專利名稱：一種6×His-C99重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種6XHis_C99重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease, AD)患者腦內(nèi)產(chǎn)生β淀粉樣斑塊沉積是此病的典型病變。Αβ寡聚體是重要的AD早期生物標志物之一。不同年齡、不同疾病發(fā)展階段AD患者外周血A β寡聚體自身抗體水平與疾病發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。因此，針對A β寡聚體抗體的檢測在AD的早期診斷和疾病預(yù)后監(jiān)測中很有意義。目前已有人開展外周血Αβ自身抗體的檢測分析，但是多家報道結(jié)果不一致。究 其原因，最重要的一點是檢測抗原標準不一致。目前多采用Αβ作為檢測抗原，其缺點是Αβ容易聚集，形成單體、寡聚體和纖維混合物。這些成分呈現(xiàn)的抗原表位不一致，因而導(dǎo)致所測抗體水平結(jié)果不一致。再者，目前尚無AD患者和正常人外周血Αβ 42寡聚體自身抗體水平的檢測數(shù)據(jù)。因此，規(guī)范檢測抗原的組成和參數(shù)，發(fā)展新型A β 42寡聚體特異性抗體的檢測方法勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少解決上述技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種穩(wěn)定性好、特異性強的6XHis_C99重組蛋白。根據(jù)本發(fā)明實施例的6XHis_C99重組蛋白，編碼該重組蛋白的核苷酸序列如SEQID NO: I 所示。將本發(fā)明的6XHis_C99重組蛋白和6XHis_AM2進行穩(wěn)定性比較，在同樣的保存條件下(_80°C，避免反復(fù)凍融)，6XHis-C99重組蛋白比6XHis_A042更穩(wěn)定。6XHis-Aβ 42幾乎聚集成80kD以上的聚集體，而6XHis_C99重組蛋白則保持單體和寡聚體成分。根據(jù)本發(fā)明實施例的6XHis_C99重組蛋白，在體外的穩(wěn)定性強于Aβ 42，用于抗體檢測的穩(wěn)定性好，在堿性包被液的條件下，6 X H i s - C 9 9重組蛋白呈現(xiàn)的抗原表位穩(wěn)定，克服了 Αβ 42容易聚集，抗原表位具有多變性，導(dǎo)致檢測結(jié)果不穩(wěn)定的難題；另外，6XHis-C99作為檢測抗原，其用量低于Αβ 42多肽做檢測抗原的情形，6XHis_C99的成本低，應(yīng)用更經(jīng)濟，具有大規(guī)模應(yīng)用的可能。本發(fā)明的另一個目的在于提出一種6XHis_C99重組蛋白的制備方法。根據(jù)本發(fā)明實施例的6XHis_C99重組蛋白的制備方法，包括以下步驟a)以淀粉樣前體蛋白(APP)基因為模板克隆出APP羧基末端水解片段C99 ；b)將所述APP羧基末端水解片段C99進行電泳分離，回收純化后克隆至載體并轉(zhuǎn)化得到第一重組質(zhì)粒；
c)選擇測序正確的第一重組質(zhì)粒，雙酶切測序正確的第一重組質(zhì)粒和原核表達載體pET30a并將其連接，得到重組質(zhì)粒pET30a-6XHis-C99 ；d)將所述重組質(zhì)粒pET30a-6XHis_C99進行表達，得到6XHis_C99重組蛋白。另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例的一種6XHis_C99重組蛋白的制備方法，還可以具有如下附加的技術(shù)特征根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述步驟a)中上游引物為5’ -AGCGGATCCATGGATGCAGAATTCCGA，下游引物為 3’ -CGCAAGCTTCTACTAGTTCTGCATCTGCTC。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述步驟a)具體包括a-Ι)將所述模板和上、下游引物于94°C預(yù)變性5min ；
a-2)將步驟a-1)所得產(chǎn)物于94°C變性30s ；a-3)將步驟a-2)所得產(chǎn)物于55°C退火30s ；a-4)將步驟a-3)所得產(chǎn)物于72°C擴增30個循環(huán)，擴增時間為30s ；a-5)將步驟a-4)所得產(chǎn)物于72°C延伸lOmin，得到APP羧基末端水解片段C99。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述步驟b)中采用1.5g/100mL瓊脂糖凝膠進行電泳分離，采用DNA膠回收試劑盒進行回收。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述載體為PMD18-T載體。所述轉(zhuǎn)化載體為大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 α。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述雙酶切位點分別為BamH I和Hind III。根據(jù)本發(fā)明實施例的6 X His-C99重組蛋白的制備方法，應(yīng)用PCR技術(shù)以APP基因為模板克隆構(gòu)建了 APP羧基末端水解片段C99融合蛋白基因，利用原核表達載體pET30a系統(tǒng)誘導(dǎo)表達，鎳親和層析純化得到蛋白純品(6XHis-C99)。此表達產(chǎn)物可以同時被鼠抗His單抗和A8單抗所識別。表達產(chǎn)物顯示為包括IlkD單體和80 IOOkD聚集體的蛋白組分?；谏鲜鲆呀?jīng)克隆構(gòu)建并表達純化的6XHis_C99重組蛋白，將其作為替代包被抗原，可以用于單抗篩選和A β寡聚體特異性抗體的檢測，制備用于抗阿爾茨海默病A β 42寡聚體單抗篩選的試劑盒及A β 42寡聚體抗體譜的檢測試劑盒，或者將其應(yīng)用于制備阿爾茨海默病生物標記物的診斷試劑，以用于阿爾茨海默病的診斷和鑒別診斷目的。本發(fā)明還鑒定了 6XHis_C99重組蛋白作為間接ELISA檢測抗原包被酶標板的條件和最適濃度。以堿性溶液包被液溶解6 XHiS-C99重組蛋白，系列稀釋，以A8單抗1:2000作為抗原，得到最適包被濃度為10ng/ml (即Ing每孔)。以所得包被條件和最適濃度為標準，通過間接ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，這種包被抗原可以被寡聚體特異性單抗AS和NU識別，而不能被Αβ纖維特異的單抗NU6所識別。即6 X His-C99重組蛋白作為包被抗原用于間接ELISA系統(tǒng)，可以檢測A β寡聚體特異性抗體水平，反映A β寡聚體抗體譜的特征，有較好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I是根據(jù)本發(fā)明所涉及的6XHis_C99重組蛋白的制備方法的流程示意圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明實施例的雙酶切鑒定顯示圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明實施例的SDS-PAGE條帶分析圖；圖4是根據(jù)本發(fā)明實施例的6XHis_C99重組蛋白被小鼠抗組氨酸標簽單抗示意圖；圖5是根據(jù)本發(fā)明實施例的單抗A8被小鼠抗組氨酸標簽單抗示意圖；圖6是根據(jù)本發(fā)明實施例的NU1，NU4, NU6，4G8被小鼠抗組氨酸標簽單抗示意圖。
具體實施例方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。下面首先參考圖I描述根據(jù)本發(fā)明所涉及的6XHis_C99重組蛋白的制備方法的流程。具體地，根據(jù)本發(fā)明所述的6XHis_C99重組蛋白的制備方法包括以下步驟a)以淀粉樣前體蛋白(APP)基因為模板克隆出APP羧基末端水解片段C99 ；b)將所述APP羧基末端水解片段C99進行電泳分離，回收純化后克隆至載體并轉(zhuǎn)化得到第一重組質(zhì)粒；c)選擇測序正確的第一重組質(zhì)粒，雙酶切測序正確的第一重組質(zhì)粒和原核表達載體pET30a并將其連接，得到重組質(zhì)粒pET30a-6XHis-C99 ；d)將所述重組質(zhì)粒pET30a-6XHis_C99進行表達，得到6XHis_C99重組蛋白。由此，可以制得6 X Hi S-C99重組蛋白，所述6 X Hi S-C99重組蛋白在體外的穩(wěn)定性強于A β 42，用于抗體檢測的穩(wěn)定性好，在堿性包被液的條件下，6XHis-C99重組蛋白呈現(xiàn)的抗原表位穩(wěn)定，克服了 Αβ 42容易聚集，抗原表位具有多變性，導(dǎo)致檢測結(jié)果不穩(wěn)定的難題；另外，6XHis-C99作為檢測抗原，其用量低于Αβ42多肽做檢測抗原的情形，6XHis-C99的成本低，應(yīng)用更經(jīng)濟，具有大規(guī)模應(yīng)用的可能。關(guān)于所述步驟a)，需要理解的是，所述步驟a)中上游引物為5’ -AGCGGATCCATGGATGCAGAATTCCGA，下游引物為 3’ -CGCAAGCTTCTACTAGTTCTGCATCTGCTC,其具體操作可以包括a-Ι)將所述模板和上、下游引物于94°C預(yù)變性5min ；a-2)將步驟a-1)所得產(chǎn)物于94°C變性30s ；a-3)將步驟a-2)所得產(chǎn)物于55°C退火30s ；a-4)將步驟a-3)所得產(chǎn)物于72°C擴增30個循環(huán)，擴增時間為30s ；a-5)將步驟a-4)所得產(chǎn)物于72°C延伸lOmin，得到APP羧基末端水解片段C99。由此可以制得APP羧基末端水解片段C99。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述步驟b)中采用1.5g/100mL瓊脂糖凝膠進行電泳分離，采用DNA膠回收試劑盒進行回收。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述載體為PMD18-T載體。所述轉(zhuǎn)化載體為大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 α。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述雙酶切位點分別為BamH I和Hind III。根據(jù)本發(fā)明實施例的6 X His-C99重組蛋白的制備方法，應(yīng)用PCR技術(shù)以APP基因為模板克隆構(gòu)建了 APP羧基末端水解片段C99融合蛋白基因，利用原核表達載體pET30a系統(tǒng)誘導(dǎo)表達，鎳親和層析純化得到蛋白純品(6XHis-C99)。此表達產(chǎn)物可以同時被鼠抗His單抗和A8單抗所識別。表達產(chǎn)物顯示為包括IlkD單體和80 IOOkD聚集體的蛋白組分?；谏鲜鲆呀?jīng)克隆構(gòu)建并表達純化的6XHis_C99重組蛋白，將其作為替代包被抗原，可以用于單抗篩選和A β寡聚體特異性抗體的檢測，制備用于抗阿爾茨海默病A β 42寡聚體單抗篩選的試劑盒及A β 42寡聚體抗體譜的檢測試劑盒，或者將其應(yīng)用于制備阿爾茨海默病生物標記物的診斷試劑，以用于阿爾茨海默病的診斷和鑒別診斷目的。本發(fā)明還鑒定了 6XHis_C99重組蛋白作為間接ELISA檢測抗原包被酶標板的條件和最適濃度。以堿性溶液包被液溶解6 XHiS-C99重組蛋白，系列稀釋，以A8單抗1:2000 作為抗原，得到最適包被濃度為10ng/ml (即Ing每孔)。以所得包被條件和最適濃度為標準，通過間接ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，這種包被抗原可以被寡聚體特異性單抗AS和NU識別，而不能被Αβ纖維特異的單抗NU6所識別。即6XHis-C99重組蛋白作為包被抗原用于間接ELISA系統(tǒng)，可以檢測Αβ寡聚體特異性抗體水平，反映A β寡聚體抗體譜的特征，有較好的應(yīng)用前景。下面結(jié)合實施例具體描述根據(jù)本發(fā)明的6XHis_C99重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用。實施例16XHis_C99重組蛋白的基因克隆以及表達載體的構(gòu)建I、引物設(shè)計根據(jù)GenBank中APP695的基因序列(GeneID :351)及β分泌酶水解位置得知C99蛋白的基因序列(300bp )設(shè)計引物，上、下游引物分別為5， -AGCGGATCCATGGATGCAGAATTCCGA,3’ -CGCAAGCTTCTACTAGTTCTGCATCTGCTC (酶切位點分別為 BamH I 和 Hind III)。引物由上海生工生物工程有限公司合成并純化和測序。2、目的基因的克隆利用上述引物進行PCR。以APP序列作為模板，將所述模板和上、下游引物于94°C預(yù)變性5min，接著94°C變性30s，然后于55°C退火30s，于72°C擴增30個循環(huán)，擴增時間為30s，最后于72°C延伸lOmin，得到APP羧基末端水解片段C99。PCR結(jié)束后，將APP羧基末端水解片段C99用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA膠回收試劑盒回收純化后克隆至PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 α，雙酶切電泳檢測，鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定。3、表達載體構(gòu)建將雙酶切測序正確的重組質(zhì)粒和表達載體pET30a，經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA膠回收試劑盒回收純化后雙酶切的目的片段，與同樣用BamH I和Hind III雙酶切的pET30a載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α、挑單克隆擴大培養(yǎng)，提質(zhì)粒酶切鑒定，鑒定正確后的重組質(zhì)粒pET30a-6XHis-C99陽性克隆保存質(zhì)粒和菌種。4、結(jié)果與結(jié)論
以APP695為模板，設(shè)計引物經(jīng)PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳顯示得到一條300bp左右的條帶，此條帶與PMD18-T載體連接轉(zhuǎn)化后得到多個陽性克隆，測序結(jié)果分析完全正確。重組基因亞克隆至pET30a載體，雙酶切鑒定顯示一條300bp左右的條帶(如圖2所示)。以上結(jié)果說明成功克隆并構(gòu)建了 pET30a-6XHis_C99表達載體。實施例2 6XHis-C99表達載體的表達及純化I、蛋白表達將pET30a-6XHis_C99表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coliBL21，挑取生長良好的單菌落到7mL具有kana抗性的LB培養(yǎng)液中，于260rpm，37°C過夜培養(yǎng)。從過夜培養(yǎng)的菌液中取2mL到具有kana抗性的500mL LB培養(yǎng)液中，于260rpm，37°C繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)4h后菌液0D600值達到O. 6,此時加入終濃度為lmmol/L的誘導(dǎo)劑一異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(Isopropyl- β -D-thiogalactopyranoside, IPTG)進行誘導(dǎo)，6h 后于 12000rpm, 4°C離心 15min 收集菌體并稱重。按1:5 (g:mL)比例加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS) (PH 8. 0)洗滌菌體兩次，于12000rpm，4°C離心15min收集菌體。加入超聲裂解液重懸細菌，充分混和(功率300w，超聲10s，間歇15s，超聲90min)。于室溫15000rpm，離心30min，分別收集上清和沉淀，行SDS-PAGE凝膠電泳，分析目的蛋白的表達形式及表達量。2、蛋白純化用Ni-NTA agarose純化上清。平衡Ni柱子每個15mL離心管中取O. 6mL Ni 一NTAAgarose,分別加入2mL裂解緩沖液,混勻，室溫5440g離心Imin棄上清,重復(fù)3次；將菌液上清30mL于Ni — NTA Agarose混合后，室溫200rpm搖動IOmin ；5440g離心Imin,上清轉(zhuǎn)入一新的離心管中，標記為FL ;每個離心管中的Ni-NTA Agarose用5mL的洗滌緩沖液(washing buffer)洗漆兩次,5440g,離心Imin,上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，標記為Wl和W2 ；每管用2mL的洗脫緩沖液(elution buffer)洗脫三次,5440g,離心Imin,上清轉(zhuǎn)入新的離心管中標記為El，，E2和E3 ;將上述得到的上清取少量行SDS-PAGE電泳，其余_80°C保存。3、結(jié)果與結(jié)論質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌E. coliBL21，經(jīng)lmmol/L IPTG誘導(dǎo)6h，超聲裂解后對上清和沉淀分別進行SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)此蛋白分泌到上清中，SDS-PAGE于相對分子質(zhì)量約15KD處可見目的條帶，并能形成一定的寡聚體，與預(yù)期大小一致(如圖3所示)。用Ni-NTA agarose親和層析純化上清,通過平衡、結(jié)合、洗漆、洗脫等步驟獲得純化后的上清，經(jīng)SDS-PAGE檢測，表明目的蛋白得到純化，其中表達的蛋白純度占總蛋白的90%以上。經(jīng)過BCA法測得濃度為O. 5278mg/mL。上述結(jié)果說明成功表達并純化了 6XHis_C99重組蛋白，其濃度和純度均滿足后續(xù)實驗。實施例36XHis_C99重組蛋白免疫反應(yīng)性的鑒定I、考馬斯亮藍染色檢測將凝膠放入考馬斯亮藍染色液中，在脫色搖床上染色4h左右。染色完畢后，回收染色液，將凝膠放入脫色液中在脫色搖床上脫色至蛋白條帶清晰為止，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。2> Western blot 檢測以6XHis-C99重組蛋白為抗原，分別以小鼠抗組氨酸標簽單抗(Mouse Anti-HisTag Monoclonal Antibody)和針對淀粉樣蛋白的不同抗體(NU1, NU4, NU6,見文獻LambertMP，et al. J Neurochem，2007，100，23-35 ;4G8，SIGNET)以及本實驗室制備的小鼠抗淀粉樣蛋白單抗 A8 (見文獻 Zhang Y，et al. J Alzheimer Dis，2011，23 (3) : 551-561)為一抗，辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG為二抗，進行Western blot檢測。Western blot檢測的方法為常規(guī)實驗方法，具體如下取5 10 μ g樣品，5X樣品緩沖液，混勻后上樣，先以100V電壓使蛋白通過濃縮膠。當(dāng)樣品進入分離膠時，調(diào)節(jié)電壓使其恒定在120V。當(dāng)溴酚藍泳動至凝膠底部時，結(jié)束電泳，取下凝膠，常規(guī)用考馬斯亮藍R-250染色法染色；將凝膠和硝酸纖維素膜分別放入裝有印跡緩沖液的容器里平衡lOmin，依次在放入濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，成“三明治”狀，倒入轉(zhuǎn)膜緩沖液，膠面朝負極，NC膜面朝向正極，小心避免并趕去氣泡。接通電源，使恒流80mA連續(xù)轉(zhuǎn)移2h，切斷電源。 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,用麗春紅S染色液(10X麗春紅SC存液配制方法為稱取麗春紅S2g,三氯乙酸30g,橫基水楊酸30g,加水至IOOml ;用時按照I :10的比例用用去離子水稀釋)確定蛋白條帶位置，做相應(yīng)的標記。用封閉液封閉硝酸纖維素膜(稱取脫脂奶粉5g，溶于 0. lmol/L PBST (NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4. I. 44g, KH2PO4. 0. 44g, Tween-200. 05ml，補去離子水至1L，pH 7. 2 7. 4) 100ml)，4°C封閉過夜。用封閉液液稀釋單抗，濃度一般為
0.2 I μ g/ml,于4°C孵育12 14h，或于20 37°C孵育2h。用0. lmol/LPBST洗滌硝酸纖維素膜4次，每次5 lOmin。用PBS稀釋HRP標記的二抗，稀釋度為1:1000，室溫孵育lh。用0. lmol/L PBST洗滌硝酸纖維素膜4次，每次5min。按照PIERCE化學(xué)發(fā)光試劑盒說明，將A液和B液等體積混合，加在硝酸纖維素膜上，2 5min后，用X光片曝光顯影，觀察結(jié)果。3、結(jié)果與結(jié)論試驗結(jié)果6XHis-C99重組蛋白可以被小鼠抗組氨酸標簽單抗(Mouse Anti-HisTag Monoclonal Ant ibody),如圖4所示。圖5為單抗A8被小鼠抗淀粉樣蛋白標簽。圖6為NU1，NU4，NU6，4G8被小鼠抗組氨酸標簽單抗示意圖。上述結(jié)果說明，6XHis_C99重組蛋白具有與淀粉樣蛋白相近的免疫反應(yīng)性。實施例46XHis_C99重組蛋白作為抗原在AD ELISA檢測方法中的應(yīng)用I、確定最佳抗原包被濃度純化后的6XHis_C99重組蛋白用包被液做不同濃度的稀釋之后，作為包被抗原，用于檢測Αβ寡聚體單抗Α8,從而確定CTFP的最佳包被濃度。其具體操作方法如下抗原用堿性包被液(pH 9. 6,0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液)稀釋，蛋白濃度為CTFβ分別為0. 5ng/孔，Ing/孔，IOng/孔50ng/孔，IOOng/孔，200ng/孔，500ng/孔，800ng/孔，I μ g/孔，加入96孔聚苯乙烯酶標板中，100 μ I /孔，4°C過夜；次日磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffer solution Tween, PBST)洗漆 3 次；加封閉液 200 μ I/孔，37°C放置Ih ；PBST洗滌3次；加一抗Α β寡聚體單抗Α8，100 μ I/孔；PBST洗滌3次；加二抗辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG的二抗100 μ I/孔；PBST洗滌3次；TMB顯色lOmin，2M濃硫酸終止反應(yīng)；檢測結(jié)果，用TECON全自動酶標儀檢測450nm吸光值(OD45tl);每份樣品做2個孔測定，取平均A值。根據(jù)P/N值最大處為抗原最佳包被濃度，以樣品孔與陰性對照孔OD45tl值之比(P/N)大于2作為陽性結(jié)果的判定標準。
2、ELISA 檢測確定6XHis-C99重組蛋白的包被濃度后，CTF^ IOng/孔，Αβ l_42500ng/孔，比較6XHis-C99和Αβ分別作為抗原與各個抗體(純化后的Α8，NUl, NU4, NU6，4G8等)的結(jié)合能力，從而建立ELISA方法應(yīng)用于AD的檢測。3.結(jié)果與結(jié)論
通過對數(shù)據(jù)分析和對最大P/N值的計算得出最佳抗原包被濃度為Ing/孔，抗體的A8的最佳稀釋度是1:1000。通過數(shù)據(jù)分析和對最大P/N值的計算，結(jié)果顯示6 X Hi S-C99重組蛋白用作抗原包被可以識別Αβ的各種抗體，用于檢測樣品中各種Αβ寡聚體抗體的含量，見表I。上述結(jié)果說明，純化后的6XHis_C99重組蛋白在堿性包被液條件下，作為包被抗原，可以滿足用于檢測Αβ寡聚體的抗體。表I以6XHis_C99包被酶標板檢測阿爾茨海默病抗體含量表
權(quán)利要求
1.ー種6XHis-C99重組蛋白，其特征在于，編碼該重組蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO: I所示。
2.—種6XHis-C99重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 a)以淀粉樣前體蛋白(APP)基因為模板克隆出APP羧基末端水解片段C99； b)將所述APP羧基末端水解片段C99進行電泳分離，回收純化后克隆至載體并轉(zhuǎn)化得到第一重組質(zhì)粒； c)選擇測序正確的第一重組質(zhì)粒，雙酶切測序正確的第一重組質(zhì)粒和原核表達載體pET30a并將其連接，得到重組質(zhì)粒pET30a-6XHis-C99 ； d)將所述重組質(zhì)粒pET30a-6XHis-C99進行表達，得到6XHis_C99重組蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的6XHis-C99重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟a)中上游引物為 5’ -AGCGGATCCATGGATGCAGAAITCCGA，下游引物為 3’ -CGCAAGCTTCTACTAGTTCTGCATCTGCTC。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的6XHis-C99重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟a)具體包括 a_l)將所述模板和上、下游引物干94°C預(yù)變性5min ； a-2)將步驟a-1)所得產(chǎn)物于94°C變性30s ； a-3)將步驟a-2)所得產(chǎn)物于55°C退火30s ； a-4)將步驟a-3)所得產(chǎn)物于72°C擴增30個循環(huán)，擴增時間為30s ； a-5)將步驟a-4)所得產(chǎn)物于72°C延伸lOmin，得到APP羧基末端水解片段C99。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的6XHis-C99重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟b)中采用I. 5g/100mL瓊脂糖凝膠進行電泳分離，采用DNA膠回收試劑盒進行回收。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的6XHis-C99重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述載體為PMD18-T載體。所述轉(zhuǎn)化載體為大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 a。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的6XHis-C99重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述雙酶切位點分別為BamH I和Hind III。
8.—種6XHis-C99重組蛋白在新型淀粉樣蛋白(Abeta, )寡聚體特異性抗體的檢測中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述6XHis-C99重組蛋白作為間接ELISA檢測抗原包被酶標板,其最適包被濃度為10ng/ml。
10.ー種6XHis-C99重組蛋白在制備阿爾茨海默病生物標記物的診斷試劑中的應(yīng)用。
11.ー種6 X HiS-C99重組蛋白在制備用于抗阿爾茨海默病A P 42寡聚體單抗篩選的試劑盒及A P 42寡聚體抗體譜的檢測試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種6×His-C99重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明實施例的6×His-C99重組蛋白，在體外的穩(wěn)定性強于Aβ42，用于抗體檢測的穩(wěn)定性好，在堿性包被液的條件下，6×His-C99重組蛋白呈現(xiàn)的抗原表位穩(wěn)定，克服了Aβ42容易聚集，抗原表位具有多變性，導(dǎo)致檢測結(jié)果不穩(wěn)定的難題；另外，6×His-C99作為檢測抗原，其用量低于Aβ42多肽做檢測抗原的情形，6×His-C99的成本低，應(yīng)用更經(jīng)濟，具有大規(guī)模應(yīng)用的可能。
文檔編號C12N15/70GK102731659SQ201210187669
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者何金生, 宋琳琳, 張瑩, 洪濤 申請人:北京交通大學(xué)