一種岷江百合谷胱甘肽S-轉移酶基因LrGSTU3及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種具有抗真菌活性的岷江百合谷胱甘肽S-轉移酶基因LrGSTU3及其應用，LrGSTU3基因具有SEQIDNO：1所述的核苷酸序列，編碼tau類谷胱甘肽S-轉移酶；本發明通過功能基因組學相關技術研究證實LrGSTU3基因具有提高植物抗真菌能力的功能。將本發明抗真菌LrGSTU3基因構建到植物表達載體上并轉入煙草中過量表達，轉基因煙草植株具有很強的體外抗真菌活性。LrGSTU3超表達轉基因煙草對灰葡萄孢以及尖孢鐮刀菌的生長具有明顯的抑制作用。
【專利說明】—種岷江百合谷胱甘肽S-轉移酶基因LrGSTU3及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學以及基因工程相關技術研究領域，特別是一種具有抗真菌活性的岷江百合谷胱甘肽S-轉移酶基因LrGSTU3及應用。
【背景技術】
[0002]植物在生長過程中經常會遭受各種各樣的生物和非生物脅迫，例如，真菌、病毒以及干旱、重金屬、極端溫度、化學毒害等等。其中最嚴重、發病率最高的就是真菌病害，真菌病害在大規模發生時會致使農作物減產甚至死亡。而對于真菌病害的防治普遍使用的是化學農藥，同時還有耕作制度改良和依靠傳統育種方法培育的抗性植物品種。但是傳統育種方法周期長，化學農藥的大量使用會污染環境甚至在農產品中產生大量的化學農藥殘留進而危害人畜健康。因此快速高效地培育新的抗病性強的植物品種已迫在眉睫。隨著重組DNA技術的創立和快速發展，利用基因工程技術來培育新的植物品種以應對真菌病害已取得初步成效，有望從根本上解決真菌病害問題。
[0003]真菌病原菌在侵染植物的同時會向植物細胞分泌一些有毒的效應分子以增強其在宿主細胞內的適應性，而這些效應分子同時也作為效應物激活植物體防衛反應中的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern, P AMP)激發的免疫反應(PAMP-triggered immunity, PTI),使植物體產生對病原菌的廣譜抗性反應，如氧爆發(Jones JDG, Dangl JL.The plant immune system.Nature, 2006, 444:323~329)。氧爆發是指植物體在受到外界相應的脅迫時會在體內產生大量的活性氧(reactive oxygen speci es, R0S),這種應激反應能提高植物的抗病性。然而，ROS還可以與植物體細胞內的蛋白質、脂質以及DNA反應，弓丨起植物體內金屬酶類活性降低、細胞膜滲透性改變等一系列的不利影響。植物體在長期的進化過程中形成了一系列有效的活性氧清除機制，包括非酶促反應和酶促反應兩類(Hayes JD, Strange RC.GlutathioneS-transferase polymorphisms and their biological consequences.Pharmacology,2000，61: 154^166) ?非酶保護機制中直接參與活性氧清除的物質有抗壞血酸、谷胱甘肽α-生育酚、黃酮、類胡蘿卜素等。酶促反應中所涉及到的抗氧化酶類主要有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)、谷胱甘妝硫-轉移酶((glutathione S-transferase,GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)等。其中GST不僅可以清除體內的活性氧，還可以催化內源或者外源的有毒有害物質的親電子基團與還原型谷胱甘肽(GSH)的巰基結合并形成更容易溶于水的、無毒或弱毒的衍生物，從而避免蛋白、核酸等生物大分子受到損害(馮雪，王彬，孫艷香.谷胱甘肽硫轉移酶的研究進展.生物學教學，2012，37: 5~6)。
[0004]GST廣泛存在于真核生物的細胞溶質中，少數位于細胞的液泡等部位。GST—般由兩條25-27 KDa的亞基以同源或者異源的方式聚合而成，等電點一般為pH 4_5。GSTs的蛋白質空間結構都是類似的，每個亞基都含有C端和N端兩個空間結構不同的基本結構域，C端結構域一般是由4-7個α-螺旋組成，N端結構域則是由β-折疊和α-螺旋以β α β α β β α的順序構成，并且通過一個約10個氨基酸的片段與C端結構域連接在一起。此外，每個亞基上都有兩個配體結合位點:一個位于N端的GSH特異結合位點(G位點)，在此位點中有一個保守的絲氨酸/酪氨酸殘基，其羥基可驅動GST的結合、以及與過氧化酶和異構化酶的反應；另一個位于C端的結合疏水底物的位點(H位點)，該位點的結構可變性較大，主要由羧基端的非極性側鏈殘基組成(馮雪，王彬，孫艷香.谷胱甘肽硫轉移酶的研究進展.生物學教學，2012，37: 5飛)。早期，根據序列同源性以及基因的組織特異性將植物體內的GST分為phi, tau, zeta和theta四類,其中phi和tau類較大，另外兩類較小。Phi和tau類的GST只存在于植物體內，其主要作用就是參與植物體內除草劑的清除，同時這兩類GST可能也在植物體內的一些新陳代謝過程中發揮作用，例如作為谷胱甘肽過氧化物酶類清除植物體內過多的活性氧，也可以作為類黃酮結合蛋白，脅迫信號分子以及細胞凋亡調控子等等(Dixon DP, Davis BG, Edwards R.FunctionalDivergence in the Glutathione Transferase Superfamily in Plants identificationof two classes with putative functions in redox homeostasis in ArabidopsisthaIiana.The Journal of Biological Chemistry, 2002，277: 30859~30869.)。與之相對，較小的兩類GST蛋白，zeta和theta類,在動物和真菌中均有發現,這也就是表明這兩類GST蛋白在真核生物體內擁有保守而穩定的生物學功能。在谷胱甘肽存在的情況下，zeta和theta類GST蛋白參與調控酪氨酸分解代謝中的重要過程，即催化馬來酰乙酰乙酸異構化形成延胡索酰乙酰乙酸(Thom R, Dixon DP, Edwards R, Cole DJ, LapthornAJ.The structure of a zeta class glutathione ^-transferase from ArabidopsisthaIiana..characterisation of a GST with novel active-site architecture and aputative role in tyrosine catabolism.Journal of Molecular Biology, 2001， 308:94擴962.)。此外，Theta類GST蛋白還可以作為谷胱甘肽過氧化酶清除植物氧脅迫應激反應中形成的氫過氧化物。此后，Dixon等人又發現了兩種新的GST蛋白，即脫氫抗壞血酸還原酶和lambda類的GST 蛋白。這兩類GST蛋白同樣擁有GSH結合位點，只是其中的關鍵氨基酸，絲氨酸被半胱氨酸所替代，由于半胱氨酸沒有絲氨酸所具有的催化作用而使蛋白的功能有所改變。脫氫抗壞血酸還原酶與水稻中的脫氫抗壞血酸還原酶的功能類似。而lambda類的GST蛋白不能起到谷胱甘肽脫氫酶的作用，但可以作為依賴于GSH的巰基轉移酶來發揮作用(Dixon DP, Davis BG, Edwards R.Functional Divergence in the GlutathioneTransferase Superfamily in Plants.The Journal of Biological Chemistry, 2002,277: 30859~30869)。
[0005]在不同植物體內的不同部位GST的表達情況有所不同，例如OsGSTZI和0sGSTZ2在水稻葉中的表達量明顯高于根。玉米和在根內的表達多于地上部分，而只在根中表達，從南瓜花中純化得到的phi類GST-Pugf蛋白在南瓜葉柄、莖、根和花內都有較高的含量，而且在幼嫩器官比成熟器官中豐富(宋新華.植物體內的多功能蛋白酶——谷胱甘肽轉移酶.山東科學，2007，20: 49飛5)。一些GSTs基因家族成員的表達受病原菌的調控，玉米GSTs含量的增高總是伴隨著植株對強致病菌Cochliobolusheterostrophus, Cercospora zeae~maydis, C.zeina 取 Setosphaeria 乙tfrc 抗性白勺增強(Wisser RJ, Kolkman JM, Patzoldt ME, Holland JB, Yu J, Krakowsky M, NelsonRJ, Balint-Kurti PJ.Multivariate analysis of maize disease resistancessuggests a pleiotropic genetic basis and implicates a GST gene.Proceedingsof the National Academy of Sciences, 2011, 108: 7339~7344.)。^Phytophthorainfestans接種后2小時，馬鈴薯{Solanum tuberosum)中抗病相關的GST基因的表達明顯受到誘導，而且在接種后48-56h內表達量達到最大，馬鈴薯對A infestans引起的晚疫病的抗性增強來源于/^—/77-7表達量的增加(Taylor JL, Fritzemeier KH,Hauser I, Kombrink E, Rohwer F， Schroder M, Strittmatter G, Hahlbrock K.Structural analysis and activation by fungal infection of a gene encoding apathogenesis-related protein in potat0.Molecular Plant-Microbe Interact,1990, 3: 72~77; Hammond-Kosack KE, Jones JD.Resistance gene-dependentplant defense responses.The Plant Cell, 1996, 8: 1773~1791)。Peronosporaparasitica 接種擬南芥(Arabidopsis thaliana)后，擬南芥中 phi, tau 和 zeta 類 GST 的表達量都明顯增加(Wagner U, Edwards R, Dixon DP, Mauch F.Probing the diversityof the Arabidopsis glutathione S-transferase gene family.Plant MolecularBiology, 2002, 49: 515~532.)。總的來說，目前認為GST增強植株對病原菌的抗性主要是有兩方面的原因，一方面是因為GST可以清除病原菌釋放的有毒效應分子，減少病原菌對植株的直接傷害，另一方面是因為GST可以清除病原菌侵染后植物體內產生的過多的 ROS,減少超敏反應所造成的損傷(Herncindez I, Chacon O, Rodriguez R, PortielesR, Lopez Y, Pujol M, Borras-Hidalgo 0.Black shank resistant tobacco bysilencing of glutathione S-transferase.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications, 2009, 387: 300~304)。
[0006]本發明中GST基因LrGSTU3來自岷江百合{Li Iium regale Wilson)。岷江百合又名王百合，多年生 草本植物，我國的百合特有種。僅分布于四川西岷江流域海拔800~2700m的河谷到山腰的巖石縫中，具有極強的抗病性。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種從岷江百合中克隆獲得具有抗真菌活性的谷胱甘肽S-轉移酶的全長基因LrGSTU3,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，該基因全長為828bp，包含一個720bp的開放閱讀框、16bp的5’UTR&92bp的3’UTR，編碼如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白質。
[0008]本發明所述谷胱甘肽S-轉移酶基因LrGSTU3的編碼區是序列表SEQ ID NO:1中第17-736位所示的核苷酸序列。
[0009]本發明分離克隆岷江百合的一個抗真菌相關基因的完整cDNA片段，通過根癌農桿菌iAgrobacterium tumefaciens)介導將目的基因轉入受體植物中過量表達,并通過進一步實驗驗證該基因是否具有抗真菌的活性，為后期利用該基因改良煙草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基礎。發明人將這個基因命名為LrGSTU3。
[0010]在植物體受到病原菌的侵害時，體內GST的含量會迅速增加。GST可以催化還原型谷胱甘肽的巰基與有毒物質的親電子基團結合，形成弱毒或者無毒的共軛物，在清除過氧化物的同時清除病原菌向細胞內分泌的有毒效應分子，從而增強植物體對病原菌的抗性。[0011]本發明涉及分離包含的DNA片段并鑒定其功能，具有該基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌侵襲的表型。其中所述DNA片段如序列表SEQ ID N0:1所示，對該基因進行分析，表明LrGSTU3全長cDNA為828bp，包含一個720bp的開放閱讀框、16bp的5’UTR及92bp的3’UTR，其中ORF編碼一個具有239個氨基酸的蛋白質。LrGSTU3編碼蛋白具有tau類GST蛋白的特征結構域，G位點和H位點。BLASTp檢索結果表明編碼的蛋白質與蓖麻iRicinus communis) GST蛋白的相似性為57%,與來自黑楊ipopulustrichocarpa)、馬鈴薯{Solanum tuberosum)、柿子{Piospyros kaki)、風信子(Byacinthusorien tails)等物種的GST蛋白也都具有一定的同源性，這就表明其屬于岷江百合中的GST蛋白。超表達序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列蛋白質可以增強煙草對灰葡萄孢和尖孢鐮刀菌兩種真菌的抗性。
[0012]上述ZrMTK?基因可以應用于提高煙草的抗真菌特性，具體操作如下:
(I)采用擴增ZrMTK?的特異引物，從接種尖孢鐮刀菌后的岷江百合根中提取總RNA，通過逆轉錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)擴增出LrGSTU3的全長編碼區，然后將其連接到pMD_18T載體上，經測序獲得具有目的基因的克隆。
[0013](2)用限制性內切酶和&ORI酶切pMD18-T-ZrM7K?載體和植物表達載體PCAMBIA2300S，通過膠回收得到目的基因片段和載體大片段。再將所獲得基因片段與pCAMBIA2300S載體片段連接，構建植物超表達載體，之后將所構建的重組載體通過根癌農桿菌介導轉入煙草中表達。
[0014](3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉化子，并通過PCR以及RT-PCR檢測得到真正的轉基因植株，分析轉基因植株對于病原真菌侵染的抗性，最后篩選出對真菌抗性明顯增強的轉基因植株。
[0015]本發明為提高植物對真菌病害的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培育抗病植物可以克服傳統育種的不足，不僅育種周期縮短，而且操作簡單，容易獲得高抗材料。本發明中來自岷江百合的LrGSTU3基因能增強植物對真菌的抗性，將該基因導入煙草中，可以產生具有真菌抗性的新品種和新材料。利用基因工程技術培育抗性植物品種和材料具有明顯的優勢和不可取代的重要性。它不僅可以為大規模生產作物、花卉等提供方便，減少化學農藥的使用，還可以為農業生產節約成本、減少環境污染，因此本發明具有廣闊的市場應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是本發明中部分ZrMTK?轉基因煙草基因組DNA的PCR檢測結果，其中Marker:DL2000 DNA Marker (大連寶生物)，由 2，OOObpU, 000bp、750bp、500bp、250bp 以及IOObp六條DNA片段組成；正對照:質粒pMD18-T-ZrM7K?為模板的PCR反應；WT:非轉基因煙草(野生型)總DNA為模板進行的PCR ；
圖2是本發明中部分陽性轉基因煙草中LrGSTU3轉錄水平的表達分析結果圖；其中Marker:DL2000 DNA Marker (大連寶生物)；WT:非轉基因煙草總RNA逆轉錄cDNA為模板的PCR產物；正對照:質粒pMD18-T- ZrMTK?為模板的PCR產物；
圖3是本發明中轉基因煙草體外抗真菌活性的抑菌效果圖，其中圖a、b中接種的真菌分別是灰葡萄孢和尖孢鐮刀菌;WT為野生型煙草的總蛋白；CK為空白對照，即無蛋白對照(用于提取蛋白的緩沖液)。
【具體實施方式】
[0017]下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明的內容并不局限于此，本實施例中方法如無特殊說明的均按常規方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規試劑或按常規方法配置的試劑。
[0018]實施例1: LrGSTU3全長cDNA克隆以及序列分析
用尖孢鐮刀菌接種岷江百合，用接種12 h后的根提取總RNA。用液氮將處理過的岷江百合的根研磨成粉末，然后轉入離心管中，采用異硫氰酸胍法提取總RNA。采用逆轉錄酶M-MLV (promega)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應體系和操作過程為:取5 μ gtotal RNA，依次加入 50 ng oligo (dT)，2 μ L dNTP Mix (2.5mM each)，加 DEPC 水將反應體積補齊至14.5 μ L ;混勻后，70°C加熱變性5 min后迅速在冰上冷卻5 min，然后依次加入 4 yL 5XFirst-stand buffer,0.5 μ L RNasin (200U)、1 μ L M-MLV (200U)，混勻并簡短離心，421:溫浴1.5 h，取出后70°C加熱10 min，終止反應。cDNA第一鏈合成后置于-20°C保存備用 。
[0019]以合成的第一鏈cDNA為模板，擴增目的基因ZrMTK?，所用上下游引物序列分別為 5，GGTCACTCGAAATGAAATCAATGG3，及 5，TTCTCTCAACATAGCGTGCGAA3，。采用 Advantage?2 PCR Enzyme (Clontech)擴增出目的基因。PCR 反應條件:95°C I min ；95°C 30 s，61°C30 s，72°C Imin s，32 個循環；72°C 2 min。反應體系(20 μ L)為 I μ L cDNA、2 μ LIOXAdvantage 2 PCR BufferU.8 μ L dNTP Mix (IOmM each) ,0.2 μ L 正向引物(10μ Μ) >0.2 μ L 反向引物(10 μ Μ) >0.2 μ L Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.6 μ LPCR-Grade water 0 PCR結束后，取8 μ L進行瓊脂糖凝膠電泳，用以檢測擴增產物的特異性以及大小。
[0020]所得到PCR產物只有一條DNA帶，故直接對PCR產物進行TA克隆，使用的試劑盒為PMD18-T vector kit (大連寶生物)，反應體系和操作過程為:取1.5 μ L PCR產物，依次加入 I U L pMD18_T vector (50 ng/μ L)和 2.5 μ L 2XLigation solution I,混勻后置于16°C過夜反應。通過熱激轉化法將連接產物轉入大腸桿菌DH5ci感受態中，用含有氨節青霉素(ampicillin, Amp)的LB固體培養基篩選陽性克隆,挑選若干個單菌落,搖菌后用擴增LrGSTU3的特異引物檢測多克隆位點插入LrGSTU3的克隆。將得到的陽性克隆進行測序，最終獲得的 LrGSTU3 全長 cDNA 為 828bp，通過 NCBI ORF finder (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析發現其包含一個720bp的開放讀碼框(見序列表)編碼一個含239個氨基酸的蛋白質LrGSTU3，其分子量約為26.8 KDa，等電點為7.02。借助生物信息學軟件SignalP 4.1分析ZrMTK?編碼的蛋白序列，檢測其是否具有N端信號肽，結果顯示在中沒有檢測到信號肽的存在，這就表明LrGSTU3是一種非分泌蛋白。
[0021]實施例2:植物超表達載體構建
采用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(上海生工)提取插入ZrMTK?的大腸桿菌質粒pMD18-T-ZrM7K?以及植物表達載體pCAMBIA2300S質粒，取I μ L用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測所提取質粒的完整性及濃度高低。用限制性內切酶&0RI (TaKaRa)和(TaKaRa)分別對質粒pMD18-T-ZrM7K?和pCAMBIA2300S進行雙酶切(100 μ L體系)，反應體系和操作過程為:分別取20 μ L pMD18-T-ZrM7K?和pCAMBIA2300S質粒、依次加入10μ L IOXK buffer,5 μ L BcoRI,5 μ L Barnm.m μ L ddH20，混勻后短時離心，置于 37°C過夜反應。將所有酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，然后使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)%LrGSTU3片段和pCAMBIA2300s載體大片段分別進行膠回收。取I μ L回收產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段的大小以及濃度，置于_20°C保存備用。
[0022]利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，將回收的 LrGSTLL3mk 片段和 pCAMBIA2300S 載體片段連接起來，反應體系(20 μ L)和操作過程為:取10 UL LrGSTU3mk片段依次加入2μ L pCAMBIA2300S 載體 DNA、2 μ L 10ΧΤ4 DNA Ligase BufferU μ L Τ4 DNA Ligase、5μ L ddH20，混勻后短時離心，然后16°C水浴過夜反應。接著采用熱激轉化法將連接產物轉入大腸桿菌DH5a中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin, Km)的固體培養基篩選陽性克隆。挑選單菌落搖菌，以菌液為模板用擴增LrGSTU3的特異引物進行PCR，挑選出LrGSTU3與pCAMBIA2300S成功連接的克隆，并向檢測得到的陽性菌株中加入甘油并置于_80°C保存備用。
[0023]采用SanPr印柱式質粒抽提試劑盒(上海生工)提取并純化上述大腸桿菌DH5 α中的pCAMBIA2300S-ZrM7K?質粒。隨后用液氮凍融法將上述構建的植物表達載體pCAMBIA2300S-ZrM7K?轉入所制備的根癌農桿菌LBA4404感受態細胞中。操作步驟為:取2 μ g pCAMBIA2300S-Zr6,WJ質粒加入含有200 μ L感受態細胞的離心管中，輕輕混勻后冰浴5 min,隨后轉入液氮中冷凍Imin,然后迅速置于37°C水浴5 min,再冰浴2 min,之后加入500 μ L LB液體培養基于28°C振蕩培養4 h。將活化后的農桿菌涂于含有50 mg/LKm的LB固體培養基上，28°C倒置培養。挑選單菌落搖菌，再用擴增LrGSTU3的特異性引物進行PCR反應，檢測pCAMBIA2300S-Zr^7K?是否轉入農桿菌中。對于陽性克隆，加入甘油后置于-80°C保存備用。
[0024]實施例3:農桿菌介導的植物遺傳轉化以及轉基因植物篩選
本實驗的轉基因受體是煙草iNicotiana tabacum L.),將煙草種子用75%的酒精浸泡30 s,用無菌水洗漆后用0.1%的HgCl2浸泡8 min,然后再用無菌水洗漆若干次,播種于1/2MS培養基上，28°C暗培養5-8 d，發芽后轉至光照培養箱(25°C，16h/d光照)，以后每月用MS培養基繼代一次。
[0025]從-80 V冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-ZrM7K?質粒的農桿菌LBA4404菌種，取20uL接種于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液體培養基中，28°C培養至培養基渾濁。吸取I mL渾濁的菌液至含有50 mg/L Km的LB固體培養基上，28°C培養48ho隨后將LB固體培養基上的農桿菌刮下適量接種于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液體培養基中，28°C振蕩培養5-8 h以活化農桿菌。
[0026]取無菌煙草苗葉子切成約I cm2的葉盤，完全浸泡于上述含有活化農桿菌的MGL液體培養基中，25°C浸染15 min。用無菌濾紙吸干葉盤表面的菌液，將葉盤置于共培養基上，22°C無光條件下共培養2天。煙草轉化的共培養基為MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30g/L蔗糖+6 g/L瓊脂。
[0027]將共培養后的葉盤轉到加有抗生素的MS篩選培養基中分化成苗，同時篩選轉基因植株。煙草篩選培養基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+50 mg/L Km+200 mg/L 頭抱霉素(cefotaxime sodium salt, Cef);篩選培養時將培養瓶轉移至光照培養箱培養(25°C，16h/d光照，8h/d黑暗)。待煙草長出芽后用含有50 mg/LKm和200 mg/L Cef的MS培養基繼代培養。因煙草愈傷分化率較高，故需要對再生植株進行進一步篩選。將煙草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培養基上使其生根，最后選用生根較好的再生苗做進一步的檢測。
[0028]采用CTAB法提取轉基因煙草植株葉片的基因組DNA，取I μ L所得基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和濃度。以轉基因植株的基因組DNA為模板用LrGSTU3的特異引物進行PCR反應。PCR結束后，取8 μ L產物用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測陽性轉基因植株。部分煙草轉基因植株的擴增結果如圖1販、，LrGSTU3轉基因煙草共篩選到35株陽性轉基因植株。
[0029]實施例4:轉基因煙草中LrGSTU3的表達分析以及轉基因植株抗真菌活性分析 分別取陽性轉基因植株以及非轉基因煙草(野生型)的嫩葉提取總RNA，逆轉錄生成
cDNA第一鏈，并以此為模板用擴增ZrMTK?的特異引物進行PCR，根據PCR結果分析各轉基因植株中轉錄水平的表達。總RNA提取以及RT-PCR的方法與實施例1中相同。PCR結束之后，取8 μ L用于瓊脂糖凝膠電泳，部分單株的檢測結果如圖2所示，共檢測到27個轉基因單株中在轉錄水平有表達，這些單株的編號為I~27。
[0030]將實驗室保存的幾種真菌接種于PDA固體培養基(200 g/L馬鈴薯，15 g/L瓊脂，20 g/L葡萄糖)上，28°C暗培養，待菌落生長至直徑約為2~3cm時添加蛋白，分析轉基因植株體外抗真菌活性。供試真菌共有7種:葡萄座腔菌iffotrosphaeria c/otA/cba)，尖孢鐮刀菌{pusarium oxyspor um)，擬莖點霉屬(Phomopsis sp.)真菌，鏈格抱屬(Alternaria sp.)真菌，灰葡萄抱{Botrytis ciflerea),膠抱炭疽菌{Colletorichum gloeosporioides)，卑珠狀赤霉菌iGibberella ffiofli/i/brffiis)。為了防止其它雜菌污染所提取的蛋白，整個植物蛋白提取過程均是無菌操作。首先取I g轉基因煙草單株(編號分別為2、7、10、15)及野生型葉片放入研缽中，加入I mL蛋白提取液(1M NaCl,0.1M乙酸鈉，1% PVP，pH6)，充分研磨，轉入1.5 mL離心管中，混勻后4°C靜置過夜，4°C離心30 min (12,000 g)，取上清于新的1.5 mL離心管中，并取適量用紫外分光光度儀測定總蛋白濃度；將轉基因和野生型植株的總蛋白濃度調整至0.2 μ g/μ L，然后分別取20 μ L滴于各真菌培養基的無菌濾紙上；在每個真菌的平板上除了添加不同轉基因煙草植株的總蛋白，同時平行添加野生型煙草的總蛋白和空白對照(蛋白提取液)。28°C培養幾天后觀察各處理真菌生長的情況，并據此來評價轉基因煙草的體外抗真菌活性。結果如圖3所示，LrGSTU3轉基因煙草蛋白對灰葡萄孢以及尖孢鐮刀菌的生長具有明顯的抑制作用。
【權利要求】
1.一種岷江百合谷胱甘肽S-轉移酶基因LrGSTU3,其特征在于:其核苷酸序列如SEQID NO:1所不,編碼如SEQ ID NO:2所不氣基酸序列的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的岷江百合谷胱甘肽S-轉移酶基因LrGSTU3在提高煙草對灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌抗性中的應用。
3.根據權利要求2所述的岷江百合谷胱甘肽S-轉移酶基因的應用，其特征在于提高煙草的真菌抗性的具體操作如下: (1)將上述谷胱甘肽硫-轉移酶基因與植物超表達載體PCAMBIA2300S連接，構建植物超表達載體； (2)將上述構建的重組載體通過根癌農桿菌介導轉入煙草中； (3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記來篩選轉化子，并通過聚合酶鏈式反應篩選獲得真正的轉基因植株，接種特定病原真菌，分析轉基因煙草蛋白對真菌生長的抑制活性，最后篩選出對真菌 抗性明顯增強的轉基因植株。
【文檔編號】C12N9/10GK103937820SQ201410137732
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月8日 優先權日:2014年4月8日
【發明者】劉迪秋, 張南南, 季博, 韓青, 何華, 葛鋒, 陳朝銀 申請人:昆明理工大學