一種提高液態漆酶存儲穩定性的方法
【專利摘要】本發明提供了一種提高液態漆酶存儲穩定性的方法，是以2010年9月15日保存于中國典型培養物保藏中心保藏編號為：CCTCC?M?2010235的高產漆酶的密孔菌屬菌株Pycnoporus?sp.SYBC-L3為出發菌株，以水稻秸稈為主要原料固態發酵生產制備的液態漆酶為研究對象，在固態發酵產漆酶的培養基中添加一定濃度的硝酸銨后，所制備液態漆酶的存儲穩定性明顯提高，酶液在30℃存儲90天后，酶活保留率高達90％以上，顯著提高了酶的穩定性，并且酶的活力提高10％以上，該方法解決了液態漆酶易失活的問題，屬于酶制劑【技術領域】。
【專利說明】一種提高液態漆酶存儲穩定性的方法
【技術領域】
[0001]本發明為一種提高液態漆酶存儲穩定性的方法，屬于酶制劑【技術領域】。
【背景技術】
[0002]漆酶具有廣泛的底物，不僅能催化氧化多種芳香族化合物，還能降解木質素、去除許多有毒酚類物質的毒性，還可以使多種染料脫色及去除石油工業廢水的毒性等，因此在紡織印染、造紙、草坪修復、能源再生、飼料、食品、廢水處理等領域具有較大的應用價值而受到廣泛的關注。
[0003]現有研究表明，漆酶的制備多數局限在實驗室用各種試劑配成培養基來制備，所制備的成本偏高，我們研究出以水稻秸桿為主要原料固態發酵制備漆酶獲得成功，已于2012年I月12日申請國家專利，專利申請號:201210007885.9，該方法大幅度降低了漆酶的生產成本且簡便易行投入少，但所制備的液態漆酶易失活，這促使我們去探索研究提高液態漆酶穩定性的方法，本發明就是在這樣的指導思想下，經過多次試驗獲得成功的。
【發明內容】
[0004]本發明研究出一種對液態漆酶存儲穩定性十分有效的方法——在產酶培養基中添加一定濃度的硝酸銨溶液，從而使所制備的液態漆酶的存儲穩定性大大提高，而且酶的活性也有所提聞。
[0005]本發明的技術方案:用我們已申請專利的保存于中國典型培養物保藏中心的保藏編號為:CCTCC M 2010235產 漆酶的密孔菌屬的野生菌株Pycnoporus sp.SYBC-L3為生產出發菌株，將水稻秸桿為主要原料固態發酵生產制備的液態漆酶為研究對象，在發酵產漆酶的培養基中添加一定濃度的硝酸銨，具體工藝為:
[0006](I)種子培養
[0007]種子培養基:以質量體積濃度計:2%葡萄糖，20%馬鈴薯。
[0008]馬鈴薯需切成片或塊，加水煮20-30分鐘，用紗布過濾取其汁并定容。
[0009]接種工藝:取斜面菌種一環在PDA平板上點接菌絲，30°C培養7天，切取3塊直徑大小為0.5CM的菌落接入裝有50ml種子培養基的500ml規格的三角瓶中，再加入玻璃珠10-20粒，準備若干份，置于搖床，培養條件:轉速200rpm，溫度30°C，恒溫培養2天，即為發酵產酶的種子液。
[0010](2)發酵產酶培養基
[0011]將水稻秸桿切成I厘米左右的小段，稱20克放入500ml的三角瓶中，加入用鹽酸及氫氧化鈉調PH = 3的水40ml，再加入濃度為20g/L的硝酸銨溶液5ml，于121°C滅菌20分鐘，冷卻后待用。
[0012](3)發酵產酶及酶液提取
[0013]滅菌冷卻后在發酵產酶培養基中加入20ml種子培養液并充分與稻桿混合,并用8層紗布封口置于30°環境中靜止培養8天后，首先再加入400ml水，將結成團的秸桿菌塊攪散后進行攪拌或置于搖床在30°C、200rpm條件下繼續培養3小時，然后在30°環境中靜止12-24小時，最后用離心機離心或用抽濾方法或用紗布進行過濾除去秸桿和菌體即得到漆酶粗酶液，用DMP法測酶活，并計算總酶活除秸桿的重量，得到每克秸桿產漆酶的單位U/g.[0014](4)酶活的測定方法
[0015]3mL 反應體系中包括:0.5mll0mmol/L 的 2,6-二甲氧基酹；2.4ml pH = 3.0 的
0.lmol/L磷酸氫二鈉-檸檬素緩沖液；0.1ml粗酶液——發酵液經冷凍高速離心機1000Og離心10分鐘得到上清液并視酶活力稀釋，以去離子水替代粗酶液溶液作為空白對照，在469nm處測吸光值每隔5s讀取一次吸光度值，一般持續進行Imin后停止測定，以反應的線性范圍計算酶活。酶活力定義:1分鐘催化一微摩爾底物所需酶量，酶活性以U.L—1表示。
[0016]本發明的有益效果:
[0017]本發明具有如下特點:
[0018]1、發酵原材料價格低廉，且可變廢為寶，綠色環保，沒有廢棄物。因為菌種為藥用真菌，故漆酶過濾后的剩余殘存物可用于動物飼料、造紙和生物肥料。
[0019]2、發酵生產設備簡單，資金投入少。
[0020]3、粗酶性質穩定，以DMP為底物時，在酸性環境下能發揮最大催化功效，最適溫度為55度，較耐熱。
[0021]4、作用底物廣泛，有廣闊的應用前景.[0022]5、生產制備成本低，十分有利于全面展開，符合國家政策。
[0023]由于本發明所生產制備出來的漆酶成本低且可廣泛應用于紡織印染、造紙、草坪修復、能源再生、飼料、食品、廢水處理等方面。因此本發明有廣泛的工業使用價值和顯著的經濟效益前景。
【具體實施方式】
[0024]對照實施例
[0025]取斜面菌種一環在PDA平板上點接菌絲，30°C培養7天，切取3塊直徑大小為
0.5CM的菌落接入裝有50ml種子培養基的250ml規格的三角瓶中，再加入玻璃珠10粒，準備若干份，置于搖床，培養條件:轉速200rpm，溫度30°C，恒溫培養2天，即為發酵產酶的種子液。
[0026]將水稻秸桿切成I厘米左右的小段，稱20克放入500ml的三角瓶中，加入用鹽酸及氫氧化鈉調PH = 3的水20ml，121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入20ml種子培養液并充分混合，30°靜止培養8天，再加入400ml水，用棒充分攪散后，將500ml三角瓶置于溫度為30°轉速為200rpm的搖床上搖3小時，再靜止24小時，過濾得到酶液，測酶活每克秸桿可產漆酶81U/g，由于產酶培養中沒有加硝酸銨溶液，所制備的液態粗酶液在30°C條件下放置30d和90d，酶活保留率分別為63.12%和26.25%。
[0027]實施例1
[0028]發酵產酶的種子液培養操作同上對照例。
[0029]將水稻秸桿切成I厘米左右的小段，稱20克放入500ml的三角瓶中，加入用鹽酸及氫氧化鈉調PH = 3的水40ml，再加入濃度為20g/L的硝酸銨溶液5ml，121°C滅菌20分鐘，冷卻后加入20ml種子培養液并充分混合，30°靜止培養8天，再加入400ml水，用棒充分攪散后，將500ml三角瓶置于溫度為30°轉速為200rpm的搖床上搖3小時，再靜止24小時，過濾得到酶液，測酶活每克秸桿可產漆酶90U/g，酶活力提高10%，且所制備的液態粗酶液在30°C條件下放置30d和9 0d，酶活保留率分別為97.24%和90.6%。
【權利要求】
1.一種提高液態漆酶存儲穩定性的方法，其特征在于它以保藏號為CCTCC M2010235的高產漆酶的密孔菌屬菌株Pycnoporus sp.SYBC-L3為出發菌株，將水稻秸桿為主要原料固態發酵生產制備的液態漆酶作為研究對象，在固態發酵產漆酶的培養基中按培養基總重量的1/12添加濃度為20g/L的硝酸銨溶液后發酵制備的液態漆酶: (1)酶液在30°C環境中存儲90天后，酶活保留率高達90%以上，提高了酶的穩定性。 (2)所制備的液態漆酶的活力提高了8%以上，增強了酶的使用效果。
【文檔編號】C12R1/645GK103509762SQ201210211312
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月26日 優先權日:2012年6月26日
【發明者】張峰, 李洪兵, 張明 申請人:湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司