一種基于納米孔器件對生物分子探針標(biāo)定dna的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于納米孔器件對生物分子探針標(biāo)定DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測的方法及其應(yīng)用。該方法包括下述步驟：1）用生物分子探針對DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)定，得到標(biāo)定的DNA；2）利用納米孔測序裝置對標(biāo)定DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測；將標(biāo)定DNA加入到盛有電解液的正極腔室中，檢測時(shí)，向正極腔室引入壓強(qiáng)外場，作為DNA穿孔的驅(qū)動外場；并在正極和負(fù)極間施加電壓，作為與壓強(qiáng)外場反向的電場外場；測定過程中DNA在納米孔中受到的壓強(qiáng)外場的作用力大于電場力。采用上述方法可以得到了與普通未修飾的DNA截然不同的二級電流信號，通過對二級電流信號的分析和統(tǒng)計(jì)，表征出DNA上被修飾過的特異性位點(diǎn)的空間位置和順序，從而得到該長鏈DNA的物理圖譜。
【專利說明】一種基于納米孔器件對生物分子探針標(biāo)定DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于納米孔器件對生物分子探針標(biāo)定DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基于固態(tài)納米孔器件的DNA單分子探測分析被認(rèn)為是最有希望實(shí)現(xiàn)第三代快速低成本人類基因測序(在24小時(shí)內(nèi)花費(fèi)1000美元以下實(shí)現(xiàn)單個(gè)人的基因組測序)的技術(shù)路線之一，成為目前研究和應(yīng)用探索的熱點(diǎn)，除哈佛大學(xué)、波士頓大學(xué)、布朗大學(xué)、加州理工學(xué)院、荷蘭代爾夫特工業(yè)大學(xué)等研究小組外，IBM公司也在2009年10月宣布加入下一代人類基因組測序-1000美元計(jì)劃，以基于納米孔器件的測序技術(shù)為實(shí)現(xiàn)方法，使納米孔的研究由基礎(chǔ)研究開始走向應(yīng)用(D.Branton, et al.Nature Biotechnology26 (10)，1146 (2008) ;M.Zwolak and M.Di Ventra, Reviews of Modern Physics80(1)，141(2008).)。通過在溶液中電泳驅(qū)動分子穿過一個(gè)納米尺度的孔可以實(shí)現(xiàn)基于納米孔器件的單分子探測和分析能力。在納米孔的有限空間里可以通過各種手段對大量分子進(jìn)行快速的分析，當(dāng)高聚物分子穿過納米孔時(shí)，高聚物分子的結(jié)構(gòu)信息和探測的信號特征有一一對應(yīng)關(guān)系。利用該特性可以直接對數(shù)千堿基對長度的單鏈DNA分子進(jìn)行表征，避免了擴(kuò)增或標(biāo)記實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備環(huán)節(jié)，使得快速低成本DNA測序技術(shù)成為可能。目前阻礙這一技術(shù)長足發(fā)展的最大困難在于在電場驅(qū)動電壓下，DNA穿孔速度過快，超出了通用儀器的分辨率，從而無法實(shí)現(xiàn)對單堿基的差別進(jìn)行識別。
[0003]目前國際上較為常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)是在納米孔兩端加一個(gè)電壓，通過電場驅(qū)動，使DNA分子從孔一端電泳通過納米 孔，在外電路收集的離子電流會出現(xiàn)一個(gè)突然下降，電流的突然下降值和阻滯時(shí)間，可以對應(yīng)DNA的生物學(xué)信息。但是單純使用電場調(diào)節(jié)，DNA的穿孔速度太快，基本在一個(gè)堿基一微秒的量級，而目前儀器的最小分辨率為4微秒，也就是說，如果想要區(qū)別不同堿基之間的差別，通過現(xiàn)有手段，時(shí)間分辨率是無法達(dá)到的。要提高時(shí)間分辨率，就必須使DNA分子的穿孔時(shí)間延長，有效減慢DNA在孔中的運(yùn)動速度。減慢DNA的穿孔速度，才有可能實(shí)現(xiàn)對不同堿基的分辨。
[0004]另一方面，現(xiàn)有的第二代高通量測序技術(shù)的基本原理是將待測物種的全基因組隨機(jī)打碎成數(shù)百bp的小片段，然后經(jīng)過體外擴(kuò)增和修飾標(biāo)定之后，利用一種“邊合成邊測序”的方法讀取每一個(gè)小片段的序列，最后將全部小片段的序列通過一定的算法整合在一起，還原出全基因組的序列。需要指出的是，每個(gè)數(shù)百bp的小片段相對于人類的全基因組(約3X109bp)來說實(shí)在太小，因此在小片段的比對和拼接環(huán)節(jié)的計(jì)算量和算法復(fù)雜度是極高的，而且由于人類基因組中存在大量的重復(fù)序列，導(dǎo)致現(xiàn)有算法得出的全基因組仍然有5%到10%的不確定度；因此對于精確度要求很高的醫(yī)療診斷、藥物篩選以及高端科研領(lǐng)域，需要對整個(gè)序列進(jìn)行十幾甚至上百次的重復(fù)測序，無疑大大增加了測序的成本且降低了時(shí)間效率。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種基于納米孔器件對生物分子探針標(biāo)定DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測的方法。
[0006]本發(fā)明所提供的基于納米孔器件對生物分子探針標(biāo)定DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測的方法，包括下述步驟:1)用生物分子探針對DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)定，得到標(biāo)定的DNA ；
[0007]2)利用納米孔測序裝置對所述標(biāo)定的DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測，所述納米孔測序裝置包括:設(shè)有正極和負(fù)極的電解池、以及分隔所述電解池正極和負(fù)極的固態(tài)納米孔薄膜；將所述標(biāo)定的DNA加入到盛有電解液的所述電解池的正極腔室中，檢測時(shí)，向所述正極腔室引入壓強(qiáng)外場，作為DNA穿孔的驅(qū)動外場；并在正極和負(fù)極間施加電壓，作為與壓強(qiáng)外場反向的電場外場；測定過程中所述標(biāo)定的DNA在納米孔中受到的壓強(qiáng)外場的作用力大于電場力。
[0008]所引入壓強(qiáng)外場產(chǎn)生的壓強(qiáng)可為1.6-2.6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，所施加電壓的大小可為40_160mv。
[0009]測定時(shí)，在具體采用的電解液及納米孔條件下，根據(jù)所要達(dá)到的穿孔速度(或穿孔時(shí)間)，在上述壓強(qiáng)和電壓范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)，經(jīng)過有限次試驗(yàn)可確定使DNA穿孔速度降低所施加的最佳壓強(qiáng)和電壓。
[0010]測定時(shí)，電解液的濃度可為0.1-3.2mol/L,pH值為8-10。所述電解液可為納米孔測序法中所采用的電解液。通常采用氯化鉀溶液作為DNA測序時(shí)的電解液，其余比如NaCl，LiCl都是可以的。
[0011]所述固態(tài)納米孔薄膜中納米孔的直徑可為10-20nm，孔深可為20_100nm。
[0012]上述方法中，可根據(jù)待標(biāo)定`的DNA的特異位點(diǎn)人工合成合適的生物分子探針；根據(jù)特異位點(diǎn)的不同可選擇一種或多種構(gòu)型或序列的生物分子探針同時(shí)進(jìn)行標(biāo)定。
[0013]本發(fā)明中所述生物分子探針具體可為“人工設(shè)計(jì)合成的肽核酸(peptide nucleicacids PNA) ”或“去除剪切功能區(qū)域的限制性內(nèi)切酶作為生物大分子”。
[0014]所述人工合成的肽核酸生物分子探針，首先根據(jù)需求設(shè)計(jì)探針序列，然后由PerSeptive Biosystems, Framingham, MA 制備合成，通過 RP-HPLC 進(jìn)行純化。
[0015]所述去除剪切功能區(qū)域的限制性內(nèi)切酶可利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得，即將限制性內(nèi)切酶的基因中與“剪切功能區(qū)域”對應(yīng)的序列刪除，再在細(xì)胞中經(jīng)過翻譯表達(dá)得到。
[0016]本發(fā)明對長鏈DNA分子上的特異性位點(diǎn)進(jìn)行生物分子探針的修飾標(biāo)定，然后讓其穿過固體納米孔，得到了與普通未修飾的DNA截然不同的二級電流信號(secondaryblockage),通過對二級電流信號的分析和統(tǒng)計(jì)，表征出DNA上被修飾過的特異性位點(diǎn)的空間位置和順序，從而得到該長鏈DNA的物理圖譜。
[0017]基于上述方法，本發(fā)明還提供了一種對DNA進(jìn)行測序的方法。
[0018]該方法包括下述步驟:
[0019]I)采用本發(fā)明的方法對生物分子探針標(biāo)定DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測，得到了與普通未修飾的DNA截然不同的二級電流信號，通過對二級電流信號的分析和統(tǒng)計(jì)，表征出DNA上被修飾過的特異性位點(diǎn)的空間位置和順序，從而得到所述DNA的物理圖譜；
[0020]2)采用第二代高通量測序方法對所述DNA進(jìn)行測序，將打碎的小片段上存在的特異序列與步驟I)中標(biāo)定了空間位置和順序的特異性位點(diǎn)進(jìn)行比對，直接得出小片段在組合成長鏈DNA時(shí)的位置，經(jīng)過拼裝得到長鏈DNA的序列。
[0021]本發(fā)明充分挖掘和結(jié)合了固態(tài)納米孔技術(shù)和第二代測序技術(shù)的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)。通過固態(tài)納米孔技術(shù)得到的DNA物理圖譜恰好可以作為第二代測序技術(shù)中小片段序列拼接的指導(dǎo)，將小片段上存在的特異序列與標(biāo)定了空間位置和先后順序的特異性位點(diǎn)進(jìn)行比對就可以直接得出小片段在組合成長鏈時(shí)的位置，從而大大減輕了數(shù)據(jù)分析的工作量和算法的難度。
[0022]在上述方法基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)明了利用多種生物分子探針對一條DNA長鏈進(jìn)行標(biāo)定和探測的技術(shù)，利用不同構(gòu)型的生物分子探針在物理尺度和電學(xué)性質(zhì)上的差異，得到了更加復(fù)雜且信息量更大的二級電流信號，提高了在長鏈DNA上的修飾標(biāo)定密度，使不同的標(biāo)定分子不至于混淆。同時(shí)建立了一個(gè)標(biāo)定分子庫，對于需要標(biāo)定的特異性位點(diǎn)的序列和長度可以進(jìn)行選擇，以充分滿足測序應(yīng)用的需要。
[0023]本發(fā)明突破傳統(tǒng)的基于固態(tài)納米孔器件的DNA測序的方法，引入壓強(qiáng)外場作為驅(qū)動DNA穿孔的驅(qū)動外場，加電場作為反向外場，在不降低測量信號信噪比的前提下，使用IOnm左右的SiN固態(tài)納米孔，有效降低DNA分子穿過納米孔器件的速度，可以將穿孔速度減慢一個(gè)數(shù)量級以上。顯著提高了現(xiàn)有工作的時(shí)間分辨率，既可以保持高的電流信號信噪比，又可以避免引入由于使用很小的納米孔(直徑小于5nm)帶來的DNA分子與納米孔壁不可控的相互作用問題，并且實(shí)驗(yàn)簡單易行，重復(fù)性和可控性都比現(xiàn)有技術(shù)有顯著提高。但即使是這樣，要直接實(shí)現(xiàn)對單堿基的分辨依然達(dá)不到。
[0024]發(fā)明人考慮在現(xiàn)有的技術(shù)條件下，結(jié)合固態(tài)納米孔DNA穿孔速率快，讀取長度較長(現(xiàn)在可以達(dá)到約IOOkbp的讀長，理論上講讓一條染色體上的雙鏈DNA連續(xù)通過在不久的將來也有望實(shí)現(xiàn))的特點(diǎn)與現(xiàn)有第二代測序技術(shù)在小片段測序方面的高精度、高通量的優(yōu)勢，在小片段拼接算法方面給予現(xiàn)有測序技術(shù)以幫助，有望將人類全基因組的測序成本降低一個(gè)數(shù)量級(現(xiàn)有技術(shù)的成本大約是IOOk美元/人)，從而離實(shí)現(xiàn)我們的目標(biāo)更進(jìn)一
止 /J/ O
[0025]本發(fā)明相比于 現(xiàn)有對基于固態(tài)納米孔對DNA分子探測的報(bào)道，集中的優(yōu)勢體現(xiàn)在:
[0026]1、現(xiàn)有技術(shù)在DNA分子穿孔探測的時(shí)間分辨率上距離單堿基的分辨依然遙遙無期，而本發(fā)明創(chuàng)造性地將不易做到的單堿基分辨轉(zhuǎn)換成了對直徑更大、因而也更易探測的標(biāo)定分子的探測，從而間接實(shí)現(xiàn)了對DNA上的特異序列的分辨，在基于固態(tài)納米孔對DNA分子進(jìn)行探測領(lǐng)域是一個(gè)長足的進(jìn)步。同時(shí)由于特異序列在DNA長鏈上的標(biāo)識作用，本發(fā)明還具有很廣闊的實(shí)用價(jià)值。
[0027]2、之前對DNA分子穿孔速率進(jìn)行減速的研究普遍發(fā)現(xiàn)，由于分子布朗運(yùn)動的存在，DNA分子穿孔速率越慢，布朗運(yùn)動對其運(yùn)動不確定度的影響也就越顯著，因此雖然時(shí)間分辨率提高了，但是空間分辨率的不確定度卻在增大。而本發(fā)明中雖然也使用了壓強(qiáng)驅(qū)動DNA減速的技術(shù)，但是由于標(biāo)定分子的二級電流信號特征明顯易于探測，所以對DNA減速的幅度并不大，使得最后對事件的統(tǒng)計(jì)結(jié)果具有極好的精確度和可信度。
[0028]3、方法簡單，易于操作。用于標(biāo)定的肽核酸(peptide nucleic acids PNA)生物分子探針最早報(bào)道于 1992 年(M.Egholm, P.E.Nielsen, et al.J.Am.Chem.Soc., 1992, 114(5), pp 1895-1897)，其合成制備手段成熟易行，而且獲得的標(biāo)定分子可以保留建立標(biāo)定分子庫，以滿足不同的特異性位點(diǎn)的序列和長度對生物分子探針的需求。這種方法可重復(fù)性好，非常利于推廣。不需要引入復(fù)雜的體系和制作工藝，對技術(shù)要求不高，實(shí)驗(yàn)成功率很聞，大大提聞了實(shí)驗(yàn)效率。
[0029]4、之前的研究和報(bào)道全部著眼于對DNA本身穿孔事件的研究，試圖解決單堿基分辨的難題。而本發(fā)明充分利用了現(xiàn)有技術(shù)條件下成熟的技術(shù)手段，通過創(chuàng)造性的技術(shù)整合和優(yōu)勢互補(bǔ)，達(dá)到挖掘現(xiàn)有技術(shù)潛力的目的，也不失為一種很好的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為本發(fā)明所用固態(tài)納米孔的光刻掩模板的圖形；其中，(a)為4英寸硅片設(shè)計(jì)的光刻掩模板圖形，(b)對圖1a的局部放大圖，白色圓孔區(qū)對應(yīng)的是每個(gè)芯片中的圓形透光區(qū)域。(c)對Ib的進(jìn)一步放大圖,可以清楚看到對應(yīng)于每個(gè)芯片中對應(yīng)的圓形透光區(qū)域。(d)為方便從4英寸大硅片上解理單個(gè)小芯片，而特殊設(shè)計(jì)的劃片線，用白色虛線表示。
[0031]圖2為納米孔器件(3mm*3mm芯片)制作流程示意圖；(a)甩膠，曝光，顯影，去膠，出圖形(b)反應(yīng)離子束刻蝕刻透一面的氧化娃和氮化娃(C)去掉光刻膠(d) KOH溶液各向異性腐蝕掉硅，露出氧化硅和氮化硅懸空膜(e)用聚焦離子束在氧化硅刻出一個(gè)深度為
1.5 μ m的小窗格(f ) RCA反應(yīng)將剩余0.5 μ m氧化硅層去掉，只暴露出2 μ mX 2 μ m小窗格大小，厚度為70nm的氮化硅懸空膜。
[0032]圖3(a)離子電流測量與壓強(qiáng)加載示意圖；(b)泳池和電極加載裝置圖；(C)壓強(qiáng)加載裝置圖；(d)壓強(qiáng)顯示 計(jì)。
[0033]圖4為在IOkb長鏈DNA上利用人工合成的肽核酸(peptide nucleic acidsPNA)生物分子探針(識別位點(diǎn)為CTTCTTT)標(biāo)定兩個(gè)特異性位點(diǎn)，獲得的二級電流信號(secondary blockage)圖。
[0034]圖5為在IOkb長鏈DNA(其序列上每間隔Ikb就有一個(gè)可以被分子標(biāo)定的特異位點(diǎn))上間距Ikb標(biāo)定一個(gè)生物分子探針，對大量DNA穿孔事件的統(tǒng)計(jì)得到標(biāo)定分子的相對位置分布圖。
[0035]圖6為在長度為48kb的λ -DNA上標(biāo)定三種不同識別位點(diǎn)和分子構(gòu)型的生物分子探針(特異性識別位點(diǎn)分別為CTTCTTT，CTAGAT，GCTTCAT)，獲得的強(qiáng)度不同的二級電流信號圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的方法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。
[0037]下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0038]實(shí)施例、
[0039]I)制備芯片器件
[0040]本步驟的目的是制備可以放入透射電子顯微鏡中進(jìn)行操作的固態(tài)納米孔器件，從而實(shí)現(xiàn)利用透射電子顯微鏡中高能會聚電子束對器件懸空薄膜進(jìn)行打孔操作，從而實(shí)現(xiàn)納米孔器件。這其中包括了一系列傳統(tǒng)半導(dǎo)體加工工藝中涉及的微納加工工藝，并且還涉及了一系列現(xiàn)代前沿的納米尺度加工技術(shù)。
[0041]具體方法如下:首先，將(100)面4英寸硅片，兩面分別先后生長2微米的氧化硅，用低壓化學(xué)氣相沉積方法沉積150到200納米左右的低應(yīng)力氮化硅。然后制作光刻掩模版，目的是要在4英寸的娃片上做成很多3mmX3mm的小基片周期分布(圖1a),每個(gè)3mmX3mm小基片圖形中心有一個(gè)直徑為584 μ m的圓形透光區(qū)域(圖lb，C)。為保證后期在4英寸硅片上分離每個(gè)3mmX3mm的小基片，保證分離劃片時(shí)走刀的準(zhǔn)確，又使得硅片不會破損成隨機(jī)小片，在每個(gè)小基片圖案邊界加了一些透光的短劃線:透光條的寬度為5 μ m，長度為20 μ m(圖1d)。光刻掩模版的具體制作參數(shù)為:制版尺寸:5英寸；圖形分布范圍:Φ IOOmm圓形分布；晶向條:距離中心49mm,長50mm,寬0.8mm。然后利用光刻(圖2a)和反應(yīng)離子束刻蝕(圖2b)將Si片一面的二氧化娃和氮化娃按照光刻掩模版的圖形刻透,露出Si表面。隨后去掉光刻膠(圖2c)，使用KOH各向異性腐蝕，(40%K0H，80°C，6小時(shí))腐蝕硅，腐蝕沿著(111)面進(jìn)行。腐蝕穿的標(biāo)準(zhǔn)是:小窗格透光后再過腐蝕一段時(shí)間。光學(xué)顯微鏡下氧化硅面很平整，沒有島狀結(jié)構(gòu)。這樣就實(shí)現(xiàn)了一面只有二氧化硅和氮化硅的小窗格(20~80μπι)懸空膜，下面有娃襯底作支撐(圖2d)。接下來,為了從4英寸的大娃片上分離3mmX3mm小基片，需要進(jìn)行劃片操作。劃片時(shí)需要在硅片背面貼上一層強(qiáng)力藍(lán)膠做保護(hù)，因?yàn)樵趧澠^后，撕開藍(lán)膠時(shí)容易把懸空膜撕破，所以必須做好防護(hù)。辦法是:用高溫?zé)崛谙灠汛齽澒杵土硪槐Ｗo(hù)硅片用高溫?zé)崛谙炚吃谝黄?。然后把藍(lán)膠粘在保護(hù)硅片的背面，放進(jìn)劃片機(jī)進(jìn)行劃片，劃片深度為200到250微米左右。劃片過后，把藍(lán)膠撕下。把熱融蠟粘在一起的硅片放在熱板上加熱，蠟融化，把硅片分開。上面的蠟用丙酮沖洗干凈即可。這一步可以保證順利解理得到大量3mmX3mm小基片。一般來講，一張4英寸的硅片，可以解理得到800片3mmX3mm小基片。之后將3mmX3mm小基片放入熱磷酸160°C加熱減薄氮化娃膜厚度,減薄速率為f5nm每分鐘，減薄到70納米或其它需要的厚度，厚度可以通過橢偏儀監(jiān)控。之后為了降低暴露在溶液中氮化硅膜的面積以減小電容噪聲，并且降低氮化硅膜在溶液中破裂的可能，我們使用聚焦離子束(FIB，DB 235，F(xiàn)EI)刻蝕2微米氧化硅，離子束流300pA，大約刻蝕I分鐘，可以在氮化娃下面形成一個(gè)I~2 μ mX I~2 μ mX 1.5 μ m的小窗格，1.5 μ m是深度。目前我們得到了還剩余500nm厚氧化娃，I~2 μ mX I~2 μ m的小窗格(圖2e)。然后使用RCA反應(yīng)，將剩余的500nm厚`氧化硅腐蝕掉，只剩下I~2μπιΧ1~2μπι小窗格大小，厚度為70nm的氮化硅懸空膜(圖2f)。其中RCA反應(yīng)為:NH3.H2O:H202=1:1:5 (v/v)，70° C加熱10分鐘，去除硅片上的有機(jī)污染，也為了下一步BOE腐蝕時(shí)更好的浸潤；B0E(HF =NH4F:H2O=1:2:3)腐蝕6分鐘(腐蝕速率為100nm/min)，可以把剩余的500nm氧化硅去除干凈得到懸空的氮化硅膜；HC1 =H2O2 =H2O=1:1:5 (v/v/v)，，70° C，清洗10分鐘，去除無機(jī)雜質(zhì)。
[0042]2)透射電子顯微鏡進(jìn)行納米孔制作
[0043]芯片器件加工好之后,放入透射電子顯微鏡(FEI Tecnai F30)進(jìn)行打孔操作，放大倍數(shù)調(diào)整到520k-890k，束斑大小為:1，電子束聚到最小或稍大，5分鐘左右，即可得到直徑IOnm左右、深度為60nm的納米孔。打孔前后，樣品桿要放在等離子體清洗儀中(O2:Ar=l: 3, v/v)里清洗一分鐘，去除有機(jī)污染。納米孔器件制作好后，儲存在真空干燥箱里備用。
[0044]3)制備用于對DNA分子上的特異性位點(diǎn)進(jìn)行修飾標(biāo)定的生物分子探針[0045]肽核酸(peptide nucleic acids PNA)生物分子探針是將核酸分子中帶電荷的磷酸戊糖骨架置換成電中性、非手性、類似多肽骨架而得到的一種DNA類似物，其骨架由酰胺鍵連接的N(2-氨乙基)-甘氨酸單元重復(fù)組成，AGCT四種堿基與骨架之間以亞甲基羰基相連，可以通過堿基互補(bǔ)配對原理與DNA上的特異序列相互作用，而且具有特異性強(qiáng)，親和性及穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。PNA最早報(bào)道于1992年(MEgholm，P.E.Nielsen, etal.J.Am.Chem.Soc., 1992, 114 (5), pp 1895 - 1897),隨后 Egholm和 Nielsen 等人又合成出了具有不同構(gòu)型和雜交模式的 PNA,例如 bis_PNA(M.Egholm, P.E.Nielsen, et al.NucleicAcid.Res.1995, 23 (2), 217 - 222.)和 pcPNA (P.E.Nielsen, et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.1999,96(21), 11804 - 11808.)等。目前商業(yè)化的PNA探針合成手段已經(jīng)非常成熟。
[0046]本發(fā)明所使用的肽核酸(peptide nucleic acids PNA)生物分子探針,首先根據(jù)需要設(shè)計(jì)特異序列并選擇合適的構(gòu)型(PNA單體、bis-PNA或pcPNA等),然后由PerSeptiveBiosystems, Framingham, MA制備合成,通過RP-HPLC (高效液相色譜)進(jìn)行純化,其濃度可以用紫外分光光度計(jì)在UV260nm處定量。制備得到的具有不同序列、構(gòu)型和雜交模式的PNA分子探針用于4)和5)的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0047]4)單分子標(biāo)定DNA穿過固態(tài)納米孔的探測
[0048]我們通過一系列浸潤過程用PDMS墊片將芯片封裝入由PEEK制成的電泳池中，泳池由Cis腔和Trans腔構(gòu)成，兩個(gè)腔之間只通過納米孔進(jìn)行連接，無其他連接通道(圖3a)。然后向兩個(gè)腔中注入濃度為1.6摩爾每升的氯化鉀溶液。溶液中含有ImM的EDTA和IOmM的Tris (pH=8)。我們使用兩個(gè)Ag/AgCl電極分別插入Cis腔和Trans腔中(圖3a)。
[0049]我們將預(yù)先制備好的單種PNA生物分子探針溶液(識別位點(diǎn)為CTTCTTT)與IOkb的長鏈DNA溶液混合，調(diào)節(jié)混合溶液的pH = 8，其中長鏈DNA的序列已知(見圖4)，上面有兩個(gè)可被選定的分子標(biāo)定特異性結(jié)合的位點(diǎn)?；旌先芤悍旁跓崤_上水浴30min,溫度設(shè)定為.37°C，以提高特異性結(jié)合的效率(限制性內(nèi)切酶的活性在37°C時(shí)最佳)。
[0050]然后向Cis腔注入混合水浴后的DNA溶液，在從Cis到Trans的方向引入壓強(qiáng)外場。具體做法:在與Cis腔相連的導(dǎo)管上連接于氣瓶相連的導(dǎo)管，使得氣瓶產(chǎn)生的壓強(qiáng)可以被引入到Cis腔中(圖3b，C)。引入壓強(qiáng)的示數(shù)通過氣壓計(jì)顯示(圖3d)。通過調(diào)節(jié)氣瓶上的壓強(qiáng)真空計(jì)，就可以調(diào)節(jié)被引入到Cis腔中的壓強(qiáng)大小。這樣我們就實(shí)現(xiàn)了 Cis到Trans方向的壓強(qiáng)外場驅(qū)動。然后我們再從反向加載IOOmV電壓(圖3a)，這樣可以利用膜片鉗放大器系統(tǒng)給出離子電流測量信號。由于DNA和其上的分子標(biāo)定在溶液中帶負(fù)電，反向電壓的施加起到減速DNA，提高時(shí)間分辨率的作用。未經(jīng)標(biāo)定的DNA分子通過固態(tài)納米孔時(shí)由于占據(jù)了孔內(nèi)的離子通道，因此使得離子電流信號產(chǎn)生了一個(gè)降低(blockage)，而當(dāng)有標(biāo)定的DNA分子從孔內(nèi)穿過時(shí)，生物分子探針和DNA特異性結(jié)合的區(qū)域會產(chǎn)生構(gòu)象改變，因此對離子通道的堵塞作用更加顯著，從而在電流信號降低的情況下進(jìn)一步產(chǎn)生一個(gè)新的降低信號(secondary blockage)(見圖4),成為表征DNA上具有某些特異性序列的有力證據(jù)。通過對大量DNA穿孔事件的信號數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，我們精確地確定了兩個(gè)特異性序列位點(diǎn)之間的空間距離，與已知序列的比對證明本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法精確度很高。
[0051]在以上實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，發(fā)明人設(shè)計(jì)合成了另一種長度為IOkb的DNA雙鏈分子，在其序列上每間隔Ikb就有一個(gè)可以被分子標(biāo)定的特異位點(diǎn)(特異性識別位點(diǎn)為CTTCTTT)，即一條鏈上總共有9個(gè)可標(biāo)定位點(diǎn)。最后我們經(jīng)過大量的穿孔事件統(tǒng)計(jì)分析，得到了這9個(gè)標(biāo)定位點(diǎn)的相對距離(見圖5)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們的模擬和預(yù)期非常吻合，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn):作為標(biāo)定的生物分子探針與DNA的親和性及特異性很好，超過90%的穿孔事件都有且僅有9個(gè)二級電流信號，說明這些穿孔的DNA上有且僅有9個(gè)結(jié)合的標(biāo)定分子。這表明利用本發(fā)明的方法對現(xiàn)有測序手段實(shí)現(xiàn)改進(jìn)的想法不僅可行，而且非?？煽?。
[0052]5)混合分子標(biāo)定DNA穿過固態(tài)納米孔的探測
[0053]購買商業(yè)化的λ-DNA分子溶液(長度為48kb)，根據(jù)已知的序列從我們建立的標(biāo)定分子庫中選擇了三種不同的標(biāo)定分子(特異性識別位點(diǎn)分別為CTTCTTT，CTAGAT，GCTTCAT)，它們的特異性識別位點(diǎn)長度分別為7bp、6bp和7bp，這些特異性位點(diǎn)在48kb的序列上相隔排列，同時(shí)三種標(biāo)定分子與DNA結(jié)合后產(chǎn)生的構(gòu)象改變各不相同。我們將三種標(biāo)定分子與λ -DNA分子混合，37°C水浴30min后注入電泳池的Cis腔，在壓強(qiáng)驅(qū)動反向電場減速的條件下測量離子電流信號，結(jié)果得到了三種強(qiáng)度的二級電流信號(見圖6)，分別對應(yīng)三種不同的標(biāo)定分子，從而對應(yīng)地獲得了三種特異性位點(diǎn)在λ -DNA鏈上的排列順序和空間距離。這一實(shí)驗(yàn)一方面是對分子標(biāo)定DNA探測技術(shù)的穩(wěn)定性和精確性進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，另一方面也更加符合現(xiàn)有測序技術(shù)對小片段拼接方面的要求，因?yàn)樗杵唇拥男∑紊虾苡锌赡軒в胁煌奶禺愋?列，需要我們在長鏈DNA上做不同的標(biāo)定。
【權(quán)利要求】
1.一種基于納米孔器件對生物分子探針標(biāo)定DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測的方法，包括下述步驟:1)用生物分子探針對DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)定，得到標(biāo)定的DNA ； 2)利用納米孔測序裝置對所述標(biāo)定的DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測，所述納米孔測序裝置包括:設(shè)有正極和負(fù)極的電解池、以及分隔所述電解池正極和負(fù)極的固態(tài)納米孔薄膜；將所述標(biāo)定的DNA加入到盛有電解液的所述電解池的正極腔室中，檢測時(shí)，向所述正極腔室引入壓強(qiáng)外場，作為DNA穿孔的驅(qū)動外場；并在正極和負(fù)極間施加電壓，作為與壓強(qiáng)外場反向的電場外場；測定過程中所述標(biāo)定的DNA在納米孔中受到的壓強(qiáng)外場的作用力大于電場力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述引入壓強(qiáng)外場產(chǎn)生的壓強(qiáng)為1.6-2.6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，所述施加電壓的大小為40-160mv。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述電解液的濃度為0.1-3.2mol/L,pH值為8-10 ;所述固態(tài)納米孔薄膜中納米孔的直徑為10-20nm，孔深為20_100nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述生物分子探針為人工設(shè)計(jì)合成的肽核酸或去除剪切功能區(qū)域的限制性內(nèi)切酶作為生物大分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:采用不同的生物分子探針同時(shí)對DNA的不同的特異位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)定。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述方法在繪制DNA物理圖譜中的應(yīng)用。
7.一種對DNA進(jìn)行測序的方法，包括下述步驟: 1)采用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述方法對生物分子探針標(biāo)定的DNA的特異位點(diǎn)進(jìn)行檢測，得到了二級電流信號，通過對所述二級電流信號的分析和統(tǒng)計(jì)，表征出DNA上被標(biāo)定過的特異性位點(diǎn)的空間位置和順序，從而得到所述DNA的物理圖譜； 2)采用第二代高通量測序方法對所述DNA進(jìn)行測序，將打碎的小片段上存在的特異序列與步驟I)中標(biāo)定了空間位置和順序的特異性位點(diǎn)進(jìn)行比對，直接得出小片段在組合成DNA時(shí)的位置，經(jīng)過拼裝得到DNA的序列。
【文檔編號】C12Q1/68GK103509852SQ201210207703
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月18日
【發(fā)明者】趙清, 唐智鵬, 魯鉑, 俞大鵬, 李松崗 申請人:北京大學(xué)