原發(fā)性肥大性骨關(guān)節(jié)病致病基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及原發(fā)性肥大性骨關(guān)節(jié)病（PHO）的標(biāo)記物。更具體而言，本發(fā)明涉及原發(fā)性肥大性骨關(guān)節(jié)病（PHO）的基因標(biāo)記物及其用途，以及擴(kuò)增其的引物、檢測(cè)其的探針以及相關(guān)試劑盒。
【專利說(shuō)明】原發(fā)性肥大性骨關(guān)節(jié)病致病基因
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及原發(fā)性肥大性骨關(guān)節(jié)病(PHO)的標(biāo)記物。更具體而言，本發(fā)明涉及原發(fā)性肥大性骨關(guān)節(jié)病(PHO)的基因標(biāo)記物。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性肥大性骨關(guān)節(jié)病(primaryhypertrophic osteoarthropathy ；PH0),也稱作厚皮性骨膜病(pachydermoperiostosis ；PDP),是一種很少見的家族遺傳疾病，通常表現(xiàn)為:回狀頭皮增生、杵狀指、骨膜增厚和大關(guān)節(jié)痛，屬于常染色體遺傳病，嚴(yán)重影響患者的外觀，給患者造成巨大心理負(fù)擔(dān)。PHO通常為男性發(fā)病，女性較少發(fā)病(男女比例為7:1)[4，5]，目前我國(guó)所報(bào)道的32例病患均為男性。治療一般采用手術(shù)切除增生皮膚。PHO病因尚不清楚，多數(shù)人認(rèn)為本病為遺傳性疾病，但由于遺傳模式尚未清楚，發(fā)病率極低，且由于疾病表現(xiàn)嚴(yán)重導(dǎo)致家族性病例極罕見，因此對(duì)于該疾病的致病基因研究較為困難。國(guó)外早期的分子方面發(fā)病機(jī)制聚焦于前列腺素E2 (PGE2)的代謝途徑，PGE2是體內(nèi)普遍存在的脂類代謝物，其產(chǎn)物會(huì)擴(kuò)大炎癥區(qū)域，故而在體內(nèi)循環(huán)水平較低。研究發(fā)現(xiàn)了患者羥基前列腺素脫氫酶(HPGD)基因中負(fù)責(zé)編碼分解PGE2酶(15-PGDH)的部分發(fā)生了突變，導(dǎo)致了酶功能的喪失。并在患者和攜帶者尿液中發(fā)現(xiàn)了 PGE2含量的上升。
[0003]目前單基因疾病的研究開始大量采用外顯子組重測(cè)序的方法，最近，外顯子組測(cè)序(exome sequencing)被成功地應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)稀有單基因疾病的致病基因，如Freeman - Sheldon 綜合癥的 MYH3 基因，Schinzel-Giedion 綜合征的 SETBPl 基因，以及嚴(yán)重大腦畸形的 TOR62 突變等(Ng SB, Turner EH, Robertson PD, et al, Targetedcapture and massively parallel sequencing of 12 human exomes.Nature2009，461 (7261):272-276; A H, Bff vB, C G, et al, De novo mutations of SETBPl causeSchinzel-Giedion syndrome.D-9216904(-1546-1718(Electronic));Bilguvar K, OzturkAK, Louvi A, et al, ffhol e-exome sequencing identifies recessive WDR62mutations insevere brain malformations.Nature 2010, 467 (7312): 207-210.)。全外顯子測(cè)序技術(shù)已被證明為降低稀有單基因疾病候選基因甚至發(fā)現(xiàn)其致病基因的有力、有效手段，僅通過(guò)對(duì)幾個(gè)很少的個(gè)體(包括患者及正常對(duì)照)的全外顯子進(jìn)行測(cè)序來(lái)篩選與疾病相關(guān)的變異，其成功率大為提升。
[0004]本領(lǐng)域中急需找到PHO的致病基因，以及突變位點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本研究通過(guò)外顯子組測(cè)序的方法確定了 PHO的致病基因。
[0006]在第一方面，本發(fā)明涉及PHO的生物標(biāo)記物，即突變的SLC02A1基因或SLC02A1蛋白，所述生物標(biāo)記物是具有選自如下的突變的SLC02A1基因或SLC02A1蛋白:
[0007]在外顯子2 中移碼突變(c.121delC;p.L40Cfs*36)；
[0008]在外顯子13 中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)；[0009]在外顯子12 中錯(cuò)義突變(c.1681C>T;p.R560C)；
[0010]在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A;p.W146X)；
[0011]在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)；
[0012]在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A;p.A241Y)。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變的SLC02A1基因?yàn)镾EQ ID NO:1的序列中具有以下突變:
[0014]在外顯子2中移碼突變(c.121delC)；
[0015]在外顯子13中錯(cuò)義突變(c.1781G>A)；
[0016]在外顯子12中錯(cuò)義突變(c.16810T)；
[0017]在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A)；
[0018]在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A)；
[0019]在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A)。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變的SLC02A1蛋白為SEQ ID N0:2的序列中具有以下突變:
[0021]在外顯子2中移碼突變(p.L40Cfs*36)；
[0022]在外顯子13中錯(cuò)義突變 (p.C593Y)；
[0023]在外顯子12中錯(cuò)義突變(p.R560C)；
[0024]在外顯子4中錯(cuò)義突變(p.W146X)；
[0025]在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(p.R343H)；
[0026]在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(p.A241Y)。
[0027]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變的SLC02A1蛋白為SEQ ID NO:2的序列中具有外顯子2中移碼突變(p.L40Cfs*36)，在一個(gè)具體實(shí)例中，所述突變的SLC02A1蛋白的序列是 SEQID NO:31。
[0028]在第二方面，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)PHO的方法，所述方法包括檢測(cè)受試者的SLC02A1基因或SLC02A1蛋白中是否存在突變位點(diǎn)，如果有突變位點(diǎn)，則所述受試者被鑒定為患有PHO或易患ΡΗ0,所述突變位點(diǎn)選自如下任一種或其組合:
[0029]在外顯子2 中移碼突變(c.121delC;p.L40036)；
[0030]在外顯子13 中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)；
[0031]在外顯子12 中錯(cuò)義突變(c.1681C>T;p.R560C)；
[0032]在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A; p.W146X)；
[0033]在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)；
[0034]在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A;p.A241Y)。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，SLC02A1蛋白為SEQ ID NO:2的序列表示。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，SLC02A1基因?yàn)镾EQ ID NO:1的序列表示。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的檢測(cè)PHO的方法包括如下至少一組引物擴(kuò)增的步驟:
[0038]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0039]SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 ；
[0040]SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 ；[0041]SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:16 ；
[0042]SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24 ；
[0043]SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的檢測(cè)PHO的方法中檢測(cè)突變位點(diǎn)通過(guò)選自如下的技術(shù)進(jìn)行:測(cè)序、電泳、核酸雜交、原位雜交、PCR、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈反應(yīng)和變性高效液相色譜。
[0045]在第三方面，本發(fā)明涉及通過(guò)PCR檢測(cè)SLC02A1基因或SLC02A1蛋白突變中使用的引物對(duì)，所述突變是選自如下任一種或其組合:
[0046]在外顯子2 中移碼突變(c.121delC;p.L40036)；
[0047]在外顯子13 中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)；
[0048]在外顯子12 中錯(cuò)義突變(c.1681C>T;p.R560C)；
[0049]在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A; p.W146X)；
[0050]在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)；
[0051]在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A;p.A241Y)，
[0052]其中所述引物對(duì)分別基于選自如下的位置前后設(shè)計(jì)，使得擴(kuò)增該位置(編號(hào)基于SLC02A1的cDNA序列，724+1表示cDNA序列的724位之后在基因組DNA中是內(nèi)含子序列，該內(nèi)含子序列的第一位發(fā)生突變，940+1與之類似):121、1781、1681、440、940+1和724+1。
[0053]在第四方面，本發(fā)明涉及與突變SLC02A1基因互補(bǔ)的核酸探針，所述突變是選自如下任一種或其組合:
[0054]在外顯子2 中移碼突變(c.121delC;p.L40036)；
[0055]在外顯子13 中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)；
[0056]在外顯子12 中錯(cuò)義突變(c.1681C>T;p.R560C)；
[0057]在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A; p.W146X)；
[0058]在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)；
[0059]在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A;p.A241Y)，
[0060]所述探針與突變SLC02A1基因的互補(bǔ)區(qū)包括選自如下的位置(編號(hào)基于SLC02A1的cDNA序列，724+1表示cDNA序列的724位之后在基因組DNA中是內(nèi)含子序列，該內(nèi)含子序列的第一位發(fā)生突變，940+1與之類似):121、1781、1681、440、940+1和724+1。
[0061]在第五方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)突變SLC02A1基因或SLC02A1蛋白的試劑盒，包含一組或多組引物對(duì)，其中所述突變是選自如下任一種或其組合:
[0062]在外顯子2 中移碼突變(c.121delC;p.L40036)；
[0063]在外顯子13 中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)；
[0064]在外顯子12 中錯(cuò)義突變(c.1681C>T;p.R560C)；
[0065]在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A; p.W146X)；
[0066]在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)；
[0067]在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A;p.A241Y)，
[0068]其中所述引物對(duì)分別基于選自如下的位置前后設(shè)計(jì)，使得其擴(kuò)增產(chǎn)物涵蓋該位置(編號(hào)基于SLC02A1的cDNA序列，724+1表示cDNA序列的724位之后在基因組DNA中是內(nèi)含子序列，該內(nèi)含子序列的第一位發(fā)生突變，940+1與之類似):121、1781、1681、440、940+1和 724+1。[0069]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測(cè)突變SLC02A1基因或SLC02A1蛋白的試劑盒包含選自如下的至少一組引物:
[0070]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0071]SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 ；
[0072]SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 ；
[0073]SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 ；
[0074]SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24 ；
[0075]SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26。
[0076]在第六方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)突變SLC02A1基因的試劑盒，包含一個(gè)或多個(gè)核酸探針，所述突變是選自如下任一種或其組合:
[0077]在外顯子2 中移碼突變(c.121delC;p.L40036)；
[0078]在外顯子13 中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)；
[0079]在外顯子12 中錯(cuò)義突變(c.1681C>T;p.R560C)；
[0080]在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A; p.W146X)；
[0081]在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)；
[0082]在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A;p.A241Y)，
[0083]所述探針與突變SLC02A1基因上包含選自如下的位置的區(qū)域互補(bǔ)(編號(hào)基于SLC02A1的cDNA序列，724+1表示cDNA序列的724位之后在基因組DNA中是內(nèi)含子序列，該內(nèi)含子序列的第一位發(fā)生突變，940+1與之類似):121、1781、1681、440、940+1和724+1。
[0084]該研究將為PHO的發(fā)病機(jī)制研究奠定重要基礎(chǔ)，有可能為PHO的患者治療提供全新的理論依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0085]在本發(fā)明中，采用本領(lǐng)域通用表示法表示突變。例如，突變(c.1781G>A;p.C593Y)中，c表示cDNA，p表示蛋白質(zhì)，DNA水平的突變對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)水平的突變；移碼突變(c.121delC;p.L40Cfs*36)中，c.121delC 表示 DNA 水平第 121 位缺失 C，p.L40Cfs*36 表示從40位起算的36個(gè)氨基酸的移碼，形成的突變蛋白質(zhì)僅有75個(gè)氨基酸，如SEQ ID N0:31中所示；在錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)中，c.940+1表示c.940后面是內(nèi)含子，+1表示該內(nèi)含子的第I位，這位的G突變?yōu)锳 ;同理在突變(c.724+lG>A;p.A241Y)中，c.724+lG>A表示c.724后面是內(nèi)含子，+1表示該內(nèi)含子的第I位,這位的G突變?yōu)锳。
[0086]野生型SLC02A1基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，其中
[0087]外顯子1:為1-96 ;外顯子2:為97-234 ;外顯子3:為235-397 ;外顯子4:為398-625 ;外顯子5:為626-724 ;外顯子6:為725-861 ;外顯子7:為862-940 ;外顯子8:為941-1105 ;外顯子 9:為 1106-1295 ;外顯子 10:為 1296-1461 ;外顯子 11:為 1462-1625 ;外顯子12:為1626-1690 ;外顯子13:為1691-1814 ;外顯子14:為1815-1932。其中外顯子5后的內(nèi)含子第I位和外顯子7后的內(nèi)含子第I位是G (在本發(fā)明中該位置分別以724+1和940+1表示)，該突變影響剪接，從而使得剪接后的蛋白序列分別發(fā)生A241Y和R343H突變。
[0088]SEQ ID NO:2:野生型SLC02A1蛋白的氨基酸序列。
[0089]對(duì)于本發(fā)明說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，提及基因序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)際包括互補(bǔ)雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，雖然多數(shù)情況下只給出了一條鏈，但實(shí)際上也公開了與之互補(bǔ)的另一條鏈。例如提及SLC02A1基因的cDNA序列，實(shí)際上包括該序列以及其互補(bǔ)序列。例如，提及SEQ ID NO: 1，實(shí)際包括其互補(bǔ)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測(cè)另一條鏈，反之亦然。
[0090]本申請(qǐng)中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公開其中一種，意味著另一種也被公開。例如提及SLC02A1基因的cDNA序列，實(shí)際也包括相應(yīng)的RNA序列。
[0091 ] 實(shí)施例1確定PHO的致病基因。
[0092]發(fā)明人近幾年在國(guó)內(nèi)收集到5例PHO病例，所有患者均表現(xiàn)出回狀頭皮增生、易出油出汗、杵狀指、X光片檢測(cè)表明長(zhǎng)骨骨膜增厚等典型的PHO疾病特征。
[0093]發(fā)明人對(duì)其中患有PHO的兩兄弟(在表1中編號(hào)Pl和P2)和其父母的外顯子組序列進(jìn)行了測(cè)序。具體步驟如下:
[0094]樣品制備:采集所述兩PHO患者及其父母家人外周血，利用試劑盒抽提外周血白細(xì)胞中的基因組 DNA (RelaxGene Blood DNA System DP319-02.TIANGEN, China)，利用NanoDrop 2000測(cè)量DNA的濃度及純度(Thermo Scientif ic, USA),所得的每個(gè)標(biāo)本基因組DNA的0D260/0D280均位于1.7-2.0之間，濃度不少于100ng/ul，總量不少于30 μ L.[0095]然后，對(duì)上述四個(gè)樣本的外顯子組序列進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq2000,依照 Illumina/Solexa 標(biāo)準(zhǔn)建庫(kù)說(shuō)明書(參見 http://www.1llumina.com/)進(jìn)行測(cè)序，簡(jiǎn)述如下:
[0096]I)將基因組DNA隨機(jī)打斷成200_300bp左右的片段，隨后在片段兩端分別連接上接頭制備雜交文庫(kù)；
[0097]2)文庫(kù)經(jīng)純化后經(jīng)過(guò)連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCR(LM-PCR)的線性擴(kuò)增與生物素標(biāo)記的DNA文庫(kù)進(jìn)行雜交富集，再經(jīng)過(guò)L M-PCR的線性擴(kuò)增后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序,讀取長(zhǎng)度為90bp，每個(gè)樣本的平均測(cè)序深度最少為50 ；
[0098]3)測(cè)序后獲得的原始測(cè)序片段(reads)由 Illumina basecalling SoftwareI.7 進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)過(guò)濾去污染、使用 SOAPaligner 2.20 (Li R, Li Y, KristiansenK，et al，SOAP: short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics2008，24 (5): 713-714 ;Li R，Yu C，Li Y，et al，S0AP2:an improved ultrafast tool forshort read alignment.Bioinformatics 2009，25 (15): 1966-1967)比對(duì)參考基因組，獲得比對(duì)到基因組上的唯一匹配測(cè)序片段。靶區(qū)域的基因型由S0APsnp(Li R，Li Y, Fang X，YangH，et al，SNP detection for massively p arallel whole-genome resequencing.GenomeRes 2009，19(6):1124-1132)確定。
[0099]結(jié)果，在這些樣本中分別發(fā)現(xiàn):父親有84841個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和7168處的插入/缺失；母親有83064個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和7149處的插入/缺失；患者Pl有83547個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和7160處的插入/缺失；患者P2有82499個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和7109處的插入/缺失。
[0100]隨后，對(duì)結(jié)果通過(guò)四個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(dbSNP(vl31): http: //hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hgl9/database/snpl31.txt.gz.； 1000 人:ftp://ftp.1OOOgenomes.eb1.ac.uk/voll/ftp或ftp://ftp_trace.ncb1.nih.gov/1000genomes/ftp ；hapmap:ftp://ftp.ncb1.nlm.nih.gov/hapmap ； 以及 YH 數(shù)據(jù) 庫(kù):http://yh.genomics, org.cn)進(jìn)行過(guò)濾,去掉所有已知的且在數(shù)據(jù)庫(kù)中等位基因頻率大于0.005的變異。
[0101]發(fā)現(xiàn)兩患者在基因SLC02A1上都同時(shí)具有兩個(gè)符合共分離的雜合突變點(diǎn):在外顯子2中移碼突變(c.121delC;p.L40C);在外顯子13中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)。通過(guò)家族中2名患者和13位正常人SNP篩查共分離，這個(gè)位點(diǎn)可能是致病位點(diǎn)。
[0102]結(jié)果顯示于表1。SLC02A1負(fù)責(zé)編碼前列腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一個(gè)擁有12次跨膜結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)運(yùn)子超家族成員。具有14個(gè)外顯子。能夠轉(zhuǎn)運(yùn)P⑶2、PGEl、PGE2、PGF2a和PGH2。
[0103]因此，發(fā)明人認(rèn)為SLC02A1基因極有可能為PHO的致病基因。
[0104]實(shí)施例2在其他病例中確認(rèn)上述PHO的致病基因。
[0105]接著，發(fā)明人納入其它PHO患者，對(duì)SLC02A1基因?yàn)镻HO的致病基因進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證中利用sanger法測(cè)序驗(yàn)證SLC02A1基因的突變，其中考慮了家系內(nèi)、家系外、散發(fā)等樣本驗(yàn)證情況。
[0106]分別對(duì)5名患者、20名家系內(nèi)正常人(即該5例患者的父母，他們均未發(fā)病)和384名家系外正常人(即與表2中所有患者無(wú)血緣關(guān)系的對(duì)照)基因進(jìn)行檢測(cè)，針對(duì)SL0C02A1基因所有外顯子序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，測(cè)序的方法獲得有關(guān)序列，根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果屬于突變型還是野生型，驗(yàn)證SLC02A1與PHO疾病之間相關(guān)性。
[0107]具體方法步驟如下:`[0108]1.DNA 提取:
[0109]分別采取5名家系內(nèi)患者、20名家系內(nèi)正常人和384名家系外正常人外周靜脈血按照實(shí)施例1的方法提取基因組DNA和測(cè)定DNA含量。
[0110]2.引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)
[0111]引物設(shè)計(jì)參考人類基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)hgl9/build36.3，具體見下。
[0112]a)引物序列:
[0113]
【權(quán)利要求】
1.一種具有選自如下的突變的SLC02A1基因或SLC02A1蛋白: 在外顯子2中移碼突變(c.121delC;p.L40Cfs*36)； 在外顯子13中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)； 在外顯子12中錯(cuò)義突變(c.1681C>T;p.R560C)； 在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A;p.W146X)； 在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)； 在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A;p.A241Y)。
2.權(quán)利要求1的SLC02A1基因，為SEQID NO:1的序列中具有以下突變: 在外顯子2中移碼突變(c.121delC)； 在外顯子13中錯(cuò)義突變(c.1781G>A)； 在外顯子12中錯(cuò)義突變(c.16810T)； 在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A)； 在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A)； 在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A)。
3.權(quán)利要求1的SLC02A1蛋白，為SEQID NO:2的序列中具有以下突變: 在外顯子2中移碼突變(p.L40Cfs*36)； 在外顯子13中錯(cuò)義突變(p.C593Y)； 在外顯子12中錯(cuò)義突變(p.R560C)； 在外顯子4中錯(cuò)義突變(p.W146X)； 在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(P.R343H)； 在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(p.A241Y)。
4.一種檢測(cè)PHO的方法，所述方法包括檢測(cè)受試者的SLC02A1基因或SLC02A1蛋白中是否存在突變位點(diǎn)，如果有突變位點(diǎn)，則所述受試者被鑒定為患有PHO或易患ΡΗ0，所述突變位點(diǎn)選自如下任一種或其組合: 在外顯子2中移碼突變(c.121delC;p.L40036)； 在外顯子13中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)； 在外顯子12中錯(cuò)義突變(c.1681C>T;p.R560C)； 在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A;p.W146X)； 在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)； 在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A;p.A241Y)。
5.權(quán)利要求4的方法，包括如下至少一組引物擴(kuò)增的步驟:
SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 ；
SEQ ID NO:11 和 SEQ ID NO:12 ；
SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:16 ；
SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24 ；
SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26。
6.檢測(cè)SLC02A1基因或SLC02A1蛋白突變中使用的引物對(duì)，所述突變是選自如下任一種或其組合:在外顯子2中移碼突變(c.121delC;p.L40036)； 在外顯子13中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)； 在外顯子12中錯(cuò)義突變(c.1681C>T;p.R560C)； 在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A;p.W146X)； 在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)； 在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A;p.A241Y)， 其中所述引物對(duì)分別基于如下的位置前后設(shè)計(jì)，使得擴(kuò)增該位置:121、1781、1681、`440,940+1 和 724+1。
7.與突變SLC02A1基因互補(bǔ)的核酸探針，所述突變是選自如下任一種或其組合: 在外顯子2中移碼突變(c.121delC;p.L40036)； 在外顯子13中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)； 在外顯子12中錯(cuò)義突變(c.1681C>T;p.R560C)； 在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A;p.W146X)； 在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)； 在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A;p.A241Y)，` 所述探針與突變SLC02A1基因的互補(bǔ)區(qū)包括選自如下的位置:121、1781、1681、440、940+1 和 724+1。
8.檢測(cè)突變SLC02A1基因或SLC02A1蛋白的試劑盒，包含一組或多組引物對(duì)，其中所述突變是選自如下任一種或其組合: 在外顯子2中移碼突變(c.121delC;p.L40036)； 在外顯子13中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)； 在外顯子12中錯(cuò)義突變(c.1681C>T;p.R560C)； 在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A;p.W146X)； 在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)； 在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A;p.A241Y)， 其中所述引物對(duì)分別基于選自如下的位置前后設(shè)計(jì)，使得其擴(kuò)增產(chǎn)物涵蓋該位置:121、1781、1681、440、940+1 和 724+1。
9.權(quán)利要求8的試劑盒，包含選自如下的至少一組引物:
SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 ；
SEQ ID NO:11 和 SEQ ID NO:12 ；
SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:16 ；
SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24 ；
SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26。
10.檢測(cè)突變SLC02A1基因的試劑盒，包含一個(gè)或多個(gè)核酸探針，所述突變是選自如下任一種或其組合: 在外顯子2中移碼突變(c.121delC;p.L40036)； 在外顯子13中錯(cuò)義突變(c.1781G>A;p.C593Y)； 在外顯子12中錯(cuò)義突變(c.1681C>T;p.R560C)；在外顯子4中錯(cuò)義突變(c.440G>A;p.W146X)； 在外顯子7-8剪接中錯(cuò)義突變(c.940+lG>A;p.R343H)； 在外顯子5-6剪接中錯(cuò)義突變(c.724+lG>A;p.A241Y)， 所述探針與突變SLC02A1基因上包含選自如下的位置的區(qū)域互補(bǔ):121、1781、1681、440,940+1和 724+1。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103509799SQ201210201545
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月18日
【發(fā)明者】吳元明, 吳丹, 孫茂, 王國(guó)霞, 戴梅枝, 王俊, 汪建, 楊煥明 申請(qǐng)人:深圳華大基因科技有限公司, 第四軍醫(yī)大學(xué)法醫(yī)物證司法鑒定所