中是否含有染色體6p21. 32區域基因危險性單體型的制劑或試劑盒中的應用；本發明的另一目的是提供一種體外檢測待測樣品中是否含有染色體6p21. 32區域基因危險性單體型的方法；本發明的另一目的是提供一種體外檢測來自待測個體的樣品中染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點的試劑在制備預測待測個體患冠心病的危險性的制劑或試劑盒中的應用；本發明的另一目的是提供一種體外預測待測個體患冠心病的危險性的方法；本發明的另一目的是提供一種檢測染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點的多態性的試劑盒。首先，本發明提供了染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點(tagging SNPs, tSNPs)，該位點分別為染色體6p21. 32區域基因的單核苷酸位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 rs2076529。上述多態性位點是在大量實驗的基礎上得出的。在本發明的具體實施方式
中，首先使用全基因組芯片(Affymetrix Axiom Genome-Wide CHB IArray Plate)芯片對 1515 例冠心病患者和 5019例正常人對全基因組范圍內SNP進行基因分型，利用芯片得到的數據，評價基因型和表型 的關聯關系，從而得到可能與冠心病之間存在潛在關聯的染色體區域；其次選擇相應染色體區域代表性的位點使用Fludigm@EPl GENETIC ANALYSIS system, Taqman MGB探針法進行基因分型實驗，進一步在15460例冠心病患者和11472例對照樣本中驗證。在數據分析中使用Haploview軟件計算染色體區域位點間的連鎖不平衡(Linkage disequilibrium,LD)情況，用r2表示(0-1),同時構建單體型(haplotype)比較其在患者和正常對照之間的單體型差異，驗證并確定冠心病的易感人群。使用logistic回歸分析評估每個SNP位點與冠心病的關系，計算危險等位基因的相對危險度(Odds ratio,OR)和95%的可信區間。本發明中，通過大量實驗研究分析首次得出，位于染色體6p21. 32上在C6orf 10-BTNL2基因間的一段緊密連鎖區域內(更具體地說該區域位于染色體6p21. 32上32368kb 32520kb區域間，數據來源人類基因組數據庫(Human，build36) 一系列SNP位點(rs9268402，rs442406，rs9268473, rs3817973, rs2076533, rs2076529，特別是 rs9268402)與冠心病易感性顯著相關，在本發明的大量實驗結果基礎上，這些SNPs可以作為染色體6p21. 32區域基因的標簽SNPs,為研究染色體6p21. 32區域基因功能提供了新的方法，在保證研究把握度的前提下，能夠有效減少研究環節，降低研究成本。在本發明的大量實驗結果基礎上，本發明的進一步研究發現，這一系列SNPs位點與冠心病易感性顯著相關，見表1，這些SNPs的危險等位基因分別是rs9268402多態性位點為G，rs442406多態性位點為A，rs9268473多態性位點為A，rs3817973多態性位點為C，rs2076533多態性位點為C，rs2076529多態性位點為T。攜帶這些危險等位基因的個體發生冠心病的相對風險是沒有攜帶者的I. 14-1. 17倍。其中染色體rs9268402多態性位點G等位基因攜帶者的冠心病發病風險是A等位基因的攜帶者的I. 17倍(OR= I. 17，95% Cl :1. 07-1. 27)，風險最高。rs9268402 多態位點與 rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533、rs2076529多態性位點具有強的連鎖不平衡(r2 > 0. 7)。本發明的研究結果進一步證實了 Chr6p21. 32區域多態位點與冠心病密切相關。在上述標簽SNP的基礎上，本發明又對由rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533和rs2076529組成的單體型進行了深入研究。結果發現由Chr6p21. 32 區域 rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 rs2076529 構建了 3種單體型GAACCT、AGGTTC和AAACCT，其中單體型GAACCT和AGGTTC在人群中最為常見，頻率分別為0. 597和0. 331，這兩個單體型與冠心病的易感性相關聯，其頻率在冠心病患者和正常人對照之間存在顯著性差異。冠心病風險單體型(危險性單體型)為GAACCT，在冠心病病例中的頻率為0. 626，顯著的高于對照組的頻率0. 589。從而，一方面，本發明提供了由本發明的標簽單核苷酸多態性位點組成的染色體 6p21. 32 區域基因單體型，該單體型在 rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 rs2076529 位點的單核苷酸分別為 G、A、A、C、C、T ;A、G、G、T、T、C ;或 A、A、A、C、C、T。其中，在 rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 rs2076529 位點的單核苷酸分別為G、A、A、C、C、T的單體型為染色體6p21. 32區域基因危險性單體型，本發明通過大量的確切的實驗結果說明了該問題，在校正年齡、BMI、高血壓、吸煙、飲酒后，攜帶該單體型的個體患冠心病的危險性比攜帶其他單體型的個體患冠心病的危險性顯著升聞。另一方面，本發明提供一種檢測本發明的染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷 酸多態性位點的方法。可用本領域已知的多種技術在DNA水平、RNA水平檢測本發明染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點。例如可以采用直接測序的方法，通過DNA直接測序可以直接揭示對照基因和攜帶突變基因之間的序列差異，具體可以是傳統的使用商業測序試劑盒或自動測序儀對DNA直接進行測序，或是近年來發展的焦磷酸測序(Pyrosequencing)、微測序(SNaPshot)等。焦磷酸測序技術適于對已知的短序列的測序分析，其原理是引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurytase)、突光素酶(Iuciferase)和三憐酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4種酶的協同作用下,將引物上每一個dNTP的聚合與一次突光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。SnaPshot技術平臺是Applied Biosystems,ABI公司推出了專為檢測SNP設計的分析軟件和試劑盒,可對多個SNP位點同時進行基因分型，也被稱為minisequencing，該方法針對不同突變位點設計不同長度的引物SNaPshot反應后,產物通過電泳分離、五色突光檢測、Gene mapper分析，可在一次電泳膠內檢測多個SNP位點。也可以采用基于雜交的方法,具體包括Taqman探針法,DNA芯片法等。TaqMan SNP基因分型原理利用核酸外切酶對5’特異等位基因染色標記的切除產生持續的檢驗信號，反應體系包括以基因組DNA或PCR產物為模板；一對PCR引物，以及分別用FAM和VIC標記的2條MGB探針檢測SNP的兩種類型；在PCR反應終點讀取分型數據。DNA芯片技術待測基因經提取后，被切成長短不一的片段，經熒光化學物質標記后，注射到嵌有芯片的載片上，由于DNA和探針雜交的程度與熒光強度相關，因此通過激光掃描，即可根據熒光強弱測出被檢測序列的變異。還可以采用基于引物延伸的方法，如基質輔助激光解析離子飛行時間質譜(MALDI-Tof-MS)。基質輔助激光解析離子飛行時間質譜檢測原理緊挨SNP位點設計一段探針，在反應體系中以ddNTP替代dNTP，使探針僅在SNP位點處延伸一個堿基即終止，根據SNP位點的不同，探針將結合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量，質譜儀即可檢測出這種分子量差異，從而實現SNP分型的目的。還可以采用基于構象的方法，具體例如限制性片段長度多態性(RFLP)分析、單鏈構象多態性(single-strand conformational polymorphism, SSCP)分析、變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)分析、變性高效液相色譜技術(denaturing high performance liquid chromatography, dHPLC)等分析技術。其中，RFLP的原理有些SNP多態位點正好處于限制性內切酶的識別位點處，其中一種多態對應的PCR擴增片斷能夠被相應的內切酶切動，而另一種卻不能，因此通過對酶切后的PCR產物電泳后的片斷長度分析可知檢測樣本在該位點處的基因型；如果檢測SNP位點不存在合適的酶切位點，往往可以通過在PCR引物3’端改變個別堿基引入限制性內切酶酶切位點，通過這種引物修飾法可以實現絕大多數SNP位點的分型都能用RFLP分析來實現。SSCP :在非變性的條件下，單鏈DNA具有一定的折疊結構，這種折疊結構是由它的核苷酸序列決定的，SSCP的靈敏性依賴于SNP對折疊的影響和折疊如何影響目的序列的電泳遷移率，其策略是，將PCR擴增的待測片段與去離子甲酰胺混合，接著95°C變性解鏈，再驟冷到冰中，然后通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；穩定的理想條件下，凝膠電泳分離的結果是在某一位置范圍內雜合子包含分隔很近的兩條帶，正常的DNA片段居于其中一條帶，純合突變SNP的DNA 片段居于另一條帶。DGGE :利用雙鏈DNA分子在一定梯度變性劑濃度的凝膠中電泳時，會在一定變性劑濃度下發生部分解鏈，導致電泳遷移率下降；分別具有一種SNP等位基因型的兩種DNA分子間即使只有一個堿基對的差異，也會在不同時間發生部分解鏈，從而被分離成兩條帶。DHPLC :該技術是一項在SSCP和DGGE基礎上發展起來的檢測SNP的突變技術，此技術將未知的DNA片段與野生型DNA混和，經加熱變性后再使其降溫重退火，若為有突變的DNA，此時所形成的雙螺旋有兩種，即為同源雙螺旋和異源雙螺旋，基于同源雙螺旋和異源雙螺旋解鏈溫度的不同，通過控制DHPLC的溫度，使其維持在接近DNA分子Tm值下運行，然后進行洗脫，越小的DNA分子與柱的親和力越小，就越容易洗脫下來；DNA經過PCR擴后，由于錯配堿基的存在而形成異源雙鏈，因為單鏈DNA所帶的電荷比雙鏈少，先被洗脫下來，而與正常的配對雙鏈分開，最后根據色譜峰的峰型或數目來確定SNP的有或無。還可以采用高分辨率溶解曲線分析技術(HRM)。該分析技術是依據在一定的溫度范圍內將PCR擴增的產物進行變性，期間實時檢測體系內熒光信號。熒光值隨著溫度變化， 可繪制溶解曲線。每一段DNA都有其獨特的序列，因而也就有了獨特的熔解曲線形狀，如同DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩定性和重復性。根據曲線準確區分野生型純合子、雜合子和突變性純合子。在具體實施時，本領域的技術人員可以根據實際情況選擇上述的任一種技術體外檢測本發明染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點。也可以采用多種技術的組合來體外檢測染色體6p21. 32區域基因序列的突變位點。例如，當限制性片斷長度多態性分析方法與PCR結合后，檢測靈敏性和特異性更高。當直接測序法與PCR結合使用時，檢測靈敏性大大提高。在本發明的一個具體實施方式
中，應用的是Taqman MGB方法，使用的是Fludigm@EPl GENETIC ANALYSIS system平臺，由于該平臺是屬于較高通量的基因分型平臺，在樣本數為96個樣本檢測96個位點(使用96. 96動態芯片)或48個樣本檢測48個位點(使用48. 48動態芯片)時，具有經濟高效的優點。而在具體到本發明的方案應用于少量待測樣品的分析檢測時，采用Fludigm@EPl GENETIC ANALYSISsystem平臺就不具備經濟性和效率上的優勢，此時可采用實時熒光定量PCR系統，如AppliedBiosystems的7900HT (Fast) real time PCR 系統、7500real time PCR 系統等，應用 Taqman-MGB 探針法對單個位點進行基因分型；也可以應用PCR-RFLP、HRM等其他基因分型方法。在上述檢測本發明的染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點的方法的基礎上，本發明還提供了檢測染色體6p21. 32區域基因的單核苷酸多態性位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 / 或 rs2076529 的試劑在制備檢測染色體6p21. 32區域基因單體型的制劑或試劑盒中的應用 。更具體地，所述檢測染色體6p21. 32區域基因的單核苷酸多態性位點的試劑可以為用于直接測序法的試劑；或用于聚合酶鏈式反應與限制性片斷長度多態性分析相結合(PCR-RFLP)的試劑；或用于聚合酶鏈式反應與直接測序法相結合的試劑；或用于以下任一種SNP分型方法的試劑基于雜交的方法、基于引物延伸的方法、基于構象的方法或高分辨率溶解曲線分析技術。另一方面，本發明還提供一種檢測染色體6p21. 32區域基因的危險性單體型的方法，該方法包括檢測染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點。檢測染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點的方法可以為本領域已知的任何檢測單核苷酸多態性的方法，例如可以為本說明書前面提到的直接測序法、基于雜交的方法、基于引物延伸的方法、基于構象的方法或高分辨率溶解曲線分析技術等檢測方法。此外，本發明檢測染色體6p21. 32區域基因的危險性單體型的方法還可包括對所述標簽單核苷酸多態性位點的檢測結果進行統計分析。例如，在本發明的一個實施方式中，該方法利用Haploview程序，校正年齡、BMI、高血壓、吸煙、飲酒后，對由本發明的標簽單核苷酸多態性位點的結果進行統計分析，尤其對由本發明的標簽單核苷酸多態性位點組成的單體型進行統計分析，從而得出了染色體6p21. 32區域基因的危險性單體型。另一方面，本發明還提供一種體外檢測冠心病相關基因的方法，該方法包括檢測染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533和/或rs2076529。本發明在大量實驗及統計分析的基礎上，選取了 16975例冠心病患者和16491例正常人為研究對象，以確切的實驗數據證明了染色體6p21. 32區域基因與冠心病的關系，從而提供了冠心病相關基因。從而，本發明還提供了檢測染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 / 或 rs2076529 的試劑在制備用于體外檢測冠心病相關基因的制劑或試劑盒中的應用。本發明還提供了檢測染色體6p21.32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 / 或rs2076529 的試劑在制備用于體外檢測待測樣品中是否含有染色體6p21. 32區域基因危險性單體型的制劑或試劑盒中的應用，其中，染色體6p21. 32區域基因危險性單體型在rs9268402位點的單核苷酸為G。更進一步地，染色體6p21. 32區域基因危險性單體型在rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 rs2076529 位點的單核苷酸分別為 G、A、A、C、C、T。另一方面，本發明還提供一種體外檢測待測樣品中是否含有染色體6p21. 32區域基因的危險性單體型的方法，該方法包括I)提取待測樣品的DNA，針對染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 / 或 rs2076529 設計引物進行PCR擴增；2)對全部PCR產物進行分析；
3)鑒定 rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 / 或rs2076529位點的單核苷酸多態，其構成的單體型是否為G-A-A-C-C_T、A-G-G-T-T-C或A-A-A-C-C-T。另一方面，本發明還提供一種體外檢測來自待測個體的樣品中染色體6p21.32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533和/或rs2076529的試劑在制備預測待測個體患冠心病的危險性的制劑或試劑盒中的應用。從另一角度而言，本發明還提供了一種體外預測待測個體患冠心病的危險性的方法，該方法包括體外檢測來自待測個體的樣品中染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533和/或rs2076529。其中，攜帶rs9268402位點的單核苷酸為G的個體或者攜帶由位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 rs2076529 的單核苷酸組成的單體型G-A-A-C-C-T的個體患冠心病的危險性比攜帶由位點rS9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 rs2076529 的單核苷酸組成的單體型 A-G-G-T-T-C 或A-A-A-C-C-T的個體患冠心病的危險性顯著升高。含有本發明的基因的待測樣品可以從受試者的細胞獲得，如來自血液、尿、唾液、胃液、頭發，活組織檢查和尸體解剖材料的細胞。優選來自血液。可以先從受試者的細胞獲得含有本發明的基因的待測樣品，然后按照常規方法提取基因的DNA。所述待測個體優選為中國漢族人。本發明通過大量的實驗，校正年齡、BMI、高血壓、吸煙、飲酒后，與單體型A-G-G-T-T-C或A-A-A-C-C-T相比，攜帶單體型G-A-A-C-C-T的個體患冠心病的危險顯著升高。在本發明大樣本的統計分析的基礎上，可以單獨使用本發明的方法，體外檢測來自待測個體的樣品中染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和rs2076529構成的單體型，以體外預測待測個體患冠心病的危險性,也可以同時考慮其他環境危險因素，例如是否吸煙、是否高血壓、是否糖尿病、是否血脂紊亂和是否有心梗家族史等，以達到體外預測待測個體患冠心病危險性的目的。另一方面，本發明還提供一種檢測染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點的多態性的試劑盒，試劑盒分別含有I)擴增 rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 / 或rs2076529位點的引物；2) PCR擴增酶及相應緩沖液；3)測定 rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 / 或rs2076529位點多態的試劑。所述試劑盒內可以裝有一個或多個容器，容器內裝有用以檢測含有所述多態性位點的染色體6p21. 32區域基因的一種或多種組分。按照具體檢測方法及檢測多態性位點的不同，試劑盒可含有不同組分。與之同時提供的可以是經政府藥物管理機構審核的、有關藥品或生物制品制造、使用及銷售的信息。本領域普通技術人員已知，擴增所述多態性位點的引物，可以依據本發明已知的核苷酸序列設計，通常為15-30個堿基，GC含量為45% -50%左右，在適當的溫度下與模板特異性結合，其可以利用專門的計算機程序設計，例如(Oligo
6.53軟件)。PCR擴增的酶可以為TaqDNA聚合酶、Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶等能夠用于PCR擴增的酶。試劑盒中檢測所述多態性的試劑根據檢測方法的不同而不同。例如，采用Taqman探針方法，試劑盒中可以含有用于檢測特異SNP位點的taqman_MGB探針；采用MALDI-TOF-MS方法，試劑盒中可以含用于檢測特異SNP位點的單堿基延伸引物；采用聚合酶鏈式反應與限制性片斷長度多態性分析相結合方法來檢測所述多態性位點時，試劑盒中可以含有限制性內切酶和相應的酶切圖譜。所述檢測染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點的多態性的試劑盒可以用于體外檢測冠心病相關基因，以及體外檢測待測個體患冠心病的危險性。綜上所述，本發明發現了與冠心病相關的染色體6p21. 32區域基因6個重要變異位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 rs2076529。其中rs9268402位點特別是所述6個位點的特定組合，大大增加了個體罹患冠心病的風險。這一發現在臨床上具有潛在的應用價值對染色體6p21. 32區域基因的這6個位點進行基因型鑒定，若是發現某個體攜帶G-A-A-C-C-T單體型，則該個體與攜帶A-G-G-T-T-C或A-A-A-C-C-T單體型的個體相比，患冠心病的風險顯著升高。據此，醫生可以指導該個體改 變不良生活習慣，降低環境因素對疾病的誘發。可見，染色體6p21. 32區域基因標簽SNP組成的單體型在冠心病的預測和預防中有重要的應用前景。


圖I為顯示chr6p21. 32區域SNP位點與冠心病的關聯圖表。其中，橫坐標為染色體位置，縱坐標為SNP位點與冠心病的關聯顯著性P值(-IogltlP)，代表位點rs9268402以
表不。圖 2 為實施例中使用 Fludigm@EPl GENETIC ANALYSIS system, Taqman MGB 探針法進行基因分型實驗時，進行Assay和Sample的加樣過程示意圖。圖3顯示96個樣本(94個待測樣本及2個陰性對照)代表位點rs9268402基因分型結果(聚類圖)。其中，X軸代表VIC熒光強度，Y軸代表FAM熒光；基因型結果1、紅色為A/A純合子，2、綠色為G/G純合子，3、藍色為A/G雜合子，4、黑色為陰性對照(NTC)。圖4 為應用 SNP Genotyping Analysis software version 3. 0 軟件進行數據分析時rs9268402位點的截屏圖。圖5為96個樣本(其中包含兩個陰性對照NTC)rs9268402基因分型數據導出結果(部分)截圖。
具體實施例方式為了更清楚地理解本發明，現參照下列實施例及附圖進一步描述本發明。實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發明。實施例中未注明具體條件的實驗方法為所屬領域熟知的常規方法和常規條件，或按照制造商所建議的條件。實施例一 chr6p21. 32基因標簽SNPs的選擇和檢測一、病例對照樣本入選標準冠心病病例包括心肌梗死患者和心絞痛患者。心肌梗死病例的入選診斷標準為急性心肌梗死診斷標準(根據WHO 1979年的診斷標準)即典型胸痛癥狀持續30分鐘以上；心電圖連續2個導聯ST段抬高(肢體導聯0. Imv,胸導聯0. 2mv)并有系列動態變化；心肌壞死的血清標記物濃度升高，如肌鈣蛋白(TNT/TNI)升高，心肌同工酶(CK-MB)升高大于正常值高限的2倍。心絞痛病例的入選診斷標準為經冠脈造影發現冠狀動脈至少一個主要分支狹窄超過70%。經各項檢查除外心臟瓣膜疾病、先天性心臟病、心力衰竭、嚴重的腎臟及肝臟疾病、繼發性高血壓、心肌病、家族性高膽固醇血癥及可疑冠心病患者。符合上述診斷的病例可以入選本研究。對照組入選標準既往無冠心病或其他動脈粥樣硬化病史，無胸痛、胸悶等心臟病癥狀，心電圖無明顯缺血性改變。病例組和對照組均為中國漢族人，且無血緣關系。研究人群的基本特征研究人群包括篩查階段的芯片檢測樣本(包括1515例冠心病患者和5019例對照)，基本特征如下表
權利要求
1.一種染色體6p21. 32區域基因單體型，該單體型在rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 rs2076529 位點的單核苷酸分別為 G、A、A、C、C、T ;A、G、G、T、T、C ;或 A、A、A、C、C、T。
2.根據權利要求I所述的單體型，其中，所述染色體6p21.32區域基因是指位于染色體6p21. 32上32368kb 32520kb區域間的基因。
3.一種檢測染色體6p21. 32區域基因的單核苷酸多態性位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 / 或 rs2076529 的試劑在制備檢測染色體 6p21. 32 區域基因單體型的制劑或試劑盒中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其中所述檢測染色體6p21.32區域基因的單核苷酸多態性位點的試劑為用于直接測序法的試劑；或用于聚合酶鏈式反應與限制性片斷長度多態性分析相結合的試劑；或用于聚合酶鏈式反應與直接測序法相結合的試劑；或用于以下 任一種SNP分型方法的試劑基于雜交的方法、基于引物延伸的方法、基于構象的方法或高分辨率溶解曲線分析技術。
5.檢測染色體6p21.32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533和/或rs2076529的試劑在制備用于體外檢測冠心病相關基因的制劑或試劑盒中的應用。
6.檢測染色體6p21.32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533和/或rs2076529的試劑在制備用于體外檢測待測樣品中是否含有染色體6p21. 32區域基因危險性單體型的制劑或試劑盒中的應用，其中， 染色體6p21. 32區域基因危險性單體型在rs9268402位點的單核苷酸為G ； 更進一步地，染色體6p21. 32區域基因危險性單體型在rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 rs2076529 位點的單核苷酸分別為 G、A、A、C、C、T。
7.體外檢測來自待測個體的樣品中染色體6p21.32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 / 或 rs2076529 的試劑在制備預測待測個體患冠心病的危險性的制劑或試劑盒中的應用，其中，攜帶rs9268402位點的單核苷酸為G的個體或者攜帶由位點rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533和rs2076529的單核苷酸組成的單體型G-A-A-C-C-T的個體患冠心病的危險性比攜帶由位點 rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 rs2076529 的單核苷酸組成的單體型A-G-G-T-T-C或A-A-A-C-C-T的個體患冠心病的危險性顯著升高。
8.根據權利要求6或7所述的應用，其中所述的待測樣品來自血液、尿、唾液、胃液、頭發，活組織檢查或尸體解剖材料。
9.根據權利要求6或7所述的應用，其中所述的待測樣品來自中國漢族人。
10.一種檢測染色體6p21. 32區域基因的標簽單核苷酸多態性位點的多態性的試劑盒，該試劑盒分別含有1)擴增rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 / 或 rs2076529 位點的引物； 2)PCR擴增酶及相應緩沖液；3)測定rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533 和 / 或 rs2076529 位點多態的試劑。
全文摘要
本發明涉及與冠心病相關的6號染色體易感區域標簽單核苷酸多態性位點及其組成的單體型與應用。所述標簽單核苷酸多態性位點為染色體6p21.32上在C6orf10-BTNL2基因間的一段緊密連鎖區域內rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533和rs2076529位點。所述單體型在rs9268402、rs442406、rs9268473、rs3817973、rs2076533和rs2076529位點的單核苷酸分別為G、A、A、C、C、T；A、G、G、T、T、C；或A、A、A、C、C、T。本發明的標簽單核苷酸多態性位點及單體型在冠心病的預防和/或診斷中有重要的應用前景。
文檔編號C12N15/11GK102747075SQ20121018789
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月7日 優先權日2012年6月7日
發明者李宏帆, 王來元, 陳恕鳳, 顧東風, 魯向鋒, 黃建鳳 申請人:中國醫學科學院阜外心血管病醫院, 北京諾賽基因組研究中心有限公司