專利名稱：一種基于毛細電泳的呼吸道病毒的多重基因檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測方法，尤其是一種靈敏度高、重復性好、準確性強、靈活性強、成本低的基于毛細電泳的呼吸道病毒的多重基因檢測方法。
背景技術：
目前，呼吸道病毒感染每年造成大量人群死亡，尤其甲型流感時有局部暴發或爆發性流行如2009年的豬流感流行，對人民的健康及社會造成巨大威脅。目前對呼吸 道感染的最終檢測方法仍以病原體檢查為主，往往在確診上報之時，疫情已經有一定程度的傳播。本發明可同步檢測19種呼吸道病毒(包括季節性甲型流感、豬流感、禽流感、非典病毒等)及達菲敏感或抗性，一天之內可完成192個患者樣品的檢測。利用美國貝克曼庫爾特有限公司的GeXP遺傳分析系統靈敏、準確定量、快速、高通量的技術優勢，將為疾控中心、醫院及其它醫療機構提供一種靈敏、準確、快速且低成本的多重基因檢測方案。

發明內容
本發明的目的是提供一種靈敏度高、重復性好、準確性強、靈活性強、成本低的基于毛細電泳的呼吸道病毒的多重基因檢測方法。本發明采用如下技術方案一種基于毛細電泳的呼吸道病毒的多重基因檢測方法，包括如下步驟(1)生產“呼吸道病毒多重基因檢測試劑盒”;(2)采集患者樣品，并提取核酸；(3)以患者核酸為模板進行反轉錄；(4)以反轉錄產物為模板進行PCR反應；(5)以毛細電泳的方法分離樣品。優選地，所述步驟(2)中的患者樣品包括鼻咽拭子、痰液等等。優選地，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后在一定溫度下孵育的子步驟。優選地，所述步驟(3)中的孵育溫度分別為48°C、42°C、95°C、4°C。優選地，所述步驟(4)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進行熱循環反應的子步驟。優選地，所述步驟(4)的子步驟中的熱循環溫度分別為95°C、94°C、55°C、70°C、
4。。。本發明的有益效果為1.靈敏度高、重復性好采用激光誘導熒光-PMT，具有超高靈敏度。2.準確性強采用毛細管電泳對PCR產物進行分離檢測，可將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性。3.高通量本系統采用雙(96孔)板、自動加樣和樣品追蹤技術，實現單個反應檢測15-40個位點，可同時做192個反應(如192個患者樣品，每個樣品檢測19種呼吸道病毒，22個位點)，一天出結果；對于交叉感染患者，本方法可一次性給出準確報告，避免漏檢。
4.精確定量可精確定量病原體基因拷貝數。5.靈活性強可隨時根據需求調整檢測的靶基因，例如甲型流感發生新變異，可立即設計特異性引物，將其放入“呼吸道感染病原體多重基因檢測方案”中去。6.成本低每個樣品的檢測成本少于Y50,利于大規模推廣。
具體實施例方式下面根據實施例對本發明作進一步詳細說明。本發明創立了一種同步檢測十九種常見呼吸道病毒、二十二個靶位的多重基因檢測方案。
1.檢測的病毒包括甲型流感病毒及其亞型(禽流感、豬流感、季節性流感)、乙型流感病毒、副流感病毒、冠狀病毒、博卡病毒、合胞病毒、腺病毒、偏肺病毒等(表I)。2.在檢測上述呼吸道病毒的同時，檢測豬流感病毒對達菲抗藥性，明確地鑒別患者是否適宜服用達菲(表I)。3.建立了可靠地樣品質量及反應過程的對照(表I)a)人DNA和人RNA完整性的對照內參確保在檢驗過程中對樣品質量的判斷，避免假陰性。b)正常反應對照內參監控PCR反應效率，避免假陰性。表1.檢測的靶位點靶點名稱檢測內容/內參
權利要求
1.一種基于毛細電泳的呼吸道病毒的多重基因檢測方法，包括如下步驟(1)生產“呼吸道病毒多重基因檢測試劑盒”；(2)采集患者樣品，并提取核酸；(3)以患者核酸為模板進行反轉錄；(4)以反轉錄產物為模板進行PCR反應；(5)以毛細電泳的方法分離樣品。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(I)中的試劑盒包括反轉錄引物管、 PCR引物管、反轉錄緩沖液、PCR緩沖液、25mM氯化鎂、反轉錄酶、DNA聚合酶、熒光標記物、陽性對照。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(2)中的患者樣品包括鼻咽拭子、痰液等坐寸ο
4.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(3)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后在一定溫度下孵育的子步驟。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，所述步驟(3)中的孵育溫度分別為48°C、42°C、 95。。、4。。。
6.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(4)包括按比例在樣品板上加入試劑和樣品、以及混勻后按一定溫度進行熱循環反應的子步驟。
7.根據權利要求6所述的檢測方法，所述步驟(4)的子步驟中的熱循環溫度分別為 95。。、94。。、55。。、70。。、4。。。
8.根據權利要求1所述的檢測方法，所述步驟(5)包括制備GeXP遺傳分析儀樣品、準備分離液、毛細電泳分離樣品、結果分析的步驟。
全文摘要
本發明公開了一種基于毛細電泳的呼吸道病毒的多重基因檢測方法，包括如下步驟(1)生產“呼吸道病毒多重基因檢測試劑盒”；(2)采集患者樣品，并提取核酸；(3)以患者核酸為模板進行反轉錄；(4)以反轉錄產物為模板進行PCR反應；(5)以毛細電泳的方法分離樣品。本發明具有靈敏度高、重復性好、準確性強、靈活性強、成本低的優點。
文檔編號C12Q1/68GK102994648SQ20121020656
公開日2013年3月27日 申請日期2012年6月21日 優先權日2012年6月21日
發明者吳勇, 南麗, 黃迎彬, 顏進 申請人:海爾施生物醫藥股份有限公司