食品調味品中罌粟成分的檢測方法
【專利摘要】本發明屬于植物源成分的檢測技術，具體地說是用實時熒光PCR技術檢測食品調味品中罌粟成分的檢測方法。方法包括PCR擴增反應液和上游引物CODM?F：5’-GCTAAACTCACGCTTGCAGAAA-3’；下游引物CODM?R：5’-GTTACAGACGCACCAATATTATTCAAC-3。食品調味品中罌粟成分的檢測方法包括產品DNA的提取、罌粟特異性基因的實時熒光PCR擴增和使用熒光定量PCR儀隨機軟件分析擴增結果并進行結果判定。其優點是快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便、成本低。
【專利說明】食品調味品中罌粟成分的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物源成分的檢測技術，具體地說是用實時熒光PCR技術檢測食品調味品中罌粟成分的檢測方法。
【背景技術】
[0002]磐粟(Papaver somniferumL)是S粟科的二年生草本植物。原產小亞細亞、印度和伊朗。我國部分地區藥物種植場有少量栽培。
[0003]S粟殼含少量嗎啡(Morphine)、可待因(Codeine)、蒂巴因(Thebaine)、那可汀(Narcotine)、S粟殼堿(Narcotoline)和S粟堿(Papaverine);另含多糖約 2.4水解可得乳糖10%、阿拉伯糖6%、木糖6%、鼠李糖4%、乳糖醒酸(Galacturonic acid) 60% >4-0-甲基葡萄糖醒酸(4-0-Methylglucuronic acid)4%、微量巖藻糖(Fucose)、2_0_ 甲基巖藻糖(2-0-MethyIfucose) >2-0-甲基木糖(2-0-Methylxylose)及葡萄糖醒酸(G-tucuronic acid)、景天庚糖(Sedoheptulose)、D-甘露庚酮糖(D-Mannoheptulose)、D-甘油基-D-甘露辛麗糖(D-Glycero-D-Mannooctulose)、內消旋肌醇(Mesoinositol)、赤蘚醇(Erythritol)。食品中加入罌粟味道鮮美，但過量食用后易致癮。
[0004]本發明經過對罌粟和常見食品成分進行PCR檢測驗證，適合檢驗檢疫對罌粟成分鑒定，引物對罌粟具有滿意的特異性和靈敏性，具操作簡單，成本低的特點。

【發明內容】

[0005]本發明屬于植物源`成分的檢測技術，具體地說是用實時熒光PCR技術檢測食品調味品中罌粟成分檢測方法，為檢測罌粟成分提供有效工具，從而加強對食品安全問題的監督監管，保護消費者的合法權益。
[0006]本發明的主要原理為:針對保守序列設計一組引物(上游引物:CODM F:5，-gctaaactcacgcttgcagaaa-3?和下游弓丨物:C0DM R:5，-gttacagacgcaccaatattattcaac-3’)。進行核酸檢測時，模板DNA經加熱至94-95°C—定時間后，DNA雙鏈解離，即變性成單鏈。當溫度下降到退火溫度時，兩條單鏈重新配對，即復性。PCR擴增的產物，變性狀態下呈單鏈，熒光染料不與其結合就沒有熒光信號。當溫度為退火溫度時，PCR產物復性成為雙鏈DNA，熒光染料與其結合，可以檢測到強的熒光信號。在雙鏈DNA最多時，熒光信號最高，SP出現吸收峰，也就是在退火溫度下出現最高的吸收峰。
[0007]本發明涉及的食品調味品中罌粟成分的檢測方法，其中的試劑包括如下:
[0008](I) PCR擴增反應液A
[0009]包括IXPCR Master Mix(內含熱啟動的Taq DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25 μ L SYBR Green熒光染料；
[0010]上游引物CODM F:5，-gctaaactcacgcttgcagaaa-3?;下游引物 CODM R:5，-gttacagacgcaccaatattattcaac-3，
[0011]其中上游引物、下游引物:1: I ；[0012]其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dTTP: dATP: dGTP: dCTP = 1:1:1:1。
[0013](2)陽性對照DNA
[0014]上面所述PCR擴增反應液A，每管24μ L的最佳組成為:1XPCR MasterMix (內含熱啟動的Taq DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25 μ L SYBR Green熒光染料。
[0015]使用上述試劑盒檢測食品調味品中罌粟成分的方法，依次包括下列步驟
(1)-(3):
[0016](I)待檢樣品DNA的提取
[0017]DNA提取可使用CTAB法。
[0018](2)食品調味品中罌粟成分的實時熒光PCR擴增
[0019]A.在裝有24 μ L PCR擴增反應液A的反應管中加入I μ L待檢樣品DNA，混勻。
[0020]B.將PCR反應管放入熒光PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
[0021]95°C 15min, I個循環預變性；
[0022]950C 15sec,60°C lmin，40 個循環。
[0023](3)應用熒光定量PC R儀隨機軟件，測定熔點曲線。
【具體實施方式】
[0024]下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0025]實施例1
[0026]按下述方法檢測從中藥店購得的罌粟殼，使用玉米粉作為實驗的陰性對照:
[0027]包括IXPCR Master Mix(內含熱啟動的Taq DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25 μ L SYBR Green熒光染料；上游引物CODM F:5，-gctaaactcacgcttgcagaaa-S，；下游引物 CODM R:5，-gttacagacgcaccaatattattcaac-3
夕
[0028]按照以下程序進行檢測:
[0029](I)待測樣品DNA的提取
[0030]A.稱取經過預處理的待測樣本1.0Og至50mL離心管中；半固體樣品和液體樣品稱取2.00~4.00至50mL離心管中。
[0031]B.加入10mL65°C預熱的CTAB提取緩沖液和RNase A酶(使其終濃度為10 μ g/mL),顛倒混勻后于65°C溫育30min,期間顛倒混勻離心管2~3次；12000g離心IOmin,轉移ImL上清液至2mL離心管中。
[0032]C.在離心管中加入與上清液等體積的三氯甲烷中，上下顛倒充分混勻，12000g離心IOmin,轉移上清液600 μ L至2mL離心管中。
[0033]D.加入2倍體積CTAB沉淀液，顛倒混勻后，室溫靜置Ih ；12000g離心lOmin，棄去
上清液。
[0034]E.向沉淀中加入400 μ L氯化鈉溶液，使之沉淀溶解，之后轉移溶液至1.5mL離心管。
[0035]F.在溶解液中加入等體積三氯甲烷，顛倒混勻后，12000g離心lOmin，轉移上層水相至1.5mL離心管中。
[0036]G.加入0.6倍體積經4°C預冷的異丙醇，顛倒混勻后，于4°C下靜置30min ；12000g離心lOmin,小心棄去上清液。
[0037]H.加入500yL70%乙醇，震蕩離心柱管，12000g離心lOmin，棄去上清液，重復一
次，在室溫下揮干液體。
[0038]1.加入100 μ L TE溶液溶解DNA，4°C保存備用。
[0039](2)待測樣品DNA的實時熒光PCR擴增
[0040]A.在PCR反應管中加入24 μ L PCR反應液A和I μ L樣品DNA，混勻。
[0041 ] B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
[0042]95°C 15min, I個循環預變性；
[0043]950C 15sec,60°C lmin，40 個循環。
[0044](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，測定熔點曲線。
[0045]實施例2
[0046]按下述方法檢測從超市購得的罌粟與火鍋調料的人工添加樣品:
[0047]包括IXPCR Mast er Mix(內含熱啟動的Taq DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25 μ L SYBR Green熒光染料；上游引物CODM F:5，-gctaaactcacgcttgcagaaa-S，；下游引物 CODM R:5，-gttacagacgcaccaatattattcaac-3
夕
[0048]按照以下程序進行檢測:
[0049](I)待測樣品DNA的提取
[0050]A.稱取經過預處理的待測樣本1.0Og至50mL離心管中；半固體樣品和液體樣品稱取2.0O~4.0O至5OmL離心管中。
[0051]B.加入10mL65°C預熱的CTAB提取緩沖液和RNase A酶(使其終濃度為10 μ g/mL),顛倒混勻后于65°C溫育30min,期間顛倒混勻離心管2~3次；12000g離心IOmin,轉移ImL上清液至2mL離心管中。
[0052]C.在離心管中加入與上清液等體積的三氯甲烷中，上下顛倒充分混勻，12000g離心IOmin,轉移上清液600 μ L至2mL離心管中。
[0053]D.加入2倍體積CTAB沉淀液，顛倒混勻后，室溫靜置Ih ；12000g離心lOmin，棄去
上清液。
[0054]E.向沉淀中加入400 μ L氯化鈉溶液，使之沉淀溶解，之后轉移溶液至1.5mL離心管。
[0055]F.在溶解液中加入等體積三氯甲烷，顛倒混勻后，12000g離心lOmin，轉移上層水相至1.5mL離心管中。
[0056]G.加入0.6倍體積經4°C預冷的異丙醇，顛倒混勻后，于4°C下靜置30min ；12000g離心lOmin,小心棄去上清液。
[0057]H.加入500yL70%乙醇，震蕩離心柱管，12000g離心lOmin，棄去上清液，重復一
次，在室溫下揮干液體。
[0058]1.加入100 μ L TE溶液溶解DNA，4°C保存備用。
[0059](2)待測樣品DNA的實時熒光PCR擴增[0060]A.在PCR反應管中加入24 μ L PCR反應液A和I μ L樣品DNA，混勻。
[0061]B.將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增:
[0062]950C 15min, I個循環預變性；
[0063]950C 15sec,60°C lmin，40 個循環。
[0064](3)應用熒光定量PCR儀隨機軟件，測定熔點曲線。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0065]圖1罌粟特異性引物PCR產物的溶解曲線圖譜。罌粟特異性擴增產物熔解曲線峰值在81±0.5°C，從中藥店購得的罌粟殼在此處有擴增峰，陰性對照玉米粉沒有擴增。
[0066]圖2實際檢測樣品PCR產物的溶解曲線圖譜。罌粟特異性擴增產物熔解曲線峰值在81±0.5°C，從中藥店購得的罌粟 殼、罌粟與火鍋調料的人工添加樣品在此處有擴增峰。
【權利要求】
1.一種食品調味品中罌粟成分檢測的方法，其特征在于罌粟特異性引物: 上游引物 CODM F:5’ -GCTAAACTCACGCTTGCAGAAA-3’ ；
下游引物 CODM R:5’ -GTTACAGACGCACCAATATTATTCAAC-3’。
2.一種使用權利要求一所述的快速檢測食品調味品中罌粟成分檢測的方法，其特征是依次包括下列步驟: (1)在PCR反應管中加入24μ L PCR反應液A和I μ L樣品DNA，混勻。 (2)將PCR反應管放入熒光定量PCR儀，按下述反應條件完成PCR擴增: 950C 15min, I個循環預變性；
950C 15sec,60°C lmin,40 個循環。 (3)應用熒光定量PCR儀隨 機軟件，測定熔點曲線。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484530SQ201210202246
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月13日 優先權日:2012年6月13日
【發明者】高宏偉, 孫敏, 林超, 劉彩霞 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心