專利名稱：葡萄潰瘍病菌快速檢測引物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一對葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum菌種快速分子檢測引物及
其應用。
背景技術：
葡萄潰瘍病(Grape Botryosphaeriaceae Canker)是由葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)真菌侵染引起的一種病害，近年來在世界范圍內危害日益加重， 在埃及、美國、匈牙利、意大利、葡萄牙、西班牙、南非和中國等14個國家均有發生并造成了嚴重的損失。目前，已知葡萄座腔菌科中的15個種能夠引起該病害(Auger J, EsterioM,Ricke G，et al. Black dead arm and basal canker of Vitis vinifera cv. Red Globecaused by Botryosphaeria obtusa in Chile [J]. Plant Disease. 2004, 88(11):1286.Niekerk J M，Fourie P H，Hallenn F，et al. Botryosphaeria spp.as grapevinetrunk disease pathogens [J]. Phytopathologia Mediterranea. 2006，45(4):43-54.U Rbez-Torres J R，Peduto F，Striegler R K，et al.Characterization of fungalpathogens associated with grapevine trunk diseases in Arkansas and Missouri[J].Fungal Diversity. 2012:1-21. U Rbez-Torres J R，Gubler W D.Pathogenicity ofBotryosphaeriaceae species isolated from grapevine cankers in California[J].Plant Disease. 2009，93 (6) : 584-592.)，在我國已發現并報道的葡萄潰瘍病病原菌有 Botryosphaeria dothidea、Lasiodiplodia theobromae 和 Diplodia seriata 三個種(Li X H，Yan JY, Kong F F，et al. Botryosphaeria dothidea causing canker ofgrapevine newly reported in China [J]. Plant Pathology.2010, 59 (6):1170. YanJ Y，Peng Y L，XieY，et al. First Report of Grapevine Trunk Disease Caused byBotryosphaeria obtusa in China[J]. Plant Disease. 2011, 95 (5):616. Yan J Y，Li XH，Kong F F，et al. Occurrence of Grapevine Trunk Disease Caused by Botryosphaeriarhodina in China[J] Plant Disease. 2011，95 (2):219.Yan JY, XieY, Yao S W, etal.Characterization of Botryosphaeria dothidea, the causal agent of grapevinecanker in China[J]. Australasian Plant Pathology. 2012，41:351-357.)。現階段對于病原菌真菌的鑒定，以常規的形態學鑒定為主，但由于葡萄潰瘍病菌種類繁多且種間形態差異較小，使得傳統鑒定方法耗時耗力，迫切需要現代分子技術手段解決該問題。近年來，以聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)技術為平臺的病原生物分子檢測技術，已被廣泛應用于動植物病害的診斷及病原菌的鑒定。但在葡萄潰瘍病菌檢測方面，國內至今還未有分子檢測技術的系統研究。葡萄潰瘍病菌的快速檢測技術，有助于了解我國葡萄潰瘍病菌的種群分布，對葡萄潰瘍病的有效防治及葡萄抗病品種的選育等方面有指導作用
發明內容
本發明的目的是提供一對葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum菌種特異性分子檢測引物以及特異性強、靈敏度高、易于操作、結果可靠的葡萄潰瘍病菌的快速分子檢測方法。本發明所提供的快速檢測葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum菌種的引物,名稱為B. p-F/B. p-R，它們的核苷酸序列分別為序列表中序列I和序列表中序列2。本發明還提供一種快速檢測葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum菌種的試劑盒，包括上述引物。所述試劑盒還可以包括PCR反應試劑盒。PCR反應試劑盒可以從商業途徑獲得，也可以自己配置。
本發明還提供利用上述檢測引物B. p-F/B. p-R檢測葡萄潰瘍病菌Neofusicoccumparvum菌種的方法,包括以下步驟I)提取待測樣品DNA，以該DNA為模板，用權利要求I所述的引物進行PCR擴增；2)鑒定步驟I)所述的PCR擴增產物的大小，將擴增產物中含有一個370bp的DNA特異性擴增片段的待測樣品鑒定為含有Neofusicoccum parvum菌種的樣品。PCR反應體系為25ii L，包括待測樣品DNA (約5ng)，上游正向引物和下游反向引物(10iimol/L)各0. L(即終濃度為 0. 2iimol/L)，dATP、dCTP、dGTP、dTTP 的終濃度均為 2. 5mmol/L, 2. 5 u L10父？0 緩沖液(100_01/1 Tris-HCl pH8. 3, 500mmol/LKCl, 15mmol/L MgCl2)和 0. 25 y LTaq DNA聚合酶(5U/iiL，添加終濃度為0.05U/iil)，其余部分用ddH20補足；PCR 條件為94°C預變性 4min ；30 個循環的 94°C 45s，61。。30s 和 72°C 30s ；72°C延伸IOmin0步驟2)中所述鑒定步驟1)PCR擴增產物的大小的方法是取5 ii L PCR產物用質量百分濃度為I. 2%瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化乙錠染色后于紫外燈下根據有無擴增產物判定結果。擴增產物中含有一個370bp的DNA片段的待測葡萄潰瘍病菌(Botrysphoraeriaspp.)菌株為屬于Neofusicoccum parvum菌種的菌株。所述待測樣品DNA采用NaOH法提取，DNA提取步驟如下I)將待測樣品稱重后，每mg樣品加入30 ii L 0. 5mol/LNa0H溶液，充分研磨；2)將步驟I)研磨后的樣品離心取上清液，每IOii L上清液加入490 ii L 0. ImmoI/LpH8. 0的Tris-HCl，混勻后得到待測樣品DNA，直接用于PCR反應。上述引物可應用于篩選引起葡萄潰瘍病的病原菌,特別是篩選葡萄座腔菌屬菌種Neofusicoccum parvum,而且可以在Neofusicoccum parvum菌量較少的情況下檢測到Neofusicoccum parvum的存在,實驗證明，當待測樣品濃度達IOpg時即可檢出，表明上述方法具有較高的靈敏性。同時，本發明的引物可以縮短對葡萄潰瘍病菌Neofusicoccumparvum菌種進行鑒定的時間，從而較快地鑒定出Neofusicoccum parvum菌種,達到克服傳統鑒定方法步驟繁瑣、鑒定周期長等問題的目的。


圖I為本發明的引物B.p-F/B. p-R特異性檢測的結果，圖中，泳道M為分子量MarkerCDL2000pIus DNA Marker),泳道1-5分別為分離自我國不同地區的Neofusicoccumparvum菌株,6-9 :葡萄潰瘍病菌Lasiodiplodia theobromae ； 10-14 ;葡萄潰瘍病菌Botryosphaeria dothidea ; 15-16 :葡萄潰瘍病菌 Diplodia seriata ； 17 :葡萄穗軸褐枯病菌 Alternaria viticola ； 18 :葡萄枝枯病菌 Pestalotia menezesiana ； 19 :葡萄炭疽病菌Glomerella cingulata ;20 :葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea ；21 :葡萄白腐病菌Conielladiplodiella ；22 :葡萄蔓枯病菌Phomopsis viticola 23是以ddH20為模板的PCR擴增結果。圖2為本發明的引物靈敏性檢測的結果，泳道M為分子量Marker(DL2000plus DNAMarker)，泳道1-7分別是以濃度分別為10，1，10-1，10_2，10_3，10_4，10_5ng/y L葡萄潰瘍病菌N. parvum基因組DNA為模板的PCR擴增產物。
圖3為本發明的引物檢測發病葡萄枝條中Neofusicoccum parvum的結果,泳道M為DL2000plus DNA Marker,泳道I為陽性對照，模板為葡萄潰瘍病菌Neofusicoccumparvum DNA,泳道2為陰性對照，PCR模板為健壯枝條DNA，泳道3為空白對照，以ddH20模板，泳道4、5為以發病葡萄枝條DNA為模板的擴增結果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的試驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑商店購買得到的。以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的試驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑商店購買得到的。實施例I、用于快速檢測葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum的引物及其應用—、用于葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum快速檢測的引物的獲得將本實驗室測序得到的5個Neofusicoccum parvum的ITS序列與GeneBank中葡萄座腔菌屬中20個不同種的ITS序列(登錄號分別為⑶251147;HQ529768;JN088510;⑶292676;FJ904819;EU683673;HQ288230;EF585518;JN088050;HQ625634;FJ888469;JN849098;JN035222;FJ904815;EU331085;DQ458889;HQ629954;AY236954;EU520175;AB454278)進行同源性比較，根據Neofusicoccum parvum與其它種間的差異位點設計Neofusicoccumparvum的特異性引物，所得引物即為本發明的引物B. p-F/B. p-R。引物序列為上游正向引物B. p-F序列5’ -AAAACTCCAGTCAGTGAACTTC-3’(序列表中序列I);下游反向引物B. p-R序列5’ -GGTCAACCTTGAGAAATAAITCAAAG-3’(序列表中序列 2)。二、本發明的用于葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum快速檢測的引物(B. p-F/B. p-R)的效果驗證I、引物合成B. p-F/B. p-R引物上游正向引物B.p_F序列為5’ -AAAACTCCAGTCAGTGAACTTC-3’，下游反向引物 B. p-R 序列為5’ -GGTCAACCTTGAGAAATAATTCAAAG-3’，委托上海生工生物技術有限公司合成。2、B. p-F/B. p-R 引物對的檢測 Neofusicoccum parvum 的準確性驗證以下研究中所用菌株5株分別分離自我國不同地區的Neofusicoccum parvum菌株,4株葡萄潰瘍病菌Lasiodiplodia theobromae ；5株葡萄潰瘍病菌Botryosphaeriadothidea ;2株葡萄潰瘍病菌Diplodia seriata ;葡萄穗軸褐枯病菌Alternariaviticola ;葡萄枝枯病菌 Pestalotia menezesiana ;葡萄炭疽病菌 Glomerellacingulata ;葡萄灰霉病菌Botrytis cInoiTGci ;儒1 甸白腐病國 Coniellsi diplodiolIci ;儒1 甸蔓枯病菌Phomopsis spp.。上述菌株的鑒定方法如下采用常規組織分離法(方中達.植病研究方法[M].第三版.北京中國農業出版社.1998 :122-137.)，分別從田間采集的葡萄病組織的病健交界處進行分離得到菌株的純培養，將其斜面培養物置于4°C冰箱中保存備用。 (I)病原真菌形態學鑒定方法
分離純化的菌株于28°C培養箱中黑暗培養3-7d，肉眼觀察菌落形態特征，在光學顯微鏡下觀察培養病菌的分生孢子形態，并測量其大小。將分離純化的病菌打成菌餅，采用有傷、無傷2種接種方法接種葡萄綠枝條，接種后在25°C下保濕培養，同時接種空白培養基作為對照，定期觀察發病情況。根據柯赫氏法貝U，對發病組織進行再分離，顯微鏡下觀察分離得到的病菌是否與原接種菌株相同。(2)真菌rDNA-ITS區的分子鑒定采用CTAB法提取菌株DNA，PCR擴增其rDNA — ITS區段，PCR反應體系為(25 u L)IOX 緩沖液(含 100mmol/L Tris-HCl pH8. 3,500mmol/L KCl, 15mmol / L Mg2+) 2. 5 u L,dNTP(各 2. 5mmoL / L) 2 uL, IOumol / L 引物 ITS1、ITS4 各 0. 5 y L (引物序列為ITS15，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，，ITS45，-TCCTCCGCTATGAATGC-3，)，Taq DNA 聚合酶(5U / u L)0. 25 iiL，模板 Iii L，雙蒸水 17. 25u L0 PCR 反應條件94 °C 預變性 3min ;94°C 30s, 59°C 30s, 72°C 30s, 30 個循環；72°C延伸 lOmin。PCR 產物的檢測取 L PCR擴增產物于0. 8%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，電泳緩沖液為1XTAE。電泳后的凝膠浸在0.5g / mL溴化乙錠染色液中染色15-20min，清水沖洗后，置于UV紫外成像系統上觀察成像，并拍照。在每次試驗中都要設陰性對照(不含模板DNA)。PCR產物送北京三博遠志公司做正反雙向測序，利用BioEdit軟件拼接得完整序列。將測序結果在http:"www. ncbi. nlm. nih. gov/網站上利用BLAST下的nucleotide-nucleotide blastn與GenBank上已經發表的基因進行對比，對菌株進行鑒定。根據病原菌的產孢特征及其在PDA培養基上的形態特征以及柯赫氏法則的驗證結果，參照文獻(Yan J Y,Li X H，Kong F F，et al. Occurrence of Grapevine Trunk DiseaseCaused by Botryosphaeria rhodina in China [J]. Plant Disease.2011, 95 (2):219.Li X, Yan J, Kong F, et al.Botryosphaeria dothidea causing canker of grapevinenewly reported in China[J]. Plant Pathology. 2010, 59(6):1170. Yan JY, XieY, YaoS ff, et al. Characterization of Botryosphaeria dothidea, the causal agent ofgrapevine canker in China[J] Australasian Plant Pathology. 2012, 41:351-357.Yan JY, Peng Y L, Xie Y, et al. First Report of Grapevine Trunk Disease Caused byBotryosphaeria obtusa in China[J]. Plant Disease. 2011, 95(5):616. U Rbez-TorresJ R, Gubler ff. D. Occurrence of Botryosphaeria obtusa, B. dothidea, and B. parvaAssociated with Grapevine Trunk Diseases in Castilla y Leon Region, Spain[J].Plant Disease. 2006,90(6) :835.趙奎華.葡萄病蟲害原色圖鑒[M] 北京中國農業出版社 2006 :12-17, 30-41，50-57，74-77.)及 rDNA-ITS 比對結果進行病菌鑒定。
采用CTAB法分別提取上述菌株的基因組DNA，以引物對B. p-F/B. p-R進行PCR擴增實驗。以ddH20為模板的PCR擴增結果為對照。PCR反應體系為25 u L，包括待測樣品DNA (約5ng)，上游正向引物和下游反向引物(10mmol/L)各 0. 5 u L (即終濃度為 0. 2 u mol/L), 2 u L dNTPs (即 dATP、dCTP、dGTP、dTTP的終濃度各 2. 5mmol/L),2. 5u L 10XPCR 緩沖液(lOOmmol/LTris-HCl pH8. 3,500mmol/LKCl, 15mmol/L MgCl2)和 0. 25 y L Taq DNA 聚合酶(5U/y L，添加終濃度為 0. 05U/y I )，其余部分用ddH20補足。PCR 反應程序為94°C預變性 4min ；30 個循環的 94°C 45s，61°C 30s 和 72°C 30s ；72°C延伸 lOmin。PCR擴增產物用質量百分濃度I. 2%瓊脂糖凝膠電泳分析。結果見圖I。結合PCR擴增實驗結果，分析如下供試的所有菌株中，只有5株Neofusicoccum parvum擴增得到 一條370bp的DNA特異性擴增片段，其余菌株中均擴增不到任何條帶。因此，引物B. p-F/B. p-R可以用于Neofusicoccum parvum的快速檢測，并具有很高的準確性。3、B. p-F/B. p-R 引物對的檢測 Neofusicoccum parvum 的靈敏性驗證將菌株Neofusicoccum parvum基因組DNA濃度調整為IOii g/ii L,按10的數量級逐步向下稀釋至10_5ug/uL作為模板，進行PCR擴增，PCR體系和反應程序按照步驟2中所述,PCR產物用I. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果見圖2,當Neofusicoccum parvum DNA濃度大于或等于IOpg時，利用引物對B. p-F/B. p-R可以特異性的擴增得到370bp的DNA條帶，但當濃度小于IOpg后，則擴增不到條帶，因此該對引物可以檢測到基因組DNA濃度高于IOpg 的 Neofusicoccum parvum。4、本發明方法樣品DNA提取的優化將Neofusicoccum parvum接種于PDA平板上,28°C培養24h后用5mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，刺傷接種于葡萄綠枝條上，25°C培養至出現可見病斑，切取病健交界處組織塊，按照 Wang 等(Wang H，Qi M, Cutler A J. A simple method of preparing plantsamples for PCR[J]. Nucleic Acids Research. 1993，21(17):4153-4154)的 NaOH 法(稍作改進)提取發病組織和健壯植株組織的基因組DNA，以引物對B. p-F/B. p-R進行PCR擴增實驗。結果表明，B. p-F/B. p-R能夠在由Neofusicoccum parvum侵染的葡萄枝條組織DNA中檢測到Neofusicoccum parvum的存在,見圖3,證明改進后NaOH提取DNA的方法是可行的。NaOH法DNA提取步驟如下I)組織塊稱重后，每mg組織加入30 ii L 0. 5mol/LNa0H,充分研磨；2) 12，OOOrpm 離心 5min ;取 10 u L 上清液加入 490 u LO. lmmol/L Tris (pH8. 0),混勻后直接用于PCR反應。
權利要求
1.一對引物，它們的核苷酸序列分別為序列表中序列I和序列表中序列2。
2.—種檢測葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum菌種的試劑盒,包括權利要求I所述的引物。
3.權利要求I所述的引物在輔助鑒定葡萄潰瘍病菌Neofusicoccumparvum菌種中的應用。
4.權利要求2所述的試劑盒在輔助鑒定葡萄潰瘍病菌Neofusicoccumparvum菌種中的應用。
5.一種鑒定葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum菌種的方法,包括下述步驟 1)待測樣品DNA為模板，用權利要求I所述的引物進行PCR擴增； 2)鑒定步驟I)所述的PCR擴增產物的大小，將擴增產物中含有一個370bp的DNA特異性擴增片段的待測樣品鑒定為含有Neofusicoccum parvum菌種的樣品。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR擴增的反應體系為PCR反應體系為25ii L，包括待測樣品DNA，上游正向引物和下游反向引物的終濃度均為0. 2umol/L ；dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 的終濃度均為 2. 5mmol/L ；2. 5u L IOXPCR 緩沖液；Taq DNA 聚合酶添加終濃度為0. 05U/ii L，其余部分用ddH20補足；所述IOXPCR緩沖液為由lOOmmol/LTris-HCl pH8. 3,500mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2 組成的溶液; PCR 反應程序為94°C預變性 4min ；30 個循環的 94°C 45s，61。。30s 和 72°C 30s ；72°C延伸IOmin0
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述待測樣品DNA采用NaOH法提取，DNA提取步驟如下 1)將待測樣品稱重后，每mg樣品加入30ii L 0. 5mol/LNaOH溶液，充分研磨； 2)將步驟I)研磨后的樣品離心取上清液，每IOiiL上清液加入490 ii L 0. ImmoI/LpH8. 0的Tris-HCl，混勻后得到待測樣品DNA，直接用于PCR反應。
全文摘要
本發明公開了一對用于快速檢測葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum菌種的引物及其應用。該對引物，它們的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2，能夠在葡萄潰瘍病菌Neofusicoccum parvum特異性的擴增出370bp的產物，對Neofusicoccum parvum菌種基因組DNA的靈敏度可達10pg。這表明該引物對可以用于田間葡萄病樣中Neofusicoccum parvum菌種的快速可靠的檢測和鑒定，克服傳統鑒定方法步驟繁瑣、鑒定周期長等問題。
文檔編號C12Q1/68GK102747078SQ201210229358
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月3日 優先權日2012年7月3日
發明者嚴紅, 張瑋, 李興紅, 燕繼曄 申請人:北京市農林科學院