專利名稱：一種成纖維細胞培養液的制作方法
技術領域：
本發明涉及動物細胞培養技術領域，尤其涉及ー種成纖維細胞培養液。
背景技術：
細胞是生物體的基本結構和功能單位，在生命科學迅速發展的當今社會，動物克隆、干細胞、乳腺生物反應器轉基因動物、人造組織和器官等重大科學進展都離不開細胞エ程所建立的平臺。細胞工程是人類按照一定的設計方案，通過在細胞、亞細胞或組織水平上進行實驗操作，獲得重構的細胞、組織、器官，甚至個體，從而培育創造優秀品種或產品的綜合性生物工程。當前細胞工程所涉及的主要技術領域有細胞培養、細胞融合、細胞拆合、染 色體操作及基因轉移等方面。細胞工程已經滲透到人類生活衣食住行等許多領域，如治療疾病的藥物、預防疾病的疫苗、美容的化妝品、吃的食物等。細胞培養是細胞工程得以產業化應用的平臺和基礎，通過培養出大量的細胞用于生產和研究才能生產出細胞工程產品。在培養應用的眾多細胞中，成纖維細胞是應用最廣泛的細胞之一。成纖維細胞具有來源廣泛，因細胞呈現纖維狀形態而得名，各種組織器官中均含有大量的成纖維細胞，成纖維細胞在組織中常用于受損組織器官的快速修復。目前，成纖維細胞已廣泛應用于動物克隆、干細胞、轉基因乳腺生物反應器動物、人造組織和器官等重大科學研究和生產實踐。但是，高質量和生長性能的成纖維細胞對于細胞工程產品的質量和效率至關重要。在成纖維細胞的培養生長過程中，細胞培養液是必不可少的。目前的常規細胞培養液，在使用中存在成纖維細胞生長速度慢，増殖能力弱，培養的成纖維細胞經常不具有典型的纖維狀形態，以及抗凋亡能力較弱而且容易衰老的問題。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供ー種成纖維細胞培養液。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是ー種成纖維細胞培養液，由以下組分組成
10%月臺牛血清,4 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子,2. 5 μ g/ml Plasmocin, 100 U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，高糖DMEM培養液補足到100%。喊性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纖維細胞生長因子蛋白(fibroblast growth factors, FGFs)家族中的一員。目前已發現至少22種FGF，bFGF是哺乳動物和人體中ー種非常微量的活性物質，具有廣泛的生理功能和重要的臨床應用價值。bFGF具有能刺激新生血管形成，參與創傷愈合和組織再生，促進胚胎組織發育和分化等，此外還與腫瘤的發生發展密切相關。近年來，重組bFGF已被應用于臨床治療創傷、潰瘍及神經系統等疾病。在細胞培養中支原體感染發生率達到63%，支原體感染發生后能改變細胞的DNA、RNA及蛋白表達,從而導致細胞生長緩慢和質量較差。Plasmocin屬于新一代殺菌抗生素，能強烈的作用于感染支原體的細胞，殺滅支原體。同時，Plasmocin能以ー種較低的作用濃度發揮廣譜的抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性的細菌作用，比如能作用于耐青霉素與鏈霉素的細菌，已經證實Plasmocin對真核細胞沒有毒性，不影響細胞本身的代謝。本發明的有益效果是
本發明設計的成纖維細胞培養液與常規成纖維細胞培養液相比，能使成纖維細胞生長速度快，増殖能力強，培養的成纖維細胞具有典型的纖維狀形態，及具有更強的抗凋亡能力而不易衰老。因此，本發明設計的成纖維細胞培養液培養的成纖維細胞應用于生產實踐將會生產出更高質量和效率的細胞工程產品。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進ー步詳細的說明。 圖I是在本發明設計的成纖維細胞培養液中生長的纖維狀細胞形態。圖2是在常規成纖維細胞培養液中生長的纖維狀細胞形態。
具體實施例方式一、材料與方法
I、成纖維細胞的培養
取牛、羊、豬和小鼠的成纖維細胞進行培養，實驗組采用設計的新型成纖維細胞培養液(下稱新型培養液)，新型培養液的組分為10% FBS+ 4 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子+2. 5 μ g/ml Plasmocin + 100 U/ml 青霉素+100 μ g/ml 鏈霉素 +高糖 DMEM培養液。對照組采用常規成纖維細胞培養液(下稱常規培養液)，常規培養液的組分為10% FBS +100 U/ml青霉素+ 100 μ g/ml鏈霉素+高糖DMEM培養液。分別取不同物種相同培養代數的成纖維細胞，采用上述兩種培養液進行培養。2、成纖維細胞的增殖能力檢測
分別按相同的密度接種不同物種的成纖維細胞，采用上述兩種培養液，在其它因素相同的培養條件下進行培養，對于生長增殖能力進行檢測的細胞，用4%多聚甲醛進行固定，用I μ g/ml的熒光染料DAPI進行細胞核染色，Imin后熒光鏡下觀察細胞增殖結果和細胞增殖狀態。同時，用胰酶消化細胞，收集單個細胞，進行細胞計數，統計分析細胞的増殖能力。3、成纖維細胞的抗凋亡能力檢測
分別按相同的密度接種不同物種的成纖維細胞，采用上述兩種培養液，在其它因素相同的培養條件下進行培養，用lOyg/ml的絲裂霉素處理成纖維細胞，處理后消化成纖維細胞，再接種進行培養，分別于I周后用4%多聚甲醛進行固定，用I μ g/ml的熒光染料DAPI進行細胞核染色，Imin后熒光鏡下觀察細胞抗凋亡能力。在不用絲裂霉素處理的情況下，分別對細胞進行傳代，傳代至第五代時在細胞生長的第二天用4%多聚甲醛進行固定，用Iyg/ml的熒光染料DAPI進行細胞核染色Imin后熒光鏡下觀察細胞抗凋亡能力。ニ、實驗結果
I、成纖維細胞的典型纖維狀生長形態
如圖I所示，在使用設計的新型培養液之后，牛、羊、豬和小鼠的成纖維細胞均呈現典型的纖維狀生長形態，處于生長階段的成纖維細胞其纖維狀形態較為短粗，而處于鋪滿培養皿階段的成纖維細胞則呈現狹長的纖維狀形態，成纖維細胞之間連接緊密，単位細胞生長面積細胞密度較大。纖維狀的細胞緊密連接形成渦旋狀細胞群體形態，渦旋狀細胞群體形態是高質量成纖維細胞的重要細胞形態表現。如圖2所示，在相同培養環境條件下，使用常規培養液的牛、羊、豬和小鼠的成纖維細胞則呈現扁平狀細胞形態，単位面積細胞生長密度相對較小。2、成纖維細胞快速的生長增殖能力
牛、羊、豬和小鼠的成纖維細胞在I :3比例進行培養傳代的情況下，常規培養液則需要3天才能鋪滿培養皿，而使用新型培養液僅需要I I. 5天即可鋪滿培養皿。對鋪滿培養皿的細胞進行計數顯示，使用設計的新型培養液細胞數量是常規培養液細胞數量的5 10倍。堿性成纖維細胞生長因子在培養液中僅添加使用一次，以后進行傳代培養的細胞相對于只用常規培養液培養的細胞而言均具有較強的増殖能力。堿性成纖維細胞生長因子在培養液中的濃度超過4 ng/ml之后，細胞的生長增殖速度和細胞的生長形態均無明顯差異和 影響。3、成纖維細胞較強的抗凋亡能力
細胞凋亡是細胞在生長過程中的自然死亡和衰老現象。牛、羊、豬和小鼠的成纖維細胞在使用設計的新型培養液之后，于培養的第五代時細胞凋亡現象極少出現，而在常規培養液培養的成纖維細胞則凋亡現象非常明顯，特別是對于來源于豬和小鼠的成纖維細胞而言，使用常規培養液比使用設計的新型培養液細胞凋亡現象增加10 50倍。對于用絲裂霉素處理的成纖維細胞而言，使用常規培養液比使用設計的新型培養液細胞凋亡現象在I周后也表現增加10 50倍，結果顯示設計的新型培養液使成纖維細胞具有較強的抗凋亡和抗衰老的能力。以上所述的本發明實施方式，并不構成對本發明保護范圍的限定。任何在本發明的精神和原則之內所作的修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的權利要求保護范圍之內。
權利要求
1.ー種成纖維細胞培養液，其特征在干由以下組分組成 10%月臺牛血清,4 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子,2. 5 μ g/ml Plasmocin, 100 U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素，高糖DMEM培養液補足到100%。
全文摘要
本發明公開了一種成纖維細胞培養液，由以下組分組成10％胎牛血清，4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子，2.5μg/mlPlasmocin，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，高糖DMEM培養液補足到100%。本發明設計的成纖維細胞培養液與常規的成纖維細胞培養液相比，能使成纖維細胞生長速度快，增殖能力強，培養的成纖維細胞具有典型的纖維狀形態，及具有更強的抗凋亡能力而不易衰老。因此，本發明設計的成纖維細胞培養液培養的成纖維細胞應用于生產實踐將會生產出更高質量和效率的細胞工程產品。
文檔編號C12N5/071GK102690782SQ20121019486
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月14日 優先權日2012年6月14日
發明者劉亞, 張運海, 方富貴, 曹鴻國, 李運生, 楊盼, 章孝榮, 蒲勇, 陶勇 申請人:安徽農業大學