專利名稱：一株產漆酶葡萄糖去阻遏擔子菌新型隱球酵母tsp2-1Δ的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域。具體涉及一株能產漆酶葡萄糖去阻遏擔子菌新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)。
背景技術：
漆酶(EC I. 10. 3. 2)是一類含銅的藍色酚氧化酶。漆酶可以氧化一系列芳香族化合物，氧作為電子受體，副產物是水，因此是一種環保型酵素。漆酶廣泛分布于昆蟲、植物、真菌和細菌中。Yoshida首先在漆樹中發現了漆酶，一直以來，漆酶受到了科學界的廣泛關注，并且在工業生產和環境治理領域得到了廣泛的應用。目前，工業上應用的漆酶主要來源于真菌，例如，白腐菌產生的漆酶可用于木質素降解， 紡織品漂白和食物處理等，漆酶還可用于環境污染物降解和土壤有機物轉化，漆酶在降解木質纖維素產乙醇中也具有潛在的應用價值。真菌漆酶的工業發酵生產存在以下問題大多數真菌的漆酶表達調控的分子機制不清楚，一些真菌漆酶的表達是組成型的，而另一些真菌漆酶的表達是誘導型的，在真菌的生長過程中漆酶的表達會受到碳源(比如葡萄糖) 的抑制，在有些情況下，漆酶會在蛋白酶的作用下失活。

發明內容
本發明的目的是克服漆酶表達的葡萄糖阻遏抑制問題，提供一株能在高濃度葡萄糖條件下漆酶高產的新菌株。本發明提供的能在高濃度葡萄糖條件下漆酶高產的新菌株是一株擔子菌屬的新型隱球酵母Cryptococcus neoformans (該菌株是野生型菌株JEC21的基因TSP2-1定向敲除突變株，基因TSP2-1的GenBank編號CNJ00820。該菌株于2011年9月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，菌種保藏號CGMCC No. 5274,分類命名為新型隱球酵母Cryptococcus neoformans) tsp2_l Δ。本發明菌株為國內外首次發現。新型隱球酵母可以產生大量的漆酶，含有2種漆酶基因LACl和LAC2，LACl是表達主要的漆酶活性，而LAC2不表達。新型隱球酵母的漆酶共價結合到細胞壁上，可以氧化酚底物(去甲腎上腺素等) 產生黑色素。影響新型隱球酵母漆酶表達的因素包括(I)銅離子可以誘導漆酶的表達；
(2)高溫(37°C )抑制漆酶的活性；(3)葡萄糖抑制漆酶的表達，當葡萄糖耗盡后才起始 LACl的表達。本發明經過多年大量的深入研究，培養了一株擔子菌，該菌的漆酶表達不受葡萄糖抑制，可在高濃度葡萄糖條件下產生大量漆酶，解決了漆酶生產的葡萄糖阻遏抑制問題。本發明通過根癌農桿菌介導的高效轉化方法，以新型隱球酵母血清型D菌株 JEC21 (MATa)作為野生型菌株，構建了新型隱球酵母的隨機突變文庫，從中篩選到了漆酶葡萄糖去抑制突變株LZM36。通過反向PCR得到了突變基因TSP2-1 (GenBank編號 CNJ00820)。通過定向敲除基因TSP2-1獲得了漆酶葡萄糖去抑制菌株tsp2-lA。通過RT-PCR和漆酶活性測定對菌株tsp2-l Δ的漆酶表達和活性做了詳細的分析和檢測。本發明利用分子生物學方法對漆酶葡萄糖去阻遏菌株tsp2_l Δ進行了基因突變鑒定、漆酶表達和漆酶活性分析。該菌株可用來在高濃度葡萄糖條件下生產酚氧化酶一漆酶。即在高濃度葡萄糖培養基中培養所述微生物菌株以使所述微生物細胞組成型表達漆酶。所述高葡萄糖培養基為2%葡萄糖Asn培養基g/L :天門冬酰胺lg，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀3g，pH 5. 1，固體培養基則補加20g瓊脂粉。培養是在需氧條件下，在500mL三角瓶中發酵培養，接種方式采用菌液的接種方式，溫度為28-30°C。本發明的優點和積極效果本發明提供了一株產漆酶葡萄糖去阻遏擔子菌Cryptococcus neoformans tsp2-l Δ。在高濃度葡萄糖(2% )條件下，野生型菌株JEC21的漆酶表達受到抑制，而菌株 tsp2-lA的漆酶組成型高表達。漆酶活性測定發現菌株tsp2-lA是野生型菌株JEC21的 9. 25倍。本發明解決了漆酶生產的葡萄糖阻遏問題。


圖I是本發明提供的菌株tsp2_l Δ的黑色素合成；圖2是本發明提供的菌株tsp2_l Δ的DNA印跡雜交(Southern Blot)；圖3是本發明提供的菌株tsp2_l Δ中LACl的轉錄表達量。下面結合具體實施例，說明本發明中漆酶葡萄糖去阻遏菌株tsp2_l Λ的構建、基因突變鑒定、漆酶表達和漆酶活性分析等內容。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
具體實施例方式下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人所著的“分子克隆實驗室手冊”(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I、本發明提供了通過基因突變得到漆酶葡萄糖去阻遏菌株tsp2_l Δ的方法I、菌株和培養基(I)菌株新型隱球酵母血清型D菌株JEC21 (ΜΑΤ α )作為野生型菌株。B4500F0A是JEC21 的尿嘧啶營養缺陷性突變株，作為構建隨機突變庫的受體菌株。含有質粒PBI121-URA5的根癌農桿菌LBA4404用于B4500F0A的轉化。(2)培養基YH)培養基(10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖；pH 6. O)用于培養新型隱球酵母。LB液體培養基(100 μ g/ml卡那霉素)用于培養根癌農桿菌LBA4404。誘導培養基(磷酸氫二鉀O. 136g/L，磷酸二氫鉀O. 228g/L，氯化鈉O. 146g/L，硫酸鎂O. 493g/L，氯化鈣O. 103g/L，硫酸亞鐵2. 5mg/L，硫酸銨O. 529g/L，2-N-瑪琳代乙烷磺酸 7. 8g/L,葡萄糖O. 198g/L,甘油5ml/L,乙酰丁香酮O. 039g/L ；pH 5. 3)用于根癌農桿菌介導的轉化。高葡萄糖培養基含有100mg/L去甲腎上腺素的高葡萄糖培養基(20g/L葡萄糖， 1.0g/L天門冬酰胺，3g/L KH2PO4 ；pH 5. I)用于檢測黑色素的合成。2、隨機突變文庫的構建和葡萄糖去阻遏突變株的分離(I)含有pBI121-URA5的根癌農桿菌LBA4404在LB液體培養基(100 μ g/ml卡那霉素)中，28°C培養過夜。離心收集菌體，重新懸浮于液體誘導培養基中，繼續培養6小時。 用新鮮的誘導培養基調節菌液OD66tl到I. O (大約IO9個細胞/ml)。(2)新型隱球酵母B4500F0A (JEC21的尿嘧啶營養缺陷型)在YPD培養基中，30°C 培養過夜。用新鮮的Yro培養基I : ο稀釋菌液，繼續培養6小時。離心收集菌體，重新懸浮于誘導培養基中，利用血球計數板調節細胞濃度到IO8個細胞/ml。等體積的⑴步中的細菌和(2)步中的酵母培養液混合，取100 μ I混合液涂布到含有尿嘧啶的固體誘導培養基上(在誘導培養基中補加50mg/L尿嘧啶，20g/L瓊脂粉)， 25°C共培養72小時。用無菌水把菌體洗下，涂布到100mg/L去甲腎上腺素和100mg/L氨芐青霉素(殺死農桿菌LBA4404)的高葡萄糖培養基上，30°C培養3-5天，檢測黑色素的合成 (參見圖I)。我們分離到了漆酶葡萄糖去抑制突變株LZM36。3、通過反向PCR獲得葡萄糖去抑制突變株LZM36的突變基因TSP2-1取菌株tsp2_lA突變株LZM36基因組DNA(2yg)經過Xba I酶切后，用T4DNA 連接酶在200 μ I反應體系中自連過夜(4°C)。取10 μ I連接產物作為模板，用引物( PI-S5'-ACTGGAACAACACTCAACCCTA-3' 和 pl_A 5'-TGGGGTTTCTACAGGACG-3'，或 p2_S 5' -TGGCGGGTAAACCTAAGAG-3' 和 p2_A 5' -CGCACAATCCCACTATCC-3')進行反向 PCR擴增。PCR 產物經測序后與GenBank數據庫中的隱球酵母測序計劃中的序列進行比對，確定了突變基因 TSP2-1(CNJ00820)。4、通過同源重組定向敲除獲得葡萄糖去抑制突變株tsp2_l Δ我們用URA5基因作為Marker，構建敲除載體pBS_TSP21-URA5，通過電轉化方法把敲除載體導入受體菌B4500F0A。利用PCR篩選方法得到葡萄糖去抑制突變株tsp2-lA (見圖I)，進一步通過Southern Blot驗證(見圖2)。圖I是本發明提供的菌株tsp2_lA的黑色素合成。在2%葡萄糖Asn固體培養基上，30°C，培養16小時后，野生型JEC21菌株沒有黑色素合成，而tsp2-l Δ菌株合成了大量
的黑色素。圖2是本發明提供的菌株tsp2_l Δ的Southern Blot。野生型基因TSP2-1的 3. 3kb PCR產物作為探針，JEC21含有兩條帶，4. 9kb和4. 7kb ;tsp2-lA也含有兩條帶，
5.7kb 和 4. 2kb。實施例2、本發明提供的漆酶葡萄糖去抑制菌株tsp2_l Δ的漆酶表達和活性分析。I、RT-PCR檢測漆酶編碼基因LACl的表達量野生型菌株JEC21和漆酶葡萄糖去抑制突變株tsp2_l Δ以相同初始接種量(IO6 個細胞/ml)接種到液體高葡萄糖培養基中，在30°C，200rpm條件下培養。分別在0、2、4、6和8小時取樣IO8個細胞，提取RNA，通過RT-PCR檢測LACl的表達量。結果如圖3所示，菌株JEC21中在0-8小時范圍內檢測不到LAClmRNA，而突變株tsp2-l Δ中任何時間點都檢測到了大量的LAClmRNA(見圖3，本發明提供的菌株tsp2_l Λ中LACl的轉錄表達量)，說明漆酶葡萄糖去抑制突變株tsp2-l Δ中解除了 LACl表達的葡萄糖阻遏。2、漆酶活性測定野生型菌株JEC21和漆酶葡萄糖去阻遏突變株tsp2_l Δ以相同初始接種量(IO6 個細胞/ml)接種到2%葡萄糖Asn液體培養基中，在30°C，200rpm條件下培養。在6小時取樣IO7個細胞，檢測細胞的漆酶活性。用去甲腎上腺素作為底物，IO7個tsp2-lA細胞的漆酶活力是291 ±8U，而等量的野生型JEC21和互補菌株細胞的漆酶活力分別是109±3U 和141 ±41U (測定上清液A475值，定義A475值為O. 001為一個酶活單位)；用2,2'-azinobi s- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)作為底物，IO7 個 tsp2_l Δ 細胞的漆酶活力是O. 518±0. 004ymol/min，而等量的野生型JEC21的漆酶活力是O. 056±0. 004ymol/ min。結果進一步證實了漆酶葡萄糖去阻遏突變株tsp2-l Λ中解除了漆酶表達的葡萄糖阻遏。
權利要求
1.一株產漆酶葡萄糖去阻遏擔子菌新型隱球酵母tsp2_l △，其分類命名為新型隱球酵母 Cryptococcus neoformans tsp2_l Δ ,菌種保藏號CGMCC No. 5274。
2.根據權利要求I所述的微生物菌株，其特征在于該菌株是野生型菌株JEC21的基因 TSP2-1定向敲除突變株，基因TSP2-1的GenBank編號CNJ00820。
3.根據權利要求I所述的微生物菌株，其特征是該菌株可用來在高濃度葡萄糖條件下生產酚氧化酶-漆酶。
4.一種使用權利要求I所述的微生物菌株生產漆酶的方法，其特征在于在高濃度葡萄糖培養基中培養權利要求I所述微生物菌株，以使所述微生物細胞組成型表達漆酶；所述的葡萄糖培養基為2%葡萄糖Asn培養基g/L:天門冬酰胺lg，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀 3g，pH 5. 1，固體補加20g瓊脂粉。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述的培養是在需氧條件下進行，溫度為 28-30。。。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述微生物菌株在500mL三角瓶中發酵培養，接種方式采用菌液的接種方式。
全文摘要
一株產漆酶葡萄糖去阻遏擔子菌新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)tsp2-1△，菌種保藏號CGMCCNo.5274。屬于生物工程技術領域。本發明提供了一株產漆酶葡萄糖去阻遏擔子菌－新型隱球酵母tsp2-1△。在高濃度葡萄糖(2%)條件下，野生型菌株JEC21的漆酶表達受到抑制，而菌株tsp2-1△的漆酶組成型高表達。漆酶活性測定發現菌株tsp2-1△是野生型菌株JEC21的9.25倍。本發明解決了新型隱球酵母中漆酶生產的葡萄糖阻遏問題。
文檔編號C12N9/02GK102586126SQ20121005413
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月5日 優先權日2012年3月5日
發明者孫智雄, 朱旭東, 李中明, 潘皎 申請人:南開大學