專利名稱：鑒定豬優良肉質基因和/或營養活性物質的方法
技術領域：
本發明涉及一種鑒定影響豬肉質性狀的營養活性物質或/和豬肉質調控基因的方法及組合物，特別涉及一種鑒定影響豬肉質性狀的營養活性物質或/和調控豬優良肉質的基因的方法，及其由特異組合的細胞模型和肉質關鍵調控基因的引物對組成的組合物。
背景技術：
發展優質高產的養豬業是提高人民生活水平、增強我國豬肉產品在國際市場的競爭力和確保養豬業可持續發展的關鍵。過去30多年來隨著科學技術的發展，我國豬肉供應 基本解決了吃肉難的問題。隨著人民生活水平的提高，消費者對豬肉風味品質、營養和安全的要求越來越高，養豬業面臨著從量變向質變轉化的過程。然而，由于養殖業長期以來的努力目標為“高產”，特別是近年來主要以引進洋種豬、規模化飼料養殖為方式的豬肉產量高增長模式，導致了目前國內主要供應豬肉品種品質的顯著下降。表現為豬肉主要品質指標明顯降低，風味、口感和營養水平下降，不僅引起廣大人民的生活質量下降，而且造成了巨大的經濟損失。據統計，北京市場上洋種養殖豬肉價格僅為10-15元/500克，而肉質優良的土種豬北京黑豬的價格在25-35元/500克。此外，肉品質低也嚴重影響了國產豬肉的進出口貿易。因此，提高豬肉品質，成為滿足人民日益增長的對優質豬肉的需求、增強我國豬肉產品在國際市場的競爭力和確保養豬業可持續發展的關鍵。經過我們的前期研究發現，豬肉的品質性狀雖然包括通過很多指標，包括嫩度、肉色、風味、系水力和口感等，但從分子營養學和細胞生物學的角度來看，豬肉的品質主要由肌纖維的發育和肌內脂肪的沉積來決定。在豬的生長和肥育過程中，如果體內脂肪主要沉積到骨骼肌部位的細胞間或細胞內，將形成“大理石紋”或“雪花肉”，明顯提高肉的品質；而如果脂肪沉積形成的皮下脂肪、內臟脂肪和腹脂是養豬生產中不想要的“廢棄脂肪”。如何在不增加“廢棄脂肪”沉積的同時(瘦肉型豬的“廢棄脂肪”已很少)增加肌內脂肪是改善肉品質的理論和技術瓶頸。研究發現，不同部位脂肪沉積和肉質發育生理進程的差異收到內因(基因)和外因(營養)的綜合作用和調控。已經報道的能夠對體內脂肪沉積和肉質發育發揮調控的功能性基因包括FABP4 (脂肪酸結合蛋白)、LIPINl等，而較為公認的營養物質為甜菜堿等。然而，運用傳統方法發現的這些基因和/或飼料添加劑，具有研究周期長、需要大規模動物實驗反復驗證、不能揭示作用機理和不能發掘綜合性效應等缺點，已經不能滿足當前豬肉肉質改良的要求。近年來，隨著基因組測序計劃的完成和芯片技術的發展，使用豬的Affymetrix(美國Affymetrix公司)寡核苷酸芯片，對不同肉質種豬進行高通量基因篩選的研究為肉質改良提供了新思路。然而，基于芯片技術的方法存在以下缺點(1)篩選結果多為海量數據，分析困難，無法進行應用推廣；(2)其中存在大量假陽性基因，不能對調控肉質的關鍵基因進行鑒定；(3)不適用與研究調控豬優良肉質的營養活性物質(含飼料添加劑等)。因此，迫切的需要開發一種新型技術，可用于對芯片篩選方法獲得的能夠對豬的肉質發育發揮重要作用的功能性基因的鑒定方法，以及適用于對傳統方法和多種豬的營養活性物質(含飼料添加劑等)對肉質影響作用進行篩選和鑒定的方法。該技術的創建，將為解決豬的肉質改良問題提供終極對策。

發明內容
本發明的目的是提供一種鑒定能夠調控豬肉質的營養活性物質或/和功能基因的方法及組合物。本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定豬營養活性物質或/和豬肉質基因的組合物由3T3-L1細胞、C2C12細胞、特異于AMPK-α基因的引物對1，以及特異于PGC-I α基因的引物對2組成；所述特異于AMPK- α基因的引物對I由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA組成；所述特異于PGC-I α基因的引物對2由序列表中序列3和序列4所不的兩條單鏈DNA組成。
所述AMPK-α基因的GENBANK登陸號為ΝΜ_001013367. 3 ;所述PGC-I α基因的GENBANK登陸號為ΝΜ_008904. 2。序列I由18個核苷酸組成；序列2由18個核苷酸組成；序列3由18個核苷酸組成；序列4由18個核苷酸組成。含有上述組合物的試劑盒也屬于本發明的保護范圍。上述組合物的制備方法也屬于本發明的保護范圍。所述組合物的制備方法包括將上述組合物中各細胞分別單獨包裝，以及將各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。上述試劑盒的制備方法也屬于本發明的保護范圍。所述試劑盒的制備方法包括如下步驟將所述組合物中各細胞分別單獨包裝，以及將所述組合物中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種包裝在同一試劑盒內=PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。本發明所提供的用上述組合物鑒定或輔助鑒定待測物質是否為豬肉質改良的營養活性物質的方法，包括如下步驟將所述待測物質分別與C2C12細胞和經“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的3T3-L1細胞共同孵育，檢測所述待測物質是否抑制所述經“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的3T3-L1細胞的成脂分化，檢測所述待測物質是否促進所述C2C12細胞的成肌分化；若所述待測物質同時滿足如下a)和b)對條件，則所述待測物質為豬肉質改良的營養活性物質或候選為豬肉質改良的營養活性物質，若所述待測物質不同時滿足如下a)和b)對條件，則所述待測物質不為豬肉質改良的營養活性物質a)所述待測物質抑制所述經“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的3T3-L1細胞的成脂分化；b)所述待測物質促進所述C2C12細胞的成肌分化。所述“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的方法包括如下步驟先用含有IBMX、胰島素和地塞米松的溶液I與待誘導細胞孵育2-4d，再用含有胰島素但不含IBMX和地塞米松的溶液2與所述細胞孵育2-3d ;所述溶液I中所述IBMX的終濃度為5 μ Μ，所述溶液I中所述胰島素的終濃度為O. I μ g/mL,所述溶液I中所述地塞米松的終濃度為I μ M ;所述溶液2中所述胰島素的終濃度為O. I μ g/mL所述方法還包括如下步驟將所述待測物質分別與所述C2C12細胞和所述經“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的3T3-L1細胞共同孵育后，利用所述引物對I檢測所述3T3-L1細胞與所述待測物質孵育后AMPK- α基因相對于所述經“ IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的3T3-L1細胞的表達量變化，利用所述引物對2檢測所述C2C12細胞與所述待測物質孵育后PGC-I α基因相對于所述C2C12細胞的表達量變化；若所述待測物質同時滿足所述a)和b)的條件，以及如下c)和d)的條件，則所述待測物質可以確證為豬肉質改良的營養活性物質，若所述待測物質滿足所述a)和b)的條件，但不滿足如下c)和d)的條件，則所述待測物質可以候選為豬肉質改良的營養活性物質c)和所述經“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導下3T3-L1細胞(陽性對照組)相t匕，與所述待測物質孵育后所述3T3-L1細胞中所述AMPK-α基因的表達量降低； d)和所述C2C12細胞組(陰性對照組)比，與所述待測物質孵育后所述C2C12細胞中所述PGC-Ia基因的表達量提高。本發明所提供的用上述組合物鑒定或輔助鑒定待測基因是否為豬優良肉質基因的方法，包括如下步驟(I)將所述待測基因分別導入3T3-L1細胞和C2C12細胞使其表達；(2)對所述3T3-L1細胞進行“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導，所述C2C12細胞不做處理；(3)檢測所述待測基因是否抑制所述3T3-L1細胞在“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導下的成脂分化，檢測所述待測基因是否促進所述C2C12細胞的成肌分化；(4)按照如下方法確定所述待測基因是否為豬優良肉質基因若所述待測基因同時滿足如下a)和b)的條件，則所述待測基因為豬優良肉質基因或候選為豬優良肉質基因，若所述待測基因不同時滿足如下a)和b)的條件，則所述待測基因不為豬優良肉質基因a)所述待測基因抑制所述3T3-L1細胞在所述“ IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導下的成脂分化；b)所述待測基因促進所述C2C12細胞的成肌分化。所述“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的方法包括如下步驟先用含有IBMX、胰島素和地塞米松的溶液I與待誘導細胞孵育2-4d，再用含有胰島素但不含IBMX和地塞米松的溶液2與所述細胞孵育2-3d ;所述溶液I中所述IBMX的終濃度為5 μ Μ，所述溶液I中所述胰島素的終濃度為O. I μ g/mL,所述溶液I中所述地塞米松的終濃度為I μ M ;所述溶液2中所述胰島素的終濃度為O. I μ g/mL。所述方法還包括如下步驟在上述方法的步驟(2)之后，同時利用所述引物對I檢測所述3T3-L1細胞中導入所述待測基因后AMPK-α基因相對于導入空質粒組的表達量變化，利用所述引物對2檢測所述C2C12細胞中導入所述待測基因后PGC-I α基因相對于導入空質粒組的表達量變化；若所述待測基因同時滿足所述a)和b)的條件，以及如下c)和d)的條件，則所述待測基因可以確證為豬優良肉質基因，若所述待測基因滿足所述a)和b)的條件，但不滿足如下c)和d)的條件，則所述待測基因可以候選為豬優良肉質基因c)和導入空質粒組相比，將所述待測基因導入所述3T3-L1細胞后所述ΑΜΡΚ-α基因的表達量降低；
d)和導入空質粒組相比，將所述待測基因導入所述C2C12細胞后所述PGC-I α基因的表達量提聞。在上述各方法中，所有步驟(I)中將所述待測基因分別導入3T3-L1細胞和C2C12細胞的方法，具體為通過重組表達載體將所述待測基因分別導入所述3T3-L1細胞和所述C2C12細胞。在本發明的一個實施例中，所述重組表達載體中啟動所述待測基因轉錄的啟動子具體為CMV啟動子。更為具體的，所述重組表達載體為在真核表達質粒pcDNA3. I的CMV啟動子下游正向插入所述待測基因得到的重組質粒。 在上述各方法中，所有將所述待測物質分別與3T3-L1細胞和C2C12細胞共同孵育的時間均可為24h-48h。在本發明的一個實施例中，具體為24h。在上述各方法中，所有所述檢測所述待測物質(或所述待測基因)是否促進所述3T3-L1細胞的成脂分化的方法，均可包括如下(I)和(2)的步驟(I)對所述3T3-L1細胞先用油紅O溶液(染脂肪)染色，再用蘇木素(染細胞核)復染；(2)按照如下方法確定結果若所述3T3-L1細胞的細胞質中出現空泡，并且著紅色(脂肪)，則判定所述待測物質(或所述待測基因)促進所述3T3-L1細胞的成脂分化；反之，則判定所述待測物質(或所述待測基因)不促進所述3T3-L1細胞的成脂分化。在上述各方法中，所有所述檢測所述待測物質(或所述待測基因)是否促進所述C2C12細胞的成肌分化的方法，均可包括如下(I)和(2)的步驟(I)對所述C2C12細胞用吉姆薩溶液(染肌管)染色；(2)按照如下方法確定結果若所述C2C12細胞的形狀變為長梭形，同時細胞質部分(肌管)被染成紫藍色，則判定所述待測物質(或所述待測基因)促進所述C2C12細胞的成肌分化；反之，則判定所述待測物質(或所述待測基因)不促進所述C2C12細胞的成肌分化。在上述各方法中，所有所述利用所述引物對I檢測所述3T3-L1細胞中導入所述待測基因前后ΑΜΡΚ-α基因的表達量變化的方法，以及所有所述利用所述引物對2檢測所述C2C12細胞中導入所述待測基因前后PGC-Ια基因的表達量變化的方法，均具體為反轉錄PCR的方法，以18S rRNA作為內參。上述組合物，或試劑盒，或任一所述方法在如下任一中的應用也屬于本發明的保護范圍(a)研制能夠改善豬肉質的飼料或飼料添加劑；(b)發掘能夠改善豬肉質的基因；( c)培育肉質改善的豬品種。在實際應用中，可采用通過上述方法鑒定得到的豬營養活性物質作為改善豬肉質的飼料或飼料添加劑的原料。本發明開展了豬優良肉質的關鍵控制基因和營養調控模式的鑒定工作，與其他方法比，具有明顯的技術優勢體外無創、可以同時篩選和鑒定營養活性物質和/或優良肉質基因、成本低、推廣性強等特點。本發明將有助于建立肌內脂肪高效沉積的優良肉質基因的核心豬群，同時引導規模化豬場和散養戶采用促進肉質改良的飼料營養組分和飼喂模式，從而推動養豬業能夠在短時間內，實現在高產的基礎上，培育出高品質豬肉的“優質”目標。本發明對節約飼料成本，及我國地方豬種優良肉質基因資源的保護和開發具有重要作用。


圖I為甜菜堿(營養活性物質)或DLKl (關鍵調控基因)誘導3T3-L1細胞成脂分化的油紅O染色和蘇木素復染結果。其中，A為陰性對照組(未經誘導的3T3-L1細胞);B為三聯誘導陽性對照組 <為甜菜堿處理組山為空質粒pcDNA3. I組；E為質粒pcDNA3. I-DLKl組。(注C、D、E同時進行了三聯誘導)。圖2為甜菜堿(營養活性物質)或DLKl (關鍵調控基因)誘導C2C12細胞成肌分化的吉姆薩染色結果。其中，A為陰性對照組(未經誘導的C2C12 細胞)；B為馬血清陽性對照組；C為甜菜堿處理組；D為空質粒pcDNA3. I組；E為質粒pcDNA3. I-DLKl組。圖3為甜菜堿(營養活性物質)或DLKl (關鍵調控基因)誘導3T3-L1細胞成脂分化中ΑΜΡΚ-α或PGCl-α基因mRNA表達檢測結果。其中，“對照組”為陰性對照組(未經誘導的3T3-L1細胞)；“三聯誘導”為三聯誘導陽性對照組；“P⑶B”為空質粒pcDNA3. I組；“DLK1”為質粒pcDNA3. I-DLKl組。(注甜菜堿、PCDB和DLKl均同時進行了三聯誘導)圖4為甜菜堿(營養活性物質)或DLKl (關鍵調控基因)誘導C2C12細胞成肌分化中ΑΜΡΚ-α或PGCl-α基因mRNA表達檢測結果。其中，“對照組”為陰性對照組(未經誘導的3T3-L1細胞)；“馬血清”為馬血清誘導陽性對照組；“PCDB”為空質粒pcDNA3. I組；“DLK1”為質粒 pcDNA3. I-DLKl 組。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。3T3-L1細胞(產品目錄號為Prod#CL_173)和C2C12細胞(產品目錄號為Prod#CRL-1772)購自美國ATCC公司。蘇木素染色液以及脂肪分化試劑包括IBMX、胰島素和地塞米松均購自Sigma公司。油紅O和吉姆薩染料購自北京西美杰科技有限公司。DMEM/F-12不完全培養基(液體)購買自美國Hyclone公司，胎牛血清、馬血清和胰酶購買自美國Gibco公司。甜菜堿購自力德士(北京)化學技術有限公司。實施例1、3T3-L1前纖維細胞成脂誘導分化細胞模型的建立I、試劑配制PBS 溶液稱取 8. OOg NaCl、O. 20g KCl,3. 12g Na2HPO4 · 12H20 和 O. 20g KH2PO4 溶于800mL超純水中，加超純水定容至1L。以5. 6%的無菌NaHCO3調節pH值至7. 2，4°C貯存備用。4%多聚甲醛溶液稱取4g多聚甲醛溶于80mL PBS溶液中，加入少量NaOH，加熱；待完全溶解后定容至lOOmL。以HCl調節pH值至7. 2，4°C貯存備用。O. 5%油紅O溶液稱取O. 05g油紅粉劑溶于IOmL異丙醇中，配成儲存液。使用前將儲存液6mL用蒸餾水稀釋至10mL，配成使用液,過濾后使用。75%冷乙醇將750mL無水乙醇與250mL PBS混合均勻，并置于4°C 48h，至液體澄
清透明。分化試劑配制
IBMX 工作液(100 X，現用現配)11. 5mg ΙΒΜΧ+940 μ L ddH20+60 μ L lmol/LKOH,O. 22 μ m過濾除菌，終濃度為O. 5mmol/L ；胰島素工作液(100X):lmg/mL HCl(O. 01mol/L HCl=O. 042mL濃HCl+50mLdd H2O),O. 22 μ m過濾除菌，終濃度為10 μ g/mL, _20°C貯存備用；地塞米松貯存液稱取3. 925mg地塞米松溶入到ImL無水乙醇中，濃度為10mmol/L, _20°C貯存備用；工作液(1000 X ):用PBS稀釋貯存液至終濃度為lmmol/L。2、細胞培養 將3T3-L1細胞接種到IOOmm培養皿內，培養液為含有10%胎牛血清的DMEM，置于370C，5%C02培養箱中培養。細胞長到80%匯合時傳代，平均2 3d傳代一次。取待傳代細胞培養皿，輕棄培養液，預溫PBS少許輕洗一遍，棄去PBS ;加少許0. 25%胰酶，置于培養箱約lmin，鏡下觀察細胞間隙擴大，細胞突起縮短；棄去消化液，加2 5mL新鮮培養液終止消化，輕輕吹打，待成單細胞懸液后轉移至15mL尖底離心管，IOOOrpm 4°C離心5min，用ImL新鮮培養液重懸細胞，按一定比例接種至含有培養液的IOOmm培養皿中。3、3T3_L1前纖維細胞成脂誘導分化程序細胞接種密度為30%，當達到100%匯合時，繼續培養2d，即接觸抑制2d。經典“雞尾酒”法誘導3d，即“ IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導(步驟I中所述IBMX工作液和所述胰島素工作液的加量均為培養液總體積的I/100 ;所述地塞米松工作液的加量為培養液總體積的1/1000 ;輕輕混勻后繼續培養)。換液，胰島素單獨誘導2d (步驟I中所述胰島素工作液的加量為培養液總體積的1/100 ;輕輕混勻后繼續培養)，此時細胞貼壁不緊，易成片脫落，所以換液時動作要輕柔。此后，換入正常的含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液培養，每2d換液。自誘導第6d (顯微鏡下觀察開始出現又圓又亮的脂滴)后開始進行細胞染色，觀察細胞的成脂誘導分化情況，并計算分化率。分化率=(油紅著色細胞數/總細胞核數)X 100%4、油紅染色步驟小心抽去6孔培養板內的培養液。每孔加入400 μ LPBS溶液，清洗生長中的細胞表面。小心抽去每孔里的PBS溶液。每孔加入400 μ L4%多聚甲醛溶液，覆蓋整個細胞生長表面。室溫下孵育lOmin。小心抽去多聚甲醛溶液。每孔加入400 μ L PBS溶液，清洗生長中的細胞表面。小心抽去PBS溶液，并重復操作一次。小心加入400 μ L75%冷乙醇，覆蓋整個細胞生長表面，室溫靜置5min。小心抽去75%冷乙醇，重復此步驟一次。小心加入400 μ L0. 5%油紅O溶液，覆蓋整個細胞生長表面，室溫下靜置15分鐘，可見部分細胞呈紅色。小心抽去0. 5%油紅O溶液，室溫下加入400 μ LPBS溶液，并孵育2min。小心抽去PBS溶液。5、蘇木素復染處理用PBS溶液清洗細胞生長表面數次，直至液體清亮，無明顯紅色。加入蘇木素染色液，覆蓋整個培養板，約lmin。小心抽去染液，并用PBS溶液清洗至液體清亮。6、顯微鏡下觀察拍照使用Olympus細胞培養用顯微鏡(CK40型，Olympus公司，日本)，使用40倍物鏡觀察，選定代表性視野后，用彩色CCD進行拍照。結果如圖I中B所示，部分3T3-L1細胞的細胞質中出現空泡，并且脂肪被油紅O溶液染成紅色，基本所有3T3-L1細胞的細胞核都被蘇木素溶液染成了藍色。另外，自誘導后第ClOd，可以達到80%或以上的分化率。實施例2、C2C12前肌肉細胞成肌誘導分化細胞模型的建立I、染液制備稱取O. 5g吉姆薩粉和22ml甘油；取少量甘油與吉姆薩粉在研缽內充分混合，研磨至無顆粒；將剩余的甘油倒入研缽，于56°C保溫2h ;加入33ml純甲醇混勻，即為吉姆薩母液，將其保存于棕色試劑瓶內；取9份pH 6. 8-7. 3的PBS緩沖液和I份吉姆薩母液混合即得染色液。2、細胞培養將C2C12細胞按I X IO4細胞/cm2接種于6孔細胞培養板中，加入DMEM/F-12完全培養基(即DMEM/F-12不完全培養基中加入體積終濃度為10%的胎牛血清)，將細胞培養板放置于5%C02、37°C培養箱中培養，然后，每天換DMEM/F-12完全培養基一次。C2C12細胞在培養基中生長3飛d，待細胞8(Γ90%融合后，棄去DMEM/F-12完全培養基，加入細胞分化培養基(在液體DMEM/F-12不完全培養基中加入體積終濃度為2%的馬血清)，每天換新鮮細胞分化培養基一次。自誘導第2-3d (C2C12細胞分化為肌管)后開始進行細胞染色，觀察細胞的成肌誘導分化情況。3、貼壁細胞染色去除培養器皿內的培養液，用PBS溶液反復漂洗單層培養物2次；加入PBS溶液，再逐滴加入等體積甲醇，邊加邊混合，靜置IOmin ;將50%體積的甲醇-PBS混合液丟棄，力口入新鮮的甲醇液浸泡固定細胞IOmin,然后用甲醇漂洗細胞I次；將瓶內細胞干燥后儲存或直接染色；按2ml/cm2的比例滴加吉姆薩染液，覆蓋細胞層，染色2min ;移除染液，用自來水沖洗掉粉紅色背景后，再用去離子水沖洗細胞；用顯微鏡觀察單層潮濕細胞。若細胞已干，可重新使細胞潮濕后再觀察。結果如圖2中B所示，C2C12細胞的形狀變為長梭形，同時細胞質部分(肌管被染成紫藍色。實施例3、脂肪和肌肉組織中脂質沉積的關鍵性基因的分子探針設計一般而言，北京黑豬的肌內脂肪沉積量約為3.0%_4.5%，約為瘦肉型豬的兩倍。利用豬的Affymetrix寡核苷酸芯片(Porcine Genome Array,基因有限公司，產品目錄號900623)，對北京黑豬和杜長大商品瘦肉型豬(北京超市里均有銷售)的基因轉錄表達譜進行掃描，得到若干DNA片段備選。結合文獻和本實驗室前期研究結果，發現豬的肉品質決定是一個復雜的生理進程，主要涉及到的細胞生物學進程包括肌肉細胞的發生和脂質沉積、脂肪細胞的分化和脂質沉積等，但其中發揮主要調控作用的信號通路為PI3K和cGMP等。基于以上深入研究結果，對傳統方法和芯片方法進行改進，本發明選定這兩條關鍵信號通路的決定性基因 ΑΜΡΚ-α 和 PGCl-α (ΑΜΡΚ-α 基因的 GENBANK NM_001013367. 3 ；PGC-1 α 基因的GENBANK NM_008904. 2)，開發出組合分子引物探針，用于實時定量PCR檢測方法檢測收集的細胞標本中的AMPK- α和PGCI - α基因的mRNA表達水平。其中，特異于AMPK- α基因的引物序列為如下Al和Α2 ;特異于PGC-Ia基因的引物序列為如下Pl和Ρ2。Al和Α2擴增片段為138堿基；P1和P2擴增片段為158堿基。Al :5，-agttcctggagaaagatg-3，(序列 1，為 GENBANK NM_001013367. 3 的第 21-38位)A2:5，-tccggtcaactcgtgctt-3’(序列 2，為 GENBANK NM_001013367. 3 的第141-158位的反向互補序列)Pl :5，-catagagtgtgctgctct-3，(序列 3，為 GENBANK NM_008904. 2 的第 181-198位)P2 :5，-actggttggatatgattt-3，(序列 4，為 GENBANK NM_008904. 2 的第 321-338位的反向互補序列)實施例4、優良肉質影響因素鑒定模型和分子探針的實際應用舉例一、用于鑒定豬營養活性物質或/和優良肉質基因的組合物本實施例中用于鑒定或輔助鑒定豬營養活性物質或/和優良肉質基因的組合物由實施例I中所述的3T3-L1細胞、實施例2中所述的C2C12細胞、以及實施例3中設計的特異于ΑΜΡΚ-α基因的引物對和特異于PGC-I α基因的引物對組成。二、鑒定或輔助鑒定待測物質是否為豬肉質改良的營養活性物質(一)操作方法及結果判斷Α.操作方法具體如下I、參照實施例I的方法，用不同濃度的待測物質溶液與“ΙΒΜΧ+胰島素+地塞米松”三聯誘導成脂分化的3T3-L1細胞共孵育24h，其余步驟均與實施例I步驟相同。2、參照實施例2的方法，用不同濃度的待測物質替代細胞分化培養基中的“馬血清”與C2C12細胞共孵育24h，進行成肌誘導分化，其余步驟均與實施例2步驟相同。
3、步驟I和步驟2細胞分化結束后，分別收集細胞，按照如下方法提取總RNA 為防止RNA降解，在液氮中將樣品研磨至粉末，待液氮汽化后加入RNA提取試劑Trizol (每O. Ig樣品加Iml Trizol )，室溫放置5分鐘，使組織和細胞充分裂解。12000轉/分鐘離心5分鐘，棄沉淀。按每Iml Trizol加入200 μ I氯仿的比例加入氯仿，振蕩混勻后室溫靜置15分鐘。在4°C條件下12000轉/分鐘尚心15分鐘,使油相與水相分尚，吸取上層水相(不要接觸一點油相)至另一離心管中。按每Iml Trizol加入0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇混勻，在室溫下靜置10分鐘使RNA沉淀。在4°C條件下12000轉/分鐘離心10分鐘，棄去上清液，只留沉于管底的RNA。按每Iml Trizol加入Iml乙醇的比例加入75%的乙醇，溫和振蕩離心管，使沉淀懸浮。在4°C條件下8000轉/分鐘離心5分鐘后，在避免丟失RNA沉淀的前提下盡量多地棄去上清液，然后將沉淀干燥，得到樣品RNA。4、mRNA反轉錄和熒光實時定量PCR :使用北京百泰克生物制品公司的2 X SYBRRT-PCR 試劑盒，按照使用說明書提示的操作方法，在冰上配置PCR反應液。主要組分為2 X Pr emi X IO μ I，上游引物(AI或PI)和下游引物(A2或P2 )各2 μ mo I，提取的總RNA模板O. lng，然后使用滅菌蒸餾水將總體積補充至20 μ I。使用BioTek熒光實時定量PCR儀，按照兩步法進行RT-PCR反應程序。95°C起始模板變性2分鐘，然后進行以下反應25個循環95°C模板變性15秒，65°C退火延伸40秒。根據實時定量PCR儀繪制的擴增曲線和溶解曲線，得出各個樣品對應的mRNA含量的相對值。其中，以18S rRNA為內參對結果進行校正。每個實驗重復三次，然后對結果進行統計分析。B.結果判斷標準如下經步驟A中I和2的染色后，若所述待測物質同時滿足如下a)和b)的條件，則初步判斷所述待測物質為豬肉質改良的營養活性物質或候選為豬肉質改良的營養活性物質；接著進行步驟A中3和4的基因表達檢測，若所述待測物質同時滿足如下c)和d)的條件，則可以確定證實所述待測物質為豬肉質改良的營養活性物質；經步驟A中I和2的染色后，若所述待測物質不同時滿足如下a)和b)的條件，則判斷所述待測物質不為豬肉質改良的營養活性物質；經步驟A中I和2的染色后，若所述待測物質在滿足如下a)和b)條件的前提下，進一步進行步驟A中3和4的基因表達檢測，但不同時滿足如下c)和d)的條件，則所述待測物質可以候選為豬肉質改良的營養活性物質。a)所述待測物質抑制經“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的3T3-L1細胞的成脂分化；b)所述待測物質促進C2C12細胞的成肌分化；
c)和所述經“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導下3T3-L1細胞(陽性對照組)相t匕，與所述待測物質孵育后所述3T3-L1細胞中所述ΑΜΡΚ-α基因的表達量降低；d)和所述C2C12細胞(陰性對照組)比，與所述待測物質孵育后所述C2C12細胞中所述PGC-Ia基因的表達量提高。(二)實際應用甜菜堿是較為公認的豬營養活性物質，以下將以甜菜堿作為待測物質，驗證步驟(一)所述方法的準確性。甜菜堿與3T3-L1細胞共孵育時的工作濃度梯度具體為4mmol/L ;甜菜堿與C2C12細胞共孵育時的工作濃度梯度具體為4mmol/L。其余操作步驟參見步驟(一)。同時，對于3T3-L1細胞的成脂誘導分化，以實施例I以三聯誘導方法誘導的3T3-L1成脂分化細胞作為陽性對照；以未經誘導的3T3-L1細胞作為陰性對照。對于C2C12細胞的成肌誘導分化，以實施例2以馬血清方法誘導的C2C12成肌分化細胞作為陽性對照；以未經誘導的C2C12細胞作為陰性對照。每組處理兩個重復。誘導到時間后，其中一組執行實施例I中的油紅O染色和蘇木素復染(3T3-L1細胞成脂誘導分化)或實施例2中的吉姆薩染色(C2C12細胞成肌誘導分化)，然后在顯微鏡下采集代表性圖片；另外一組收集誘導后的3T3-L1細胞或C2C12細胞，按照步驟(一)中方法對AMPK- α和PGCl- α基因mRNA表達進行檢測，以陰性對照組AMPK- α或PGCl-α基因的表達量為I。3T3-L1細胞成脂誘導分化的油紅O染色和蘇木素復染結果如圖I所示，與陽性對照組相比，甜菜堿處理組只有部分細胞被油紅O著色，這表明甜菜堿相對于陽性對照組具有抑制前脂肪細胞成脂分化的作用。另外，AMPK-α或PGCl-α基因mRNA表達檢測結果如圖3所示，從圖中可以看出，在三聯誘導分化的3T3-L1細胞中，甜菜堿相對于陽性對照組，抑制AMPK-α基因的表達，而對PGCl-α基因的表達沒有作用。C2C12細胞成肌誘導分化的吉姆薩染色結果如圖2所示，與陽性對照組相類似，甜菜堿處理組細胞的形狀變為長梭形，同時細胞質部分(肌管)被染成紫藍色。這表明甜菜堿具有促進前成肌細胞成肌分化的作用。另外，ΑΜΡΚ-α或PGCl-a基因mRNA表達檢測結果如圖4所示，從圖中可以看出，在分化的C2C12細胞中，甜菜堿促進PGCl-a基因的表達，而對AMPK-α基因的表達沒有作用。結合以上兩方面數據，可以看出一方面，甜菜堿可以通過激活成肌細胞中PGCl-a基因的表達，進而促進細胞的成肌分化；另一方面，甜菜堿可以通過抑制成脂細胞中ΑΜΡΚ-α基因的表達，進而抑制機體脂肪細胞的成脂分化。因此，甜菜堿具有促進動物肌內脂肪沉積的作用，因此可以鑒定甜菜堿為對豬的優良肉質具有調控作用的營養活性物質。三、鑒定或輔助鑒定待測基因是否為豬的優良肉質基因(一)操作方法及結果判斷Α.操作方法具體如下I、參照實施例I的方法，用攜帶有待測基因的真核重組表達載體轉染3T3-L1細胞(轉染方法為使用BTX公司的ΒΤΧ-Τ820方波電轉儀電轉。具體操作為將3T3-L1細胞用無血清RPMI 1640細胞培養基稀釋為調細胞密度為6-10 X 106/ml，取350 μ I/樣品，加入IOyg質粒DNA混勻。電轉條件為300V 5msο詳細方法參照Ma X，et al. , CREBL2, interactingwith CREB，induces adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. Biochem J.2011 Oct I； 439 (I) :27-38),轉染后培養24h，采用“IBMX+胰島素+地塞米松”進行3T3-L1細胞的三聯成脂誘導分化，其余步驟均與實施例I步驟相同。使用空質粒轉染作為ΑΜΡΚ-α基因鑒定的陰性對照(記為P⑶B組)。2、參照實施例2的方法，用攜帶有待測基因的真核重組表達載體轉染C2C12細胞(轉染方法為使用BTX公司的ΒΤΧ-Τ820方波電轉儀電轉。具體操作為將C2C12細胞稀釋為2 X IO6細胞/350 μ I不完全培養基，加入10 μ g質粒DNA混勻。電轉條件為120V 20ms),轉染后培養2-3d，觀察C2C12細胞的成肌誘導分化，其余步驟均與實施例2步驟相同。使用空質粒轉染作為PGC-I α基因鑒定的陰性對照(記為P⑶B組)。3、步驟I和步驟2細胞分化結束后，分別收集細胞，按照如下方法提取總RNA :為防止RNA降解，在液氮中將樣品研磨至粉末，待液氮汽化后加入RNA提取試劑Trizol (每
O.Ig樣品加Iml Trizol )，室溫放置5分鐘，使組織和細胞充分裂解。12000轉/分鐘離心5分鐘，棄沉淀。按每Iml Trizol加入200 μ I氯仿的比例加入氯仿，振蕩混勻后室溫靜置15分鐘。在4°C條件下12000轉/分鐘尚心15分鐘,使油相與水相分尚，吸取上層水相(不要接觸一點油相)至另一離心管中。按每Iml Trizol加入O. 5ml異丙醇的比例加入異丙醇混勻，在室溫下靜置10分鐘使RNA沉淀。在4°C條件下12000轉/分鐘離心10分鐘，棄去上清液，只留沉于管底的RNA。按每Iml Trizol加入Iml乙醇的比例加入75%的乙醇，溫和振蕩離心管，使沉淀懸浮。在4°C條件下8000轉/分鐘離心5分鐘后，在避免丟失RNA沉淀的前提下盡量多地棄去上清液，然后將沉淀干燥，得到樣品RNA。4、mRNA反轉錄和熒光實時定量PCR :使用北京百泰克生物制品公司的2 X SYBRRT-PCR 試劑盒，按照使用說明書提示的操作方法，在冰上配置PCR反應液。主要組分為2 X Pr emi X IO μ I，上游引物(AI或PI)和下游引物(A2或P2 )各2 μ mo I，提取的總RNA模板
O.lng，然后使用滅菌蒸餾水將總體積補充至20 μ I。使用BioTek熒光實時定量PCR儀，按照兩步法進行RT-PCR反應程序。95°C起始模板變性2分鐘，然后進行以下反應25個循環95°C模板變性15秒，65°C退火延伸40秒。根據實時定量PCR儀繪制的擴增曲線和溶解曲線，得出各個樣品對應的mRNA含量的相對值。其中，以18S rRNA為內參對結果進行校正。每個實驗重復三次，然后對結果進行統計分析。B.結果判斷標準如下經步驟A中I和2的染色后，若所述待測基因同時滿足如下a)和b)的條件，則初步判斷所述待測基因為豬優良肉質基因或候選為豬優良肉質基因；接著進行步驟A中3和4的基因表達檢測，若所述待測基因同時滿足如下c)和d)的條件，則可以確定證實所述待測基因為豬優良肉質基因。經步驟A中I和2的染色后，若所述待測基因不同時滿足如下a)和b)的條件，則判斷所述待測基因不為豬優良肉質基因；經步驟A中I和2的染色后，若所述待測基因在滿足如下a)和b)條件的前提下，進一步進行步驟A中3和4的基因表達檢測，但不同時滿足如下c)和d)的條件，則判斷所述待測基因可以候選為豬優良肉質基因。a)所述待測基因抑制所述3T3-L1細胞在所述“ IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導下的成脂分化；b)所述待測基因促進所述C2C12細胞的成肌分化。
c)和導入空質粒組(P⑶B組)相比，將所述待測基因導入所述3T3-L1細胞后所述ΑΜΡΚ-α基因的表達量降低；d)和導入空質粒組(P⑶B組)相比，將所述待測基因導入所述C2C12細胞后所述PGC-I α基因的表達量提高。(二)實際應用DLKl 基因(pref-1 gene)是公認的豬優良肉質基因(Smas CM, KachinskasD, Liu CM,Xie X,Dircks LK, Sul HS. Transcriptional control of thepref-1 gene in 3T3-Lladipocyte differentiation. Sequence requirementfor differentiation-dependent suppression.J Biol Chem.1998 Nov27; 273 (48) :31751-8.)，以下將以DLKl基因作為待測基因，驗證步驟(一)所述方法的準確性。攜帶有DLKl基因的真核重組表達載體具體為pcDNA3. I-DLKl (質粒構建過程詳見Yin D, Xie D, Sakajiri S，Miller Cff, Zhu H, Popoviciu ML, Said JW, Black KL, KoefflerHP. DLKl: increased expression in gliomas and associated with oncogenicactivities. Oncogene. 2006 Mar 23; 25 (13) : 1852-61.)。在重組表達載體 pcDNA3. 1-DLK1中啟動所述待測基因DLKl基因轉錄的啟動子具體為CMV啟動子。基本電轉步驟為用胰酶+EDTA消化細胞，無血清RPMI 1640細胞培養基洗細胞3遍，調細胞密度為6-10 X106/ml，取350 μ I/樣品。真核重組表達載體pcDNA3. I-DLKl的用量為10 μ g，采用2mm電轉杯，3T3-L1細胞的轉染條件為300v，5ms ；C2C12細胞的轉染條件為120v，20ms。電擊后，室溫靜置5_10分鐘，重鋪細胞于10%胎牛血清的RMPI 1640培養基中。其余操作步驟參見步驟(一)。同時，對于3T3-L1細胞的成脂誘導分化，以實施例I以三聯誘導方法誘導的3T3-L1成脂分化細胞作為陽性對照；以未經誘導的3T3-L1細胞作為陰性對照。對于C2C12細胞的成肌誘導分化，以實施例2以馬血清方法誘導的C2C12成肌分化細胞作為陽性對照；以未經誘導的C2C12細胞作為陰性對照。每組處理兩個重復。誘導到時間后，其中一組執行實施例I中的油紅O染色和蘇木素復染(3T3-L1細胞成脂誘導分化)或實施例2中的吉姆薩染色(C2C12細胞成肌誘導分化)，然后在顯微鏡下采集代表性圖片；另外一組收集誘導后的3T3-L1細胞或C2C12細胞，按照步驟(一)中方法對ΑΜΡΚ-α和PGCl-α基因mRNA表達進行檢測，以陰性對照組AMPK-α或PGCl_a基因的表達量為I。
3T3-L1細胞成脂誘導分化的油紅O染色和蘇木素復染結果如圖I所示，與陽性對照組相比，轉入真核重組表達載體pcDNA3. I-DLKl的細胞被油紅O著色比例明顯降低，這表明DLKl基因相對于陽性對照組，具有抑制前脂肪細胞成脂分化的作用。另外，ΑΜΡΚ-α或PGCl-α基因mRNA表達檢測結果如圖3所示，從圖中可以看出，在分化的3T3-L1細胞中，DLKl基因相對于陽性對照組，抑制ΑΜΡΚ-α基因的表達，而對PGCl-α基因的表達沒有作用。C2C12細胞成肌誘導分化的吉姆薩染色結果如圖2所示，與陽性對照組相類似，轉入真核重組表達載體DLKl的C2C12細胞的形狀變為長梭形，同時細胞質部分(肌管)被染成紫藍色。這表明DLKl基因具有促進前成肌細胞成肌分化的作用。另外，ΑΜΡΚ-α或PGCl-a基因mRNA表達檢測結果如圖4所示，從圖中可以看出，在分化的C 2C12細胞中，DLKI基因促進PGCl-α基因的表達，而對AMPK-α基因的表達沒有作用。結合以上兩方面數據，可以看出一方面，DLKl基因可以通過激活成肌細胞中PGCl-α基因的表達，進而促進細胞的成肌分化；另一方面，DLKl基因可以通過抑制成脂細胞中AMPK-α基因的表達，進而抑制機體脂肪細胞的成脂分化。因此，DLKl基因具有促進動物肌內脂肪沉積的作用，因此可以鑒定DLKl基因為對豬的優良肉質具有調控作用的基因。
權利要求
1.用于鑒定或輔助鑒定豬營養活性物質或/和豬肉質基因的組合物，其特征在于所述組合物由3T3-L1細胞、C2C12細胞、特異于AMPK-a基因的引物對1，以及特異于PGC-I a基因的引物對2組成； 所述特異于AMPK-a基因的引物對I由序列表中序列I和序列2所不的兩條單鏈DNA組成；所述特異于PGC-I a基因的引物對2由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成。
2.含有權利要求I所述組合物的試劑盒。
3.權利要求I所述組合物的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權利要求I所述組合物中各細胞分別單獨包裝，以及將各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
4.權利要求3所述試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權利要求I所述組合物中各細胞分別單獨包裝，以及將所述組合物中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種包裝在同一試劑盒內=PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
5.用權利要求I所述組合物鑒定或輔助鑒定待測物質是否為豬肉質改良的營養活性物質的方法，包括如下步驟將所述待測物質分別與C2C12細胞和經“ IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的3T3-L1細胞共同孵育，檢測所述待測物質是否抑制所述經“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的3T3-L1細胞的成脂分化，檢測所述待測物質是否促進所述C2C12細胞的成肌分化；若所述待測物質同時滿足如下a)和b)對條件，則所述待測物質為豬肉質改良的營養活性物質或候選為豬肉質改良的營養活性物質，若所述待測物質不同時滿足如下a)和b)對條件，則所述待測物質不為豬肉質改良的營養活性物質 a)所述待測物質抑制所述經“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的3T3-L1細胞的成脂分化； b)所述待測物質促進所述C2C12細胞的成肌分化。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟將所述待測物質分別與所述C2C12細胞和所述經“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的3T3-L1細胞共同孵育后，利用所述引物對I檢測所述3T3-L1細胞與所述待測物質孵育后AMPK-a基因相對于所述經“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導的3T3-L1細胞的表達量變化，利用所述引物對2檢測所述C2C12細胞與所述待測物質孵育后PGC-I a基因相對于所述C2C12細胞的表達量變化；若所述待測物質同時滿足所述a)和b)的條件，以及如下c)和d)的條件，則所述待測物質為豬肉質改良的營養活性物質，若所述待測物質滿足所述a)和b)的條件，但不滿足如下c)和d)的條件，則所述待測物質候選為豬肉質改良的營養活性物質 c)和所述經“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導下3T3-L1細胞相比，與所述待測物質孵育后所述3T3-L1細胞中所述AMPK-a基因的表達量降低； d)和所述C2C12細胞比，與所述待測物質孵育后所述C2C12細胞中所述PGC-Ia基因的表達量提聞。
7.用權利要求I所述組合物鑒定或輔助鑒定待測基因是否為豬優良肉質基因的方法，包括如下步驟 (1)將所述待測基因分別導入3T3-L1細胞和C2C12細胞使其表達； (2)對所述3T3-L1細胞進行“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導；(3)檢測所述待測基因是否抑制所述3T3-L1細胞在“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導下的成脂分化，檢測所述待測基因是否促進所述C2C12細胞的成肌分化； (4)按照如下方法確定所述待測基因是否為豬優良肉質基因若所述待測基因同時滿足如下a)和b)的條件，則所述待測基因為豬優良肉質基因或候選為豬優良肉質基因，若所述待測基因不同時滿足如下a)和b)的條件，則所述待測基因不為豬優良肉質基因 a)所述待測基因抑制所述3T3-L1細胞在所述“IBMX+胰島素+地塞米松”三聯誘導下的成脂分化； b)所述待測基因促進所述C2C12細胞的成肌分化。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟在權利要求7步驟(2)之后，同時利用所述引物對I檢測所述3T3-L1細胞中導入所述待測基因后AMPK- a基因相對于導入空質粒組的表達量變化，利用所述引物對2檢測所述C2C12細胞中導入所述待測基因后PGC-I a基因相對于導入空質粒組的表達量變化；若所述待測基因同時滿足所述a)和b)的條件，以及如下c)和d)的條件，則所述待測基因為豬優良肉質基因，若所述待測基因滿足所述a)和b)的條件，但不滿足如下c)和d)的條件，則所述待測基因候選為豬優良肉質基因 c)和導入空質粒組相比，將所述待測基因導入所述3T3-L1細胞后所述AMPK-a基因的表達量降低； d)和導入空質粒組相比，將所述待測基因導入所述C2C12細胞后所述PGC-Ia基因的表達量提高。
9.根據權利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于將所述待測基因分別導入所述3T3-L1細胞和所述C2C12細胞的方法，為通過重組表達載體電轉將所述待測基因分別導入所述3T3-L1細胞和所述C2C12細胞； 所述將所述待測物質分別與3T3-L1細胞和C2C12細胞共同孵育的時間為24_48h。
10.權利要求I所述組合物，或權利要求2所述試劑盒，或權利要求5-9中任一所述的方法在如下任一中的應用 (a)研制能夠改善豬肉質的飼料或飼料添加劑； (b)發掘能夠改善豬肉質的基因； (c)培育肉質改善的豬品種。
全文摘要
本發明公開了一種鑒定影響豬肉質性狀的營養活性物質或/和豬肉質調控基因的方法及組合物。本發明所提供的組合物由3T3-L1細胞、C2C12細胞、特異于AMPK-α基因的引物對，以及特異于PGC-1α基因的引物對組成；所述特異于AMPK-α基因的引物對和所述特異于PGC-1α基因的引物對分別由序列1和序列2、序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成。本發明有助于建立肌內脂肪高效沉積、而腹部和皮下等部位脂肪顯著降低的優良肉質基因的核心豬群，引導規模化豬場和散養戶采用促進肉質改良的飼料營養組分、配方和飼喂模式，推動養豬業在短時間內，實現在高產基礎上，培育出高品質豬肉的“優質”目標。本發明對節約飼料成本，及我國地方豬種優良肉質基因資源的保護和開發具有重要作用。
文檔編號C12Q1/02GK102776280SQ201210194859
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月13日 優先權日2012年6月13日
發明者劉玫, 劉璐, 張倩, 李德發, 胡聲迪, 馬曦 申請人:中國農業大學