專利名稱：一種隱球酵母屬菌膠囊劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種隱球酵母屬菌膠囊劑及其制備方法。
背景技術：
生防制劑商業化生產中的一個主要問題是需要尋找到一種合適的方法可以讓 產品在貨架期中保持足夠的生防效力。冷凍干燥是一種成功、有效的劑型加工方式， 形成的干粉制劑有利于保存、銷售。但商業化生產中，冷凍干燥需要大型的設備， 而且能量消耗很大，成本較高。為了降低生產成本，提高生防效力，需要尋找其它 的劑型加工方式。
褐藻酸是褐藻類細胞壁成分中的多糖，是由D-甘露糖醛酸與L-古洛糖醛酸組 成的一種聚糖醛酸，在銅藻、裙帶菜、海帶和昆布等海洋生物中含量豐富。在工業 上經常使用的是它的鈉鹽形式——褐藻酸鈉。褐藻酸鈉又名海藻酸鈉、海帶膠、褐 藻膠、藻酸鹽，廣泛應用于食品、醫藥、紡織、印染、造紙、日用化工等行業，作 為增稠劑、乳化劑、穩定劑、黏合劑、上槳劑等使用。褐藻酸鈉是一種多極性、多 羥基的高分子化合物，與水具有非常強的親合力，在溶液中與鈣離子接觸會誘導古 洛糖醛殘基的交聯，形成凝膠。褐藻酸鈉形成的凝膠具有極高的膠體穩定性。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種制備隱球酵母屬菌膠囊劑的方法。
本發明所提供的制備隱球酵母屬菌膠囊劑的方法，可以包括如下步驟將褐藻 酸鹽溶液、隱球酵母屬菌、多價金屬陽離子混合，得到隱球酵母屬菌膠囊劑。
所述將褐藻酸鹽溶液、隱球酵母屬菌、多價金屬陽離子混合的方法可包括如下 步驟將所述褐藻酸鹽溶液與所述隱球酵母屬菌混合，得到所述褐藻酸鹽和所述隱 球酵母屬菌的混合液；再將所述混合液與所述多價金屬陽離子的溶液混合。
所述將所述混合液與所述多價金屬陽離子的溶液混合的方法包括將所述混合 液逐滴加入到所述多價金屬陽離子的溶液的步驟。
所述將所述混合液與所述多價金屬陽離子的溶液混合的方法中，在所述將所述 混合液逐滴加入到所述多價金屬陽離子的溶液后，還可包括攪拌的步驟，也可以靜 置而不攪拌。所述攪拌的時間可為20-60分鐘，優選為20-30分鐘。
所述褐藻酸鹽黏度可為200X 10_3pa s -20000 X 10—3pa s，優選為250X l(Tpa s -14000X10—3pa s。黏度指褐藻酸鹽2%的水溶液的黏度值。
所述褐藻酸鹽和所述隱球酵母屬菌的混合液中所述褐藻酸鹽的濃度可為 0. 5%-2. 5% (質量百分含量)，所述隱球酵母屬菌的濃度可為lX 108-5X 108cfu/mL， 優選為2X108cfu/mL。
所述多價金屬陽離子的溶液中所述多價金屬陽離子的濃度可為 0. 045-0. 36mol/L，優選為0. 09mol/L;所述多價金屬陽離子可為鈣、鋇、鋁等，優
選為鈣離子。
所述逐滴加入的速度可為3-7ml/min，優選為5ml/min。 所述褐藻酸鹽具體可為褐藻酸鈉。
所述隱球酵母屬菌可為酵母拮抗菌(Crypfococcwshwre/^W)，具體可為酵 母拮抗菌(Crj73z^cocciAs ^wr朋z^7) CGMCC No. 1029。
由上述任一所述方法得到的隱球酵母屬菌膠囊劑也屬于本發明的保護范圍。 本發明制備方法與現有的冷凍干燥技術相比，不需要大型的設備，不需要嚴格 復雜的工藝條件，只要簡單的儀器，在常規條件下就可完成，大大節省了成本，節 約了資源，簡化了操作。實驗證明，本發明方法制備得到的隱球酵母屬菌膠囊劑中 活菌率高，均在70%以上，高的可達90%，而且菌的活性保持不變。本發明隱球酵 母屬菌膠囊劑在低溫和常溫下都可存放， 一個月內常溫和低溫的存放效果沒有顯著 差異，便于生產上的運輸和銷售。因此，本發明方法在制備生物制劑及菌或其它生 物的保藏中都具有廣闊的應用前景。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。 實施例1、酵母拮抗菌(Cryp"cocc^ 7awe/2h7)的膠囊劑的制備 一、酵母拮抗菌Crj7^ococc^ "^^7ti7菌種的保存、活化及其發酵培養 1、菌種的活化
取-20。C保存的酵母拮抗菌(Cr/pz^cocciAs CGMCC No. 1029
(CN1733898)，將其接種于NYDA培養基中，鋪板，在28。C下培養72小時；72小 時后取少量生長良好的酵母拮抗菌接種在NYDB液體培養基中進一步活化培養；鋪
4板，在NYDA培養基上劃線獲得單菌落。
NYDA培養基葡萄糖IO，大豆蛋白胨5，牛肉膏l，酵母提取物7.5，瓊脂18，
單位gL-、
NYDB液體培養基葡萄糖IO，大豆蛋白胨5，牛肉膏l，酵母提取物7.5，單
位gL—'。
大豆蛋白胨購自北京雙旋微生物培養基制品廠，產品目錄號為02-19;牛肉膏
購自北京雙旋微生物培養基制品廠，產品目錄號為02-05A;酵母提取物購自北京雙 旋微生物培養基制品廠，產品目錄號為02-12A。 2、菌種的培養
挑取單菌落接入上述NYDB液體培養基中(250mL三角瓶中含100mL培養基)， 振蕩培養(28°C， 200rpm) 24小時，然后按2%接種濃度接種到1000raL三角瓶(含 250mL培養基)中，在相同條件下進行擴大培養，培養48小時。
二、在不同條件下制備酵母拮抗菌膠囊劑
(一) 用黏度為250Xl(Tpa s、濃度為1%的褐藻酸鈉溶液進行制備 將NYDB中培養48小時的酵母拮抗菌離心收集，用無菌水漂洗3次，用無菌水
懸浮菌；然后用滅過菌(濕熱滅菌，121°C， 15分鐘)的黏度為250Xl(Tpa' s的 褐藻酸鈉配制的溶液與酵母拮抗菌懸液混合，得到褐藻酸鈉與酵母拮抗菌混合液， 混合液中褐藻酸鈉的濃度為1% (質量百分含量)，混合液中酵母拮抗菌的濃度為 1X 108cfu/mL。用5mL的加樣器每次吸取5mL的混合液，以3mL/min的速度將混合 液滴于0.25mol/L的CaCl2溶液中，用磁力攪拌器緩慢攪拌40分鐘，得到含有酵母 拮抗菌的凝膠體球，將凝膠體球過濾出來，在無菌條件下風干，獲得的干膠球即為 酵母拮抗菌膠囊劑。
(二) 用黏度為250X 10—3pa s、濃度為2. 5%的褐藻酸鈉溶液進行制備
將NYDB中培養48小時的酵母拮抗菌離心收集，用無菌水漂洗3次，用無菌水 懸浮菌；然后用滅過菌(濕熱滅菌，12rC， 15分鐘)的黏度為250X10—3pa's的 褐藻酸鈉配制的溶液與酵母拮抗菌懸液混合，得到褐藻酸鈉酵母拮抗菌混合液，混 合液中褐藻酸鈉的濃度為2. 5%，混合液中酵母拮抗菌的濃度約為3X108Cfu/mL。用 5mL的加樣器每次吸取5mL的混合液，以4mL/rain的速度將混合液滴于0. 045mol/L 的CaCl2溶液中，用磁力攪拌器緩慢攪拌30分鐘，得到含有酵母拮抗菌的膠體球，
5將膠體球過濾出來，在無菌條件下風干，獲得的干膠球即為酵母拮抗菌膠囊劑。
(三) 用黏度為3500X 10—3pa s、濃度為0. 5%的褐藻酸鈉溶液進行制備
將NYDB中培養48小時的酵母拮抗菌離心收集，用無菌水漂洗3次，用無菌水 懸浮菌；然后用滅過菌(濕熱滅菌，121°C， 15分鐘)的黏度為3500X 10—3pa's 的褐藻酸鈉配制的溶液與酵母拮抗菌懸液混合，得到褐藻酸鈉酵母拮抗菌混合液， 混合液中褐藻酸鈉的濃度為0. 5%，混合液中酵母拮抗菌的濃度約為2X108cfu/mL。 用5mL的加樣器每次吸取5 raL的混合液，以5 mL/min的速度將混合液滴于 0.09mol/L的CaCl2溶液中，用磁力攪拌器緩慢攪拌30分鐘，得到含有酵母拮抗菌 的膠體球，將膠體球過濾出來，在無菌條件下風干，獲得的干膠球即為酵母拮抗菌 膠囊劑。
(四) 用黏度為3500X10、a s、濃度為1%的褐藻酸鈉溶液進行制備
將NYDB中培養48小時的酵母拮抗菌離心收集，用無菌水漂洗3次，用無菌水 懸浮菌；然后用滅過菌(濕熱滅菌，121°C， 15分鐘)的黏度為3500X 10—3pa's 的褐藻酸鈉配制的溶液與酵母拮抗菌懸液混合，得到褐藻酸鈉酵母拮抗菌混合液， 混合液中褐藻酸鈉的濃度為1%，混合液中酵母拮抗菌的濃度約為5X108cfu/raL。用 5mL的加樣器每次吸取5mL的混合液，以7mL/rain的速度將混合液滴于0. 36mol/L 的CaCl2溶液中，用磁力攪拌器緩慢攪拌60分鐘，得到含有酵母拮抗菌的膠體球， 將膠體球過濾出來，在無菌條件下風干，獲得的干膠球即為酵母拮抗菌膠囊劑。
(五) 用黏度為14000X10、a s、濃度為0. 5%的褐藻酸鈉溶液進行制備 將NYDB中培養48小時的酵母拮抗菌離心收集，用無菌水漂洗3次，用無菌水
懸浮菌；然后用滅過菌(濕熱滅菌，12rC， 15分鐘)的黏度為14000X 10—3pa* s 的褐藻酸鈉配制的溶液與酵母拮抗菌懸液混合，得到褐藻酸鈉酵母拮抗菌混合液， 混合液中褐藻酸鈉的濃度為0. 5%，混合液中酵母拮抗菌的濃度約為2X 108Cfu/mL。 用5mL的加樣器每次吸取5mL的混合液，以5mL/min的速度將混合液滴于0. 09mol/L 的CaCl2溶液中，用磁力攪拌器緩慢攪拌30分鐘，得到含有酵母拮抗菌的膠體球， 將膠體球過濾出來，在無菌條件下風干，獲得的干膠球即為酵母拮抗菌膠囊劑。(六)用黏度為14000X10 a s、濃度為1%的褐藻酸鈉溶液進行制備 將NYDB中培養48小時的酵母拮抗菌離心收集，用無菌水漂洗3次，用無菌水 懸浮菌；然后用滅過菌(濕熱滅菌，121°C， 15分鐘)的黏度為14000X10—3pa* s 的褐藻酸鈉配制的溶液與酵母拮抗菌懸液混合，得到褐藻酸鈉酵母拮抗菌混合液， 混合液中褐藻酸鈉的濃度為1%，混合液中酵母拮抗菌的濃度約為4X108cfu/raL。用 5mL的加樣器每次吸取5mL的混合液，以6mL/min的速度將混合液滴于0. 15mol/L 的CaCl2溶液中，用磁力攪拌器緩慢攪拌20分鐘，得到含有酵母拮抗菌的膠體球， 將膠體球過濾出來，在無菌條件下風千，獲得的干膠球即為酵母拮抗菌膠囊劑。
上述制備方法中均使用5ml的加樣器，其目的主要是保證獲得膠囊的大小相同， 可以根據實際需要選擇不同大小的加樣器。
三、膠囊劑中酵母拮抗菌的活性檢測
(一) 步驟二中實驗(一)制備的膠囊劑中細胞活性檢測 將步驟二中實驗(一)制備的膠囊劑在風干后用過濾滅菌的50 ramol/L pH 7. 0
的磷酸緩沖液溶解，然后用血球計數器將溶解后的溶液中酵母拮抗菌的濃度稀釋到 約4Xl(fcfu/mL，吸取50PL涂布于NYDA平板上，28。C下培養12小時，用顯微鏡 觀測平板，計數?；盍φ５募毎苎杆俜敝承纬晌⒕?，而死亡的細胞或活力弱 的細胞不能形成微菌落。選擇不同的視野分別計數有活力和失去活力的細胞數量， 計算酵母拮抗菌存活率。每個平板觀察的細胞數為300個，共有3個平板用于觀察計數。
存活率=活性細胞數量/計數細胞總數X 100% 實驗設3次重復，結果如表l所示。
(二) 步驟二中實驗(二)制備的膠囊劑中細胞活性檢測 將步驟二中實驗(二)制備的膠囊劑在風干后用過濾滅菌的50 mmol/L pH 7. 0
的磷酸緩沖液溶解，然后用血球計數器將溶解后的溶液中酵母拮抗菌的濃度稀釋到 約4XlCfcfu/mL，吸取50叱涂布于NYDA平板上，28。C下培養12小時，用顯微鏡 觀測平板，計數。活力正常的細胞能迅速繁殖形成微菌落，而死亡的細胞或活力弱 的細胞不能形成微菌落。選擇不同的視野分別計數有活力和失去活力的細胞數量， 計算酵母拮抗菌存活率。每個平板觀察的細胞數為300個，共有3個平板用于觀察計數。
7存活率=活性細胞數量/計數細胞總數X 100% 實驗設3次重復，結果如表l所示。
(三) 步驟二中實驗(三)制備的膠囊劑中細胞活性檢測 將步驟二中實驗(三)制備的膠囊劑在風干后用過濾滅菌的50 mmol/L pH 7.0
的磷酸緩沖液溶解，然后用血球計數器將溶解后的溶液中酵母拮抗菌的濃度稀釋到 約4XlO0cfu/niL，吸取50叱涂布于NYDA平板上，28。C下培養12小時，用顯微鏡
觀測平板，計數?；盍φ５募毎苎杆俜敝承纬晌⒕?，而死亡的細胞或活力弱 的細胞不能形成微菌落。選擇不同的視野分別計數有活力和失去活力的細胞數量， 計算酵母拮抗菌存活率。每個平板觀察的細胞數為300個，共有3個平板用于觀察計數。
存活率=活性細胞數量/計數細胞總數X 100% 實驗設3次重復，結果如表l所示。
(四) 步驟二中實驗(四)制備的膠囊劑中細胞活性檢測 將步驟二中實驗(四)制備的膠囊劑在風干后用過濾滅菌的50 mmol/L pH 7.0
的磷酸緩沖液溶解，然后用血球計數器將溶解后的溶液中酵母拮抗菌的濃度稀釋到 約4Xl(fcfu/raL，吸取50叱涂布于NYDA平板上，28。C下培養12小時，用顯微鏡
觀測平板，計數。活力正常的細胞能迅速繁殖形成微菌落，而死亡的細胞或活力弱 的細胞不能形成微菌落。選擇不同的視野分別計數有活力和失去活力的細胞數量， 計算酵母拮抗菌存活率。每個平板觀察的細胞數為300個，共有3個平板用于觀察計數。
存活率=活性細胞數量/計數細胞總數X 100% 實驗設3次重復，結果如表l所示。
(五) 步驟二中實驗(五)制備的膠囊劑中細胞活性檢測 將步驟二中實驗(五)制備的膠囊劑在風干后用過濾滅菌的50 ramol/L pH 7. 0
的磷酸緩沖液溶解，然后用血球計數器將溶解后的溶液中酵母拮抗菌的濃度稀釋到 約4X106cfu/mL，吸取50吣涂布于NYDA平板上，28。C下培養12小時，用顯微鏡 觀測平板，計數?；盍φ５募毎苎杆俜敝承纬晌⒕?，而死亡的細胞或活力弱 的細胞不能形成微菌落。選擇不同的視野分別計數有活力和失去活力的細胞數量， 計算酵母拮抗菌存活率。每個平板觀察的細胞數為300個，共有3個平板用于觀察 計數。存活率=活性細胞數量/計數細胞總數X 100% 實驗設3次重復，結果如表l所示。 (六)步驟二中實驗(六)制備的膠囊劑中細胞活性檢測
將步驟二中實驗(六)制備的膠囊劑在風干后用過濾滅菌的50 ramol/L pH 7. 0 的磷酸緩沖液溶解，然后用血球計數器將溶解后的溶液中酵母拮抗菌的濃度稀釋到 約4Xl(fcfu/mL，吸取50叱涂布于NYDA平板上，28。C下培養12小時，用顯微鏡
觀測平板，計數。活力正常的細胞能迅速繁殖形成微菌落，而死亡的細胞或活力弱 的細胞不能形成微菌落。選擇不同的視野分別計數有活力和失去活力的細胞數量， 計算酵母拮抗菌存活率。每個平板觀察的細胞數為300個，共有3個平板用于觀察 計數。
存活率=活性細胞數量/計數細胞總數X 100% 實驗設3次重復，結果如表l所示。
表l、酵母拮抗菌膠囊劑風干后細胞存活率
處理存活率(％)
實驗(一)1% 250X 10—3pa s76. 7 ±2. 3*
實驗(二) 2. 5% 250X 10—3pa s82. 2±2. 7
實驗(三)0. 5% 3500X 10—3pa s91.5±2.9
實驗(四)1% 3500X 10—3pa s81.6±5.9
實驗(五)0. 5% 14000X10—3pa s88. 1±3, 1
實驗(六)1% 14000X10—3pa s88, 1±3. 3
*:數值為存活率士標準偏差，星號作為代表，表示此列數據均為存活率土標準偏差。
試驗結果表明酵母拮抗菌Co7 "coccm hwr朋"7經不同濃度和黏度的褐藻 酸鈉膠囊化處理后細胞存活率在75 %以上，最高達到91. 5% (0. 5 % 3500X 10—3pa s)。 (表l)。
四、存放溫度對酵母拮抗菌膠囊劑中酵母菌存活率的影響
將用黏度為3500Xl(T3pa s、濃度為0. 5%的褐藻酸鈉溶液(即步驟二中實驗(三))制備得到的膠囊劑，分別存放在4r和25t:條件下，30天后按照實驗三的
方法檢測制劑中酵母拮抗菌的存活率。
實驗設3次重復，結果取平均數。
試驗結果表明，酵母拮抗菌Cr>p"coCc"s h"2，e/7"7的膠囊劑在25'C存放30 天后的存活率為60.4%，在4。C存放30天后的存活率為62.8%，低溫存放的存活率 略高于常溫，兩者差異不顯著。表明本發明方法制備得到的菌膠囊劑可以在室溫儲 存，而且存放時間比較長。
權利要求
1、一種制備隱球酵母屬菌膠囊劑的方法，包括如下步驟將褐藻酸鹽溶液、隱球酵母屬菌、多價金屬陽離子混合，得到隱球酵母屬菌膠囊劑。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述將褐藻酸鹽溶液、隱球酵 母屬菌、多價金屬陽離子混合的方法包括如下步驟將所述褐藻酸鹽溶液與所述隱 球酵母屬菌混合，得到所述褐藻酸鹽和所述隱球酵母屬菌的混合液；再將所述混合 液與所述多價金屬陽離子的溶液混合。
3、 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述將所述混合液與所述多價 金屬陽離子的溶液混合的方法包括將所述混合液逐滴加入到所述多價金屬陽離子 的溶液的步驟。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述將所述混合液與所述多價 金屬陽離子的溶液混合的方法中，在所述將混合液逐滴加入到所述多價金屬陽離子 的溶液后，包括攪拌的步驟。
5、 根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述攪拌的時間為20-60分鐘。
6、 根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述褐藻酸鹽黏度為200Xl(Tpa s -20000X 10—3pa s，優選為250X 10—3pa s -14000 X 10—3pa s。
7、 根據權利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于所述褐藻酸鹽和所述 隱球酵母屬菌的混合液中所述褐藻酸鹽的濃度為0.5%-2.5% (質量百分含量)，所 述隱球酵母屬菌的濃度為lX 108-5 X 108cfu/mL，優選為2X 108cfu/mL;所述多價金 屬陽離子的溶液中所述多價金屬陽離子的濃度為0. 045-0. 36mol/L，優選為 0.09mol/L;所述多價金屬陽離子優選為鈣離子。
8、 根據權利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于所述逐滴加入的速度 為3-7ml/min，優選為5ml/min。
9、 根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述隱球酵母屬菌為酵母拮抗菌(CrjT t(9C(9CC^S1 23"re72"7)。
10、 由權利要求1-9中任一所述方法得到的隱球酵母屬菌膠囊劑。
全文摘要
本發明公開了一種隱球酵母屬菌膠囊劑及其制備方法。本發明的制備隱球酵母屬菌膠囊劑的方法，包括如下步驟將褐藻酸鹽溶液、隱球酵母屬菌、多價金屬陽離子混合，得到隱球酵母屬菌膠囊劑。實驗證明，本發明方法制備得到的隱球酵母屬菌膠囊劑中活菌率高，均在70％以上，高的可達90％，而且菌的活性不會下降。本發明隱球酵母屬菌膠囊劑在低溫和常溫下都可存放，常溫條件下一個月內保存效果與低溫存放效果無顯著差異，而且不會影響菌的生物活性。因此，本發明方法在制備生物制劑及菌或其它生物的保藏中都具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/04GK101503661SQ20091007977
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月10日 優先權日2009年3月10日
發明者孟祥紅, 勇 徐, 李博強, 田世平, 秦國政 申請人:中國科學院植物研究所