專利名稱：一種星形膠質細胞分離和培養方法
技術領域：
本發明屬于動物細胞培養技術領域，具體涉及一種星形膠質細胞體外分離和培養方法。
背景技術：
在中樞神經系統內，膠質細胞的數量幾乎占90 %，而星形膠質細胞是膠質細胞中體積最大的一種，與少突膠質細胞合稱為大膠質細胞。傳統研究大多把焦點集中在神經元上，認為星形膠質細胞只對神經元起營養支持作用，而對神經信號的傳遞和處理不起作用，現已證實星形膠質細胞在中樞神經系統的發育及病理生理過程中起重要作用，它還具有攝取、滅活和供給神經遞質，抗氧化、營養修復以及抑制神經元過度興奮并參與了學習和記憶等腦的高級功能活動，加深了對星形膠質細胞的功能認識。隨著對其功能的了解，它已逐漸·成為神經生物學領域研究的熱點。但由于在體內星形膠質細胞與其它神經細胞混雜存在，妨礙了其生物學功能的研究及應用。因此需要對星形膠質細胞進行體外培養并純化，才能深入了解其形態結構和生物學功能。目前尚未見有關星形膠質細胞體外分離或培養方法的專利文獻公開，雖然星形膠質細胞采用常規細胞培養技術，能夠在一定程度上達到培養的目的，但存在著細胞污染嚴重，傳代次數少，成纖維細胞等其他雜細胞很難分離等問題，不能滿足細胞實驗的要求。本室參照國內外培養分離膠質細胞的方法。根據多年的實驗研究，改進了大腦皮質星形膠質細胞的體外培養方法，為后續實驗對星形膠質細胞的生物學作用研究提供了實驗模型。經長期觀察表明星形膠質細胞與成纖維細胞在培養過程中貼壁黏附的速率存在較大差異，成纖維細胞貼壁較快，因此我們采用差速黏附處理方法，來分離去除大部分成纖維細胞成分；此外鑒于星形膠質細胞、少突膠質細胞和神經元等細胞的生長特性不同，神經元在體外不再分裂更難以傳代，而星形膠質細胞在體外的增殖速度遠大于少突膠質細胞，因而隨著原代培養時間的延長以及傳代培養的多次傳代，少突膠質細胞的比例越來越少，從而達到將星形膠質細胞與其他神經細胞分離的目的。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術存在的問題，改進當前體外分離和培養星形膠質細胞的方法，使之簡單易行，培養獲得的星形膠質細胞較純，生長良好，細胞增殖快，可多次傳代，可滿足各種細胞生物學實驗的需求。采用以下方案來實驗本發明的目的。一種體外分離和培養星形膠質細胞的方法，含有大腦皮質組織分離、組織細胞搗碎后篩網過濾、細胞原代培養、傳代培養、星形膠質細胞鑒定5個實驗步驟。一)大腦皮質組織分離
無菌條件下，用鑷子鑷取動物雙側大腦皮質置于盛有D-Hank’ s液的培養皿內，小心剝離腦膜和血管組織，將大腦皮質移至另一個盛有適量DMEM培養液的培養皿內。二)組織細胞搗碎后篩網過濾無菌條件下，剪碎大腦皮質成糜狀，在盛有DMEM培養液的培養皿內以不銹鋼篩網過濾，同時用注射器芯在不銹鋼篩網上進一步碾碎腦組織，濾液轉移至一無菌的玻璃培養瓶內。三)原代培養
培養瓶中加入適量DMEM培養液用吸管反復輕柔吹打制成單細胞懸液，加入終濃度為20%的小牛血清或胎牛血清，調整細胞密度為I. 0 X IO5個/ml，置37°C、5% CO2培養箱中差速粘附處理30 60分鐘，以去除成纖維細胞成分，然后翻轉培養瓶，吸取細胞懸液接種至預先以鼠尾膠原包被的玻璃培養瓶。最后置入37°C、5% CO2培養箱中培養，以后每隔2 3天換液并逐漸調整血清濃度為10%。在本步驟中采用的差速粘附技術，主要目的是部分去除貼壁較快的細胞如成纖維細胞。此外由于原代細胞生長比較緩慢，所以初始培養加入20%的小牛血清(高血清濃度也有助于細胞貼壁),在原代培養第3次換液時血清濃度可降為15%,在第I次傳代培養時(一 般是培養11天左右)，血清濃度可以降為10%，以后按此血清濃度培養直到第4次傳代。四)傳代培養
原代細胞培養到星形膠質細胞融合成單層并鋪滿瓶底后，即可傳代，棄瓶內舊培養液，用D-Hank’s液洗2次，然后加入0. 9ml 0. 25%的胰酶消化3 5分鐘左右，并在倒置顯微鏡下觀察膠質細胞的消化情況，待細胞變圓，并約有三分之二的細胞漂浮在液體中時，立即用等體質的小牛血清中止消化，防止胰酶消化過度而影響星形膠質細胞的活力，用吸管反復吹打培養瓶底部，盡可能將全部貼壁的星形膠質細胞吹打下來，再加入DMHM培養基，最后按照細胞密度約I. OX IO5個/ml，終濃度為10%的小牛血清，每瓶5ml接種至預先以鼠尾膠原包被的玻璃培養瓶，以后按這種方法繼續傳至第4代，用于后續實驗。五)星形膠質細胞鑒定
星形膠質細胞具有特殊的膠質原纖維，由膠質纖維酸性蛋白(GFAP)組成，純化培養的星形膠質細胞通過兔抗GFAP多克隆抗體免疫細胞化學染色(ABC法)鑒定。將第4次傳代后的星形膠質細胞按I. OX 105個/cm2的密度種植在多孔培養板內，孔內預先放有涂鼠尾膠原的蓋玻片，37°C、5% CO2培養箱孵育24小時后，進行GFAP染色鑒定，顯微鏡下觀察染色情況，以出現陽性染色而背景不著色為準，中性樹膠封片后在顯微鏡下計數并拍照。本發明較現有技術具有以下特點和優勢1)細胞分離與原代培養時不用胰酶消化，減少了胰酶消化過度對細胞的損傷；2)篩網過濾，將細胞團分散成單個細胞；3)采用差速粘附處理，可以去除大部分成纖維細胞成分，因為成纖維細胞貼壁較快；4)傳代培養時不用搖床震蕩，大大了縮短實驗時間；5)原代和傳代培養時采用涂有自制鼠尾膠原的培養瓶，試劑成本低，但可以達到同樣的實驗效果(鼠尾膠原與文獻中報道的多聚賴氨酸作用類似，主要是起到促進細胞貼壁的作用，但是前者的成本遠遠低于后者);6)經過4次傳代培養，基本上可以去除其它神經細胞，達到純化星形膠質細胞的目的；7)傳代培養過程中每次換液及傳代前，用D-Hank’ s液洗培養瓶，以反復去除貼壁較慢的其它神經細胞；8)每次實驗操作時間短，I 2小時完成；9)實驗費用低，所需試劑、儀器設備少。這種改進的星形膠質細胞培養方法及實驗參數是根據多年的實驗研究摸索獲得，采用該方法獲得星形膠質細胞經GFAP免疫組化染色鑒定其純度達95%以上，完全符合實驗要求。此外，當前國內外星形膠質細胞的培養方法所需儀器設備較多，而且實驗耗用時間較長，而本室改進的星形膠質細胞培養方法，實驗所需器材及儀器設備較少，實驗操作時間較短，所需藥品少，培養的星形膠質細胞完全符合實驗要求，其科學性和實驗結果的可靠性屬國內領先水平，為神經學科研究提供了基本的實驗模型，為神經細胞再生功能研究以及缺氧、藥物等因素對星形膠質細胞影響的研究提供了基本的實驗模型。我室以前采用該法培養的星形膠質細胞，對其功能研究發現了許多已知和未知基因在應激過程中表達出現明顯變化。實驗證明本方法可用于胎鼠、新生大鼠、小鼠、豚鼠等相對脆弱的組織，如大腦皮質星形膠質細胞等的培養，實驗方案一致。但對于成年人類來說，由于大腦皮層組織比較堅韌，用此法難以達到目的。但實驗表明取材引產胎兒的大腦皮層組織，采用本方法也能達到相同的效果，以胎齡5個月最為合適。實驗中應注意以下操作1)每次傳代用胰酶消化細胞時，要把握消化的程度，既不能消化過度，又不能消化不完全，待約有三分之二的細胞變圓并懸浮在消化液時，應立即用小牛血清終止消化，避免消化過度而影響星形膠質細胞活力，消化不完全時由于部分細胞仍然貼壁而致細胞數量不足；2)用吸管在培養瓶內的吹打要徹底，將培養瓶底每一個角落的細胞都要吹下，避免瓶底角落部位的細胞未吹下也致細胞數量不足。


圖I顯微鏡放大100倍觀察星形膠質細胞GFAP免疫組化染色鑒定結果。圖2顯微鏡放大400倍觀察星形膠質細胞GFAP免疫組化染色鑒定結果。
具體實施例方式以下內容是本發明一種星形膠質細胞培養方法的具體實施例，以使得本領域的技術人員可以更好的理解本發明并能予以實施。但需要說明的是，本發明方法絕不局限于所舉的實施例。實施例I :大鼠星形膠質細胞分離和培養
實驗動物新生I 3天的SDf 2只(中南大學湘雅醫學院實驗動物中心提供)，雌雄不限。主要試劑及儀器DMEM (Hyclone公司)，胰蛋白酶(AMERESC0公司)，新生牛血清(杭州四季青公司)，兔抗GFAP多克隆抗體(Sigma公司)，羊抗兔IgG試劑盒(Vector公司),D-Hank’s液(按配方自制),鼠尾膠原(自制)，C02培養箱(FormaScientific公司),倒置顯微鏡(Olympus公司)。原代培養取新生I 3天的SD乳鼠，用75%乙醇浸泡5 10分鐘消毒皮膚，斷頭，無菌條件下用眼科剪小心剪開頭骨后，再用眼科鑷取出雙側大腦皮質置于盛有D-Hank’ s液的培養皿內，小心剝離腦膜和血管組織，將大腦皮質移至另一個盛有適量DMEM培養液的培養皿內，剪碎大腦皮質成糜狀，以不銹鋼網(孔徑200i!m)過濾，同時用玻璃注射器芯進一步碾碎腦組織，轉移至一個未包被鼠尾膠原的玻璃培養瓶內，加入適量DMEM培養液用吸管反復輕柔吹打制成單細胞懸液，加入終濃度為20%的新生小牛血清，調整細胞密度為I. OX IO5個/ml，置37°C、5% CO2培養箱中差速粘附處理30 60分鐘，以去除成纖維細胞成分，然后翻轉培養瓶，吸取細胞懸液5ml接種至預先以鼠尾膠原包被的玻璃培養、瓶。最后置入37°C、5% CO2培養箱中培養，以后每隔2 3天換液并逐漸調整血清濃度為10%，培養9 14天并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞融合成單層并鋪滿瓶底后，進行消化傳代。傳代培養原代細胞培養到星形膠質細胞融合成單層并鋪滿瓶底后，即可傳代，棄瓶內舊培養液，用D-Hank’ s液洗2次，然后加入0. 9ml 0. 25%的胰酶消化3 5分鐘左右，并在倒置顯微鏡下觀察膠質細胞的消化情況，待細胞變圓，并約有三分之二的細胞漂浮在液體中時，立即用等體質的小牛血清中止消化，防止胰酶消化過度而影響星形膠質細胞的活力，用吸管反復吹打培養瓶底部，盡可能將全部貼壁的星形膠質細胞吹打下來，再加入DMEM培養基，最后按照細胞密度約I. OX IO5個/ml，終濃度為10%的小牛血清，每瓶5ml接種至預先以鼠尾膠原包被的玻璃培養瓶，以后按這種方法繼續傳至第4代，用于后續實驗。星形膠質細胞的鑒定星形膠質細胞具有特殊的膠質原纖維，由膠質纖維酸性蛋白(GFAP)組成，純化培養的星形膠質細胞通過兔抗GFAP多克隆抗體免疫細胞化學染色 (ABC法)鑒定。將第4次傳代后的星形膠質細胞按I. OX IO5個/cm的密度種植在6孔培養板內，孔內預先放有涂鼠尾膠原的蓋玻片，37 °C、5 % CO2培養箱孵育24小時后，進行GFAP染色鑒定，顯微鏡下觀察染色情況，以出現陽性染色而背景不著色為準，中性樹膠封片后在顯微鏡下計數并拍照。結果
原代培養結果膠質細胞原代培養，一般在2 3天貼壁，有較好的折光性。換培養液后繼續培養，可見部分細胞長出細小的胞突，隨著培養時間的延長，培養物中星形膠質細胞的比例越來越大而少突膠質細胞等其它細胞比例越來越少，至9 14天時，倒置顯微鏡下可見少量的少突膠質細胞、成纖維細胞和大量的星形膠質細胞鋪滿培養瓶底部并融合成單層，這時可以對星形膠質細胞進行傳代。傳代培養結果星形膠質細胞融合成單層并鋪滿培養瓶底時進行第I次傳代培養，傳代后細胞生長更活躍，一般培養5 7天細胞就鋪滿瓶底，細胞傳至第4代后倒置顯微鏡下主要為形狀不規則，胞漿豐富且核漿比較少，胞體分支多，細胞核為橢圓形，常偏于胞體一側的星形膠質細胞。星形膠質細胞的鑒定結果星形膠質細胞傳代到第4代時應用兔抗GFAP多克隆抗體免疫細胞化學染色鑒定培養細胞，陽性細胞染成棕黃色，陽性率95%以上，證實絕大多數細胞為星形膠質細胞，見圖I、圖2。實驗證明，取材I 3天的大鼠，原代培養9 14天后進行傳代，有利于星形膠質細胞進一步純化。實驗結果顯示，新生大鼠大腦皮質進行體外培養時，大多數神經元在2 3天死亡，隨著培養時間延長，星形膠質細胞貼壁并相互融合，而少突膠質細胞等其它細胞由于生長緩慢、無法融合而懸浮在星形膠質細胞之上，經過換液及多次傳代被去除。GFAP免疫組化染色鑒定星形膠質細胞純度達95%以上，基本上達到了純化的目的，可滿足神經生物學實驗的要求。實施例2 :其他動物星形膠質細胞分離和培養
實驗證明本方法可用于胎鼠、新生(出生1-3天)大鼠、小鼠、豚鼠等相對脆弱的組織，尤其是大腦皮質星形膠質細胞等的培養，實驗方案同上。但對于成年人類來說，由于大腦皮層組織比較堅韌，用此法難以達到目的。但實驗表明取材引產胎兒的大腦皮層組織，采用本方法也能達到相同的效果，以胎齡5個月最為合適，胎齡過小 或過大均影響實驗結果。采用本方法分離培養的星形膠質細胞純度達95%以上。
權利要求
1.一種星形膠質細胞分離和培養方法，其特征在于 a)含有大腦皮質組織分離、組織細胞搗碎后篩網過濾、細胞原代培養、細胞傳代培養4個實驗步驟； b)大腦皮質組織分離為在無菌條件下，用鑷子鑷取動物雙側大腦皮質置于盛有D-HankJ s液的培養皿內，小心剝離腦膜和血管組織，將大腦皮質移至另一個盛有適量DMEM培養液的培養皿內； c)組織細胞搗碎后篩網過濾為在無菌條件下，剪碎大腦皮質成糜狀，在盛有DMEM培養液的培養皿內以不銹鋼網過濾，同時用注射器芯在不銹鋼網上進一步碾碎腦組織，濾液轉移至一無菌的玻璃培養瓶內； d)細胞原代培養是在培養瓶中加入DMEM培養液和終濃度為20%的小牛血清，調整細胞密度為I. 0X105個/ml，置溫度37°C和C02濃度5%的培養箱中差速粘附處理30 60分鐘，然后翻轉培養瓶，吸取細胞懸液接種至預先以鼠尾膠原包被的玻璃培養瓶，最后置入溫度37°C和CO2濃度5%培養箱中培養，以后每隔2-3天換液并逐漸調整血清濃度為10%; e)細胞傳代培養是在培養到星形膠質細胞融合成單層并鋪滿瓶底后，棄瓶內舊培養液，用D-Hank’ s液洗2次，然后加入0. 9ml 0. 25%的胰酶消化3_5分鐘，待細胞變圓并有2/3的細胞漂浮在液體中時，立即用等體質的小牛血清中止消化，用吸管反復吹打培養瓶底部，將全部貼壁的星形膠質細胞吹打下來，再加入DMEM培養基和終濃度為10%的小牛血清，最后接種至預先以鼠尾膠原包被的玻璃培養瓶。
2.根據權利要求I所述的一種星形膠質細胞分離和培養方法，其特征在于步驟d)所述的細胞原代培養初始加入終濃度為20%小牛血清或胎牛血清，然后在細胞原代培養第3次換液時小牛血清或胎牛血清濃度降為15%，隨后在步驟e)第I次傳代培養時小牛血清或胎牛血清濃度降為10%。
3.根據權利要求I所述的一種星形膠質細胞分離和培養方法，其特征在于步驟c)所述的不銹鋼網孔徑為200 u m。
4.根據權利要求I所述的一種星形膠質細胞分離和培養方法，其特征在于還含有星形膠質細胞鑒定的步驟。
5.根據權利要求4所述的星形膠質細胞鑒定的步驟，其特征在于星形膠質細胞鑒定采用兔抗GFAP多克隆抗體免疫細胞化學染色方法。
6.根據權利要求5所述的星形膠質細胞鑒定的步驟，其特征在于多孔板孔內預先放置涂有鼠尾膠原的蓋玻片。
7.根據權利要求I所述的一種星形膠質細胞分離和培養方法，其特征在于用于胎鼠、新生大鼠、小鼠、豚鼠大腦皮質星形膠質細胞的培養。
8.根據權利要求I所述的一種星形膠質細胞分離和培養方法，其特征在于用于引產胎兒大腦皮質星形膠質細胞的培養。
9.根據權利要求8所述的一種星形膠質細胞分離和培養方法，其特征在于所述引產胎兒胎齡為5個月。
全文摘要
一種星形膠質細胞分離和培養方法，能適用于多種實驗動物以及人類。本方法主要是針對現有技術存在的問題，改進當前體外分離和培養星形膠質細胞的方法，含有大腦皮質組織分離、組織細胞搗碎后篩網過濾、細胞原代培養、傳代培養、星形膠質細胞鑒定5個實驗步驟，整個實驗簡單易行，通過本方法培養獲得的星形膠質細胞純度能達到95%以上，且生長良好，細胞增值快，可多次傳代，能滿足各種細胞生物學實驗的需求。
文檔編號C12N5/079GK102703387SQ20121022354
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月2日 優先權日2012年7月2日
發明者劉發益, 鄔力祥, 黃柏勝 申請人:黃柏勝