專利名稱：使用bmi-1使星形膠質細胞去分化成為神經干細胞的制作方法
技術領域：
神經干細胞(NSCs)是神經系統的祖細胞的亞型，它具有分化為星形膠質細胞、少 突膠質細胞和神經元的能力。從中樞神經系統(CNS)和外周神經系統(PNS)開始，神經干 細胞形成多細胞神經球，它們在各自的背景條件下分化為膠質系和神經系細胞(Sally Temple等人，2001)。這些神經干細胞用于治療不治之癥，并且研究其作為細胞治療的 潛在方法。由于神經干細胞是幾乎不會產生倫理問題的成體干細胞，所以對其進行了廣 泛研究。近來進行的關于去分化的熱點研究強化了成體干細胞的重要性。成體干細胞比 胚胎干細胞更容易獲得，但是在其實際應用上仍有許多困難。此外，使用他人的成體干 細胞時，免疫排斥反應也是一個問題。因此，使用病人自身的細胞誘導去分化可以解決 當前的問題。為了這個目的，必須誘導已經分化了的細胞去分化。現在，正在進行廣泛 研究以使用例如細胞融合和核移植的方法來誘導去分化。在使用不同方法的另 一個研究 組中，Alexis J.報道了從皮膚中分離的細胞在神經干細胞培養條件下培養時具有神經干 細胞的特性(Lancet2004)。此外，ToruK.成功使少突膠質細胞前體去分化成為神經干細 胞(Genes & Development 2004)。這個研究組自加00年起已經發表了關于此問題的文章， 并且在2004年的 一篇文章中報道了各階段的基因表達與染色質重塑和組蛋白修飾有關。
背景技術：
在本發明中，提出了一種解決前述所介紹方法的問題的途徑，并且建立了一種適 合的新使用方法。在本發明中，選擇和過表達了一種已知調節NSCs性能的轉錄因子來 研究分化為神經干細胞。被選擇的因子，鑒定為"Bmi-l",是用于調節組蛋白修飾和細 胞周期調節子的蛋白質之一(JanW.等人，1999)。據報道Cdkn2a/INK4A基因座是Bmi-l 的輩巴點。Bmi-l已知為該靶基因的轉錄抑制子。近來，Bmi-l基因已報道在神經干細胞 中表達且在神經干細胞的自我更新中起重要作用(Anna V. M.等人，2003, 2005, In-Kyoung Park等人，2004)。
本發明者在此背景下進行了深入和徹底的研究，從而發現了其中Bmi-l的過表達 會誘導已分化的星形膠質細胞去分化成為能夠自我更新和分化為星形膠質細胞、神經元
和少突膠質細胞的神經干細胞樣的細胞，從而導致本發明。
發明內容
本發明的目的是提供誘導星形膠質細胞去分化成為神經干細胞的組合物，包含 Bmi-l蛋白質或含有編碼Bmi-1蛋白質的核苷酸序列的核酸材料。
本發明的另 一個目的是提供了 一種誘導星形膠質細胞去分化成為神經干細胞的方 法，包含用Bmi-l蛋白質或含有編碼Bmi-l蛋白質的核苷酸序列的核酸材料處理星形膠 質細胞。
本發明的另 一個目的是提供使用此方法制備的神經干細胞。
本發明的另一個目的是提供一種將去分化的神經干細胞分化為星形膠質細胞、少 突膠質細胞和神經元的方法。
附圖簡述
本發明的上述和其它目的、特征和其它優點將從以下的詳細描述并參考附圖得到 更清楚地理解，其中
圖1顯示了用免疫細胞化學分析的Bmi-l靶pl6^^和pl9M的過表達；
圖2顯示了誘導的去分化，其中顯示了球形成(A)和直接球形成(B)(當在適合于神 經干細胞的條件下培養單細胞時形成直接球而僅在適合于星形膠質細胞的培養條件下 貼附后在適合于神經干細胞在的條件下培養單細胞時形成球，且穩定12小時)；
圖3顯示了(a)用免疫細胞化學分析的神經干細胞標記物的表達，其中分化為神經 干細胞(A至C)和神經千細胞樣的細胞(D至F);
圖4顯示了用RT-PCR檢測的神經干細胞特異性標記物的表達(Ast:星形膠質細胞、 NSC:神經干細胞、Ast-Bmi-l:星形膠質細胞+Bmi-l、 NSCLC:神經干細胞樣的細胞)； 和
圖5顯示了神經干細胞(A-C)和神經千細胞樣的細胞(D-G)體外分化為星形膠質細 胞、少突膠質細胞和神經元。
實現本發明的最佳形式
本發明的 一個方面涉及能夠誘導星形膠質細胞去分化成為神經干細胞的組合物，
它包含Bmi-l蛋白質或含有編碼Bmi-l蛋白質的核普酸序列的核酸材料。
如本文所用的術語"神經千細胞樣的細胞"表示多能干細胞，由能分化為星形膠
質細胞、少突膠質細胞和神經元的體細胞去分化而來。在本發明中，神經干細胞樣的細
胞還描述為神經干細胞。
在本發明中新近公開當Bmi-l過表達時，即使已經分化，星形膠質細胞也可以去
分化成為多能神經干細胞樣的細胞。
在本發明中，Bmi-l以蛋白質或編碼Bmi-1蛋白質的核酸的形式提供。 只要是來源于哺乳動物例如人、馬、綿羊、豬、山羊、駱駝、羚羊和狗，任何Bmi-l
可用于本發明的組合物中。此外，本發明的用來去分化成為神經細胞的Bmi-l蛋白質可
以是它的野生型或變異體。
術語"Bmi-l蛋白質變異體"涉及自然或人工產生的Bmi-l蛋白質，其中Bmi-l
蛋白質在氨基酸序列上由于氨基酸的缺失、插入、非保守置換或保守置換或其組合而與
野生型不同。變異體是具有與天然蛋白質具有相同生物活性的功能同等物，盡管它們的
物理和/或化學性質有變化。優選地，變異體增強了對物理和化學環境的結構穩定性或生
理活性。
在本發明的一個優選實施方案中，Bmi-l是包含編碼Bmi-l蛋白質的核苷酸序列 的核酸材料的形式。
編碼Bmi-l蛋白質的核香酸序列是其野生型或變異體，其中天然產生或人工合成 的變異體由于堿基的缺失、插入、非保守置換或保守置換或它們的組合在氨基酸序列上 與野生型不同。
編碼Bmi-l蛋白質的核苷酸序列可以是包括DNA分子(基因組，cDNA)或RNA分 子的單鏈或雙鏈。
本發明的一個優選實施方案中，含有編碼Bmi-l蛋白質的核苷酸序列的核酸材料 是允許Bmi-l蛋白質表達的載體。
如本文所用的術語"載體"涉及含有DNA序列的DNA構建體，所述DNA序列 可操作性的連接于能夠影響所述DNA在適合的宿主細胞中表達的調控序列上。
如本文所用的術語"可操作性的連接"涉及核酸表達調控序列和編碼靶蛋白質的 第二核酸序列間的功能性連接從而能完成一般的功能。與重組載體的可操作性的連接可
使用本領域眾所周知的基因重組技術制備，并且位點特異的DNA斷裂和連接可使用本 領域公知的酶進行。
適合于本發明使用的載體包括信號序列或用于膜定向或分泌的引導序列和表達調 控元件，例如啟動子、操縱子、起始密碼子、終止密碼子、多腺香酸化信號和增強子， 并且可根據它們的目的構建成多種形式。載體的啟動子可以是組成型或是誘導型。此外， 表達載體包括選擇性的標記物，所述標記物允許選擇含有載體的宿主細胞，并且可復制 的表達載體包括復制起始點。此載體可以是自我復制的，或者可以是整合至宿主細胞的 DNA上。
能在本發明中使用的載體可以是質粒載體、粘粒載體或病毒載體，優選病毒載體。 病毒載體的實例包括但是不限制于來源于逆轉錄病毒例如HIV(人免疫缺陷病毒)、 MLV(鼠白血病病毒)、ASLV(禽肉瘤病毒)、SNV(脾壞死病毒)、RSV(勞斯肉瘤病毒)、 MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)等等、腺病毒、腺伴隨病毒和單純皰滲病毒的載體。在本發明 的一個實際實施例中，使用pBabepuro載體，它來源于基于莫洛尼氏白血病病毒的病毒 載體，攜帶嘌呤霉素的選擇性標記。
含有編碼Bmi-1蛋白質的核苦酸序列的核酸材料可以以載體的形式作為棵露DNA (Wolff等人,Science, 247: 1465-8, 1990; Wolff等人,J. Cell Sci. 103: 1249-59, 1992),或在 脂質體或陽離子聚合物的幫助下引入細胞。為了在基因轉染中使用，脂質體是陽離子磷 脂例如DOTMA和DOTAP制成的磷脂膜。當與負電荷核香酸以一定比例混合時，陽離 子脂質體形成核酸-脂質體復合物。
在本發明的另一個優選實施方案中，含有編碼Bmi-l蛋白質的核苷酸序列的核酸 材料可以是其中表達Bmi-l蛋白質的病毒。
如本文所用的術語"病毒"涉及用攜帶編碼Bmi-l蛋白質的核苷酸序列的病毒載 體轉化或轉染包裝細胞而制備的Bmi-l表達病毒。
根據本發明的Bmi-l表達病毒的制備中所使用的病毒實例包括但是不限于逆轉錄 病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和單純皰滲病毒。優選逆轉錄病毒。在以下實施例中，Bmi-l 表達病毒通過將攜帶編碼Bmi-l蛋白質(pBabe puro Bmi-l)的核苷酸序列的重組pBabe puro載體轉化至PT67包裝細胞中制備。
本發明的另一方面涉及星形膠質細胞去分化成為神經干細胞的方法，包含用Bmi-l
蛋白質或含有編碼Bmi-1蛋白質的核苦酸序列的核酸材料處理。
更詳細地，此方法包含步驟(i)在培養基中培養星形膠質細胞；(ii)用Bmi-l蛋白質 或含有編碼Bmi-l蛋白質的核苷酸序列的核酸材料處理培養基；和(iii)誘導星形膠質細 胞去分化成為神經干細胞。
任何用于培養神經干細胞的常規培養基可以用作在步驟(i)中星形膠質細胞的培養 基。培養基通常含有碳源、氮源和微量元素組分。此外，培養基可包括抗生素，例如青 霉素、鏈霉素和慶大霉素。培養基優選含有bFGF。
步驟(ii)中用于處理細胞的Bmi-l蛋白質或含有編碼Bmi-l蛋白質的核苷酸序列的 核酸材料如上所述。
本發明的另 一方面涉及用前所述方法制備的神經干細胞。
已證實通過根據本發明的去分化制備的神經干細胞表達同樣水平的神經干細胞特 異性標記物巢蛋白、CD133和Sox2，并且具有與一般神經干細胞相同的分化能力。通 過根據本發明的去分化制備的神經干細胞還顯示了自我更新特征。
本發明的另 一方面還涉及根據前述方法的去分化得到的神經干細胞分化成為星形 膠質細胞、少突膠質細胞和神經元的方法。
當使用本發明的組合物和方法去分化的神經干細胞被置于各自分化的條件下時， 分化為星形膠質細胞、神經元和少突膠質細胞可通過檢測特異于各自細胞的標記物表達 來監測。
本發明的更好理解可通過以下實施例獲得，它們用于理解而不用于限制本發明。 實施例1:實驗方法
1.鼠星形膠質細胞和鼠神經干細胞的培養
分離自E13.5 CNS的鼠星形膠質細胞在適當的條件下培養。它們在補充 10%FBS(HyClone)、 1%青霉素/鏈霉素和1％ L-谷氨酰胺(Cambrex)的改良的Eagle's培 養基(DMEM(高糖，HyClone》中培養前用胰島素處理(Gibco0.05。/。)。從第二天起，每天 用新鮮培養基更換一次培養基。使用一代和三代間的細胞。神經千細胞分離自鼠(E13.5) 并且作為對照在補充B27血清取代(Gibco)、人重組堿性FGF和人重組EGF(R&D)、含 有胰島素(Sigma)、轉鐵蛋白(Sigma)、硒(Sigma)、孕酮(Sigma)和青霉素/鏈4素(Cambrex)
的Dulbecco，改良的Eagle's培養基/F12(DMEM/F12, Gibco)中培養。
2. 逆轉錄病毒介導的感染
pBabe puro Bmi-l(用插入人Bmi-l(NCBI登記號L13689NMJ)24865)至pBabe puro 載體中制備)和pBabe puro使用Lipofectamine(Invitrogen)轉染至PT67包裝細胞抹 (Clontech)中且在嘌呤霉素(3嗎/ml)(BD science)存在下選擇。轉化細胞林生長至90%或更 高覆蓋度(confluency)后，上清液通過濾器(0.45jim)(MilUpore)以除去細胞碎片，然后 使上清液重復感染星形膠質細胞，使用凝聚胺(polybrene(Sigma)在間隔10小時時進行分 離。隨后在。票呤霉素(0.5叱/ml)存在下進行選擇。
3. 蛋白質印跡分析和半定量PCR
使用RIPA緩沖液使全部的細胞提取物從細胞中分離出來，隨后用Branford檢測法 (Bio-md)確定其中的蛋白質濃度。每50路的細胞提取物進行10%或4~12%預制 SDS-PAGE(Invitrogen)。由此將被分離的蛋白質轉移至PVDF膜(Millipore)上且用3 ~ 5% 脫月旨乳TBST封閉。用anti-Bmi-l(Upstate)、 anti-pl6^K4A(Santacruz)、 anti-pl9^F(Novous) 和a-微管蛋白(sigma)在4"C振動過夜培養，隨后與HRP綴合的抗鼠IgG、抗兔IgG(Zymed) 在室溫反應。Supersignal West Pico試劑盒(Pierce)用于檢測。
使用Trizol(Invitrogen)使全部RNA從每個細胞林中分離處來。在寡聚 d(T)12-18-mer(Invitrogen)存在下使用Superscriptase II逆轉錄酶(Invitrogen)從500ng總 RNA中合成cDNA。用1^1 cDNA在lOpmol每個適合的引物存在下用PCR預先混合液 (1U Tag DNA聚合酶、250pM dNTPs、 lOmM Tris-HCl、 40mM KC1和1.5mM MgCl2 Bioneer, Korea)進行RT-PCR。用于RT-PCR的引物適合于擴增鼠標記物GAPDH、巢蛋 白和Sox2,它們的堿基序列如下顯示。 用于鼠GAPDH的引物
正向5，-GATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG墨3， (SEQ ID NO.:l) 反向5'-GTTGCTGTAGCCGTATTCATTGTC-3' (SEQ ID NO. :2) 用于鼠巢蛋白的引物
正向5'-GGCATCCCTGAATTACCCAA-3' (SEQ ID NO.:3) 反向5，-AGCTCATGGGCATCTGTCAA-3' (SEQ ID NO.:4) 用于鼠sox2的引物
正向5'-AGTGGTACGTTAGGCGCTTC-3' (SEQ ID NO.:5) 反向5，-TGCCTTAAACAAGACCACGA-3， (SEQ ID NO. 6)
4. 誘導去分化
在與用于神經干細胞的相同的培養條件下誘導去分化。細胞培養使用兩種不同的 方法來進行。細胞以1\105個細胞/孔的密度接種于6孔板上并培養12小時，隨后將培 養基換為補充B27無血清(Gibco)、人重組堿性FGF和人重組EGF(R&D)、含有胰島素 (Sigma)、轉鐵蛋白(Sigma)、竭(Sigma)、孕酮(Sigma)和青霉素/鏈霉素(Cambrex)的新鮮 Dulbecco's mod迅ed Eagle's培養基/F12(N2)(DMEM/F12, Gibco)。細胞每天用bFGF處 理，且培養基每隔一天一次換為新鮮培養基。或者，已在適當條件下培養的細胞用胰蛋 白酶作用且以3xl05個細胞的密度接種至60mm細菌培養平板上。補充B27無血清 (Gibco)、人重組堿性FGF和人重組EGF(R&D)、含有胰島素(Sigma)、轉鐵蛋白(Sigma)、 硒(Sigma)、孕酮(Sigma)和青霉素/鏈霉素(Cambrex)的新鮮Dulbecco's modified Eagle's培 養基/F12(N2)(DMEM /F12, Gibco)用作培養基。
5. 通過免疫細胞化學測定過表達和各自的標記物
用4%多聚曱醛(EMS)在4°C固定1小時后，神經球在20%蔗糖中振動培養過夜。 然后，神經球使用OCT化合物超低溫冷藏于8孔小室載玻片(Nunc)中且在染色前切成 8 ~ 10pm厚。用含有10%正常羊血清(Jackson ImmunoResearch) + 0.1%BSA (Sigma) + 0.3%Triton X-100 (Sigma)的PBS封閉后，切片用抗-巢蛋白(Chemicon)、抗-CD133 (MACS) 和抗-Sox2 (Sigma)在4。C培養過夜然后用抗-小鼠-cy3 (Jackson ImmunoResearch)、抗-兔 -FITC(分子探針Molecular probe)和抗-山羊-cy3 (Zymed)室溫培養，最后用DAPI(Sigma) 核染色。蔡司共焦透鏡(confocal lens )(卡爾蔡司Carl Zeiss)用于染色后的檢查。分化 的細胞以與上述相同的方式染色。在這方面，抗-GFAP(Dako)、抗-S100p (Zymed)、抗-卩-微管蛋白III (Covance)、 抗-Map2a (Sigma)、抗-TH (Sigma)、抗-04 (R&D)和抗-CNPase (Chemicon)用作抗體。
6. 體外分化
用PLO (聚L-鳥氨酸)(Sigma)和層粘連蛋白或纖維結合素(Sigma)包被后，細胞在下 面給出的分化條件下培養。
為了 '分化成為星形膠質細胞，細胞培養在補充10%FBS(HyClone)的
DMEM(HyClone,高糖)中在人重組bFGF和EGF(R&D)或CNTF(重組大鼠睫狀節神經 細胞營養因子)(Upstate)存在下進行5 ~ 7天。
通過在含有N2和B27無血清、補充人重組FGF的培養基中培養細胞4天然后在 無FGF培養基中培養8天誘導其分化為神經元。或者，細胞在1 ~ 10pm RA(維曱酸， Sigma)作為分化誘導劑存在下培養7 ~ 14天。作為其它選擇，細胞在1 ~ 10mM VPA(丙 戊酸，Sigma)和1 ~ 10pm RA(維曱酸，Sigma)的共存在下培養7 ~ 14天以誘導分化成為 神經元。
通過在補充B27無血清的N2培養基中在PDGF-AA(血小板衍生生長因子-AA， R&D)、 T3(3,3,5-三碘-L-曱腺原氨酸，Sigma)、人重組堿性FGF和EGF(R&D)的存在下 培養誘導分化為少突膠質細胞。
當在前述分化條件下培養時，監測細胞的形態學和使用特異于各自分化標記物的 抗體進行免疫細胞化學以檢測分化是否正確進行。
實施例2:結果
Bmi-1基因使用逆轉錄病毒載體轉導系統在已分化的小鼠星形膠質細胞中過表達。 當Bmi-1靶基因pl6旨"和pl9^不表達時Bmi-l基因的過表達通過蛋白質印跡分析證 實(圖1)。
然后，使用用于培養神經干細胞的條件誘導去分化。星形膠質細胞以1><105個細 胞/孔的密度接種于6孔板上，12小時后，細胞在適合于神經干細胞的條件下培養。培 養3-4天內，觀察到細胞具有神經干細胞樣的形態。當細胞以3xl05個細胞/板的密度接 種于60mm細菌平板上且在與神經干細胞相同的條件下培養時，還觀察到它們具有神經 干細胞的形態。相反，當培養用對照載體pBabepuroEGFP轉染的細胞時，沒有形成神 經球(圖2)。在第6天，觀察到神經球具有與當神經干細胞轉移至新平板和在其上培養 時相同的形態。為了檢測用Bmi-l基因去分化的細胞是否能夠自我更新，進行亞球 (subsphere)形成檢測。結果是一周后在單細胞中形成了球(數據未列出)。
為了發現這些細胞是否具有與神經干細胞相同的特性，使用各自的標記物進行免 疫細胞化學。在這方面，主要大量表達于神經千細胞的標記物巢蛋白、CD133和Sox2 還在染色后在神經干細胞樣的細胞中觀察到。此外，因此形成的神經球的冷凍切片確證 了巢蛋白、CD133和Sox2的表達(圖3)。
此外，通過RT-PCR分析，均表達于神經干細胞的巢蛋白和Sox2發現表達于根據 本發明的去分化的細胞中。因此，判斷根據本發明去分化的細胞是神經干細胞樣的細胞 (圖4)。
為了檢測神經干細胞樣的細胞是否能像神經干細胞一樣進行分化，以與上述相同 的方式誘導分化為星形膠質細胞、少突膠質細胞和神經元。通過用針對各自標記物的特 異性抗體的分析，發現神經千細胞樣的細胞像神經干細胞一樣分化為細胞的三種類型。 用GFAP和S100的表達來鑒別分化為星形膠質細胞，用(3-微管蛋白III(Tujl)和Map2a 的表達鑒別分化為神經元，和用04和CNPOase的表達來鑒別分化為少突膠質細胞(圖 5)。
總之，通過此研究獲得的數據說明Bmi-1基因在將星形膠質細胞去分化為神經干 細胞樣的細胞中起著重要作用，并且這些去分化的神經干細胞樣的細胞可以分化回星形 膠質細胞、少突膠質細胞和神經元。
工業應用
如前描述，Bmi-l在誘導星形膠質細胞去分化成為神經干細胞中是有用的，并且 去分化的神經干細胞可用于多種疾病的治療。
現有技術的文獻目錄
1. Toru Kondo, Martin Raff. Chromatin remodeling and histone modification in the conversion of oligodendrocyte precursors to neural stem cells. Genes & Development 2004 年;l 8: 2963-2972
2. Alexis Joannides, Phil Gaughwin, Chistof Shwiening, Henry Majed, Jane Sterling, Alastair Compston, Siddharthan Chandran. Efficient generation of neural precursors from adult human skin: astrocytes promote neurogenesis from skin-derived stem cells. Lancet 2004 年;363:172-178
4. Anna V. Molofsky, Ricardo Pardal, Toshihide Iwashita, In-Kyung Park,Michael F. Clarke & Sean J. Morrison. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation Nature 2003年；425:962-967
5. Jacqueline J丄.Jacobs, Blanca Scheijen, Jan-Willem Voncken, Karin Kieboom, Anton Bems, and Maarten van Lohuizen. Bmi-1 collaborates with c-Myc in tumorigenesis by inhibiting c-Myc-induced apoptosis via INK4a/ARF Genes & Development 1999 年;13:2678-2690
6. Si'lvia Bea， Frederic Tort, Magda Pinyol, Xavier Puig, Luis Hema'ndez, Silvia Hema'ndez, Pedro L. Fema'ndez, Maarten van Lohuizen, Dolors Colomer, and Elias Campo. BMI-1 Gene Amplification and Overexpression in Hematological Malignancies Occur Mainly in Mantle Cell Lymphomas. 2001年;61:2409-412
7. Dusan Zencak, Merel Lingbeek, Corinne Kostic, Meriem Tekaya, Ellen Tanger, Dana Hornfeld, Muriel Jaquet, Francis L. Murder, Daniel F.Schorderet, Maarten van Lohuizen, and Yvan Arsenijevic. Bmil Loss Produces an Increase in Astroglial Cells and a Decrease in Neural Stem Cell Population and Proliferation.The Journal of Neuroscience 2005 年;25:5774-783
8. Carly Leung, Merel Lingbeek, Olga Shakhova, James Liu, Ellen Tanger, Parvin Saremaslani, Maarten van Lohuizen & Silvia Marino. Bniil is essential for cerebellar development and is overexpressed in human medulloblastomas Nature 2004年；428:337-341
9. Atsushi Iwama, Hideyuki Oguro, Masamitsu Negishi, Yuko Kato, Youhei Morita，Hiroko Tsukui, Hideo Ema， Takehiko Kamijo, Yuko Katoh-Fukui, Haruhiko Koseki,Maarten van Lohuizen, and Hiromitsu Nakauchi. Enhanced Self-Renewal of Hematopoietic Stem Cells Mediated by the Polycomb Gene Product Bmi-1 of transcriptional activators 2004年;21:843-851
10. Katalin Schlett and Emilia Madara'sz. Retinoic Acid Induced Neural Differentiation in a Neuroectodermal Cell Line Immortalized by p53 Deficiency. Journal of Neuroscience Research 1997年;47:405-15
11. Barbara Ahlemeyer, Eveline Baumgart-Vogt. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57B1/6J mice. Journal of Neuroscience Methods 2005年
12. Tomoya Kitayama, Masanori Yoneyama, Keisuke Tamaki, and Yukio Yoneda. Regulation of Neuronal Differentiation by N-Methyl-D-Aspartate Receptors Expressed in Neural Progenitor Cells Isolated From Adult Mouse Hippocampus Journal of Neuroscience Research 2004年:76:599-12
13. Yingwei Mao and Angel W.-M, Lee. A novel role for Gab2 in bFGF-mediated cell survival during retinoic acid-induced neuronal differentiation. The Journal of Cell Biology 2005年;170:305-16
14. Mireya Marin-Husstege， Michela Muggironi, Aixiao Liu， Patrizia Casaccia-Bonnefi. Histone Deacetylase Activity Is Necessary for Oligodendrocyte Lineage Progression. The Journal ofNeuroscience， 2002年;22:10333陽0345
15， Anna V. Molofsky, Shenghui He, Mohammad Bydon, Sean J. Morrison, Ricardo Pardal. Bmi-1 promotes neural stem cell self-renev/al and neural development but not mouse growth and survival by repressing the pl6Ink4a and pl9Arf senescence pathways. Genes & Development 2005年;19:1432-1437
16， Sopia W. M. bruggeman, Merel E. Valk丄ingbeek, Petra P.M. van der Stoop， Jacqueline J丄.,Jacobs, Karin kieboom, Ellen Tanger， Danielle Hulsman, Carly Leung, Yvan
Arsenijevic, Silvia Marino and Maarten van Lohuizen. Ink4a and Arf differentiallu affect cell proliferation and neural stem cell self-renewal in Bmi-l-deficient mice. Genes & Development 2005年;19:1438-1443
17. Kishi Y, Takahashi J, Koyanagi M, Morizane A, Okamoto Y, Horiguchi S, Tashiro K, Honjo T， Fujii S, Hashimoto N.. Estrogen promotes differentiation and survival of dopaminergic neurons derived from neural stem cells Journal of neuroscience research 2005 年;79:279-286
18. Hsieh J, Nakashima K, Kuwabara T, Mejia E, Gage FH, Histone deacetylase
2004年;101:16659-16664
19. Tarasenko YI, Yu Y, Jordan PM, Bottenstein J, Wu P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells Journal of neuroscience research 2004年；78:625-636
20. Ping Wu, Yevgeniy. Tarasenko, Yanping Gu, Li-Yen M. Huang, Richard E. Coggeshall and Yongjia Yu Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nature neuroscience 2005年；5:1271-1278
21. Hu X, Jin L, Feng L. Erkl/2 but not PI3K pathway is required for neurotrophin 3-induced oligodendrocyte differentiation of post-natal neural stem cells. Journal of Neurochemistry 2004年;90:1339-1347
22. In-Kyung Park, Sean J. Morrison, and Michael R Clarke. Bmil, stem cells, and senescence regulation. J.Clin. Invest. 2004年；113:175-179。
權利要求
1. 誘導星形膠質細胞去分化成為神經干細胞的組合物，包含Bmi-1蛋白質或含有編碼Bmi-1蛋白質的核苷酸序列的核酸材料。
2. 如權利要求l所述的組合物，其中所述的含有編碼Bmi-l蛋白質的核苷酸序列的 核酸材料是允許Bmi- l蛋白質表達的載體。
3. 如權利要求l所述的組合物，其中所述的含有編碼Bmi-l蛋白質的核苷酸序列的 核酸材料是表達Bmi-1蛋白質的病毒。
4. 如權利要求l所述的組合物，其中所述的去分化的神經干細胞具有分化為星形膠 質細胞、神經元和少突膠質細胞的能力。
5. 通過用Bmi-1蛋白質或含有編碼Bmi-1蛋白質的核苷酸序列的核酸材料處理星形 膠質細胞誘導星形膠質細胞去分化成為神經干細胞的方法。
6. 如權利要求5所述的方法，其中所述的去分化的神經千細胞具有分化為星形膠質 細胞、神經元和少突膠質細胞的能力。
7. 如權利要求5所述的方法，包含步驟(i) 在培養基中培養星形膠質細胞；(ii) 用所述的B邁i-l蛋白質或所述的核酸材料處理所述的星形膠質細胞；和(iii) 誘導所述星形膠質細胞分化為神經干細胞。
8. 如權利要求7所述的培養基，其中所述步驟(i)中的培養基中含有bFGF。
9. 神經干細胞，使用權利要求5所述的方法制備。
10. 使用權利要求5所述的方法所制備的神經干細胞分化為星形膠質細胞、神經元和 少突膠質細胞的方法。
全文摘要
本發明公開了使用Bmi-1誘導星形膠質細胞去分化成為神經干細胞的組合物和方法。去分化的神經干細胞具有分化為星形膠質細胞、神經元和少突膠質細胞的能力。
文檔編號C12N15/64GK101389761SQ200680053500
公開日2009年3月18日 申請日期2006年4月12日 優先權日2006年2月27日
發明者全恩暻, 劉承權, 劉承駿, 孟薩克, 尹炳善, 文哉喜, 樸圭萬, 郭成植, 金淇東, 金甫那 申請人:銀怎株式會社