專利名稱：用于增強(qiáng)血管通路的方法和組合物的制作方法
用于增強(qiáng)血管通路的方法和組合物本申請是申請日為2006年6月5日、國家申請?zhí)枮?00680027977. 6 (相應(yīng)的國際申請?zhí)枮镻CT/US2006/021755)、發(fā)明名稱為“用于增強(qiáng)血管通路的方法和組合物”的發(fā)明專利申請的分案申請。
相關(guān)的申請數(shù)據(jù)這個非臨時專利申請于2006年6月5日提交，根據(jù)35U. S. C. Sectionl 19(e)要求2005年6月21日提交的臨時專利申請U. S. S. N. 60/692, 708的權(quán)益；并根據(jù)35U. S. C. Sectionsl20、363和/或365要求2005年12月6日提交的共同待決國際申請PCT/US05/43967的優(yōu)先權(quán)；其要求了 2004年12月8日提交的臨時專利申請U. S. S. N. 60/634，155 ;2005 年 3 月 21 曰提交的臨時專利申請U. S. S. N. 60/663，859 ;和2005年5月19日提交的臨時專利申請U. S. S. N. 60/682，054的優(yōu)先權(quán)；每一個上述申請的完整內(nèi)容通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
血管通路失效是在血液透析時為患者提供照料來治療終末期腎病(ESRD)中的主要并發(fā)癥。自1980年以來在美國現(xiàn)存ESRD病例的比率逐年提高。在2001年，普遍率幾乎達(dá)到每百萬群體1，400位患者，與前一年相比增加百分之2. 4。根據(jù)在年齡、人種、種族劃分和糖尿病狀態(tài)方面的人口變化，在美國普遍ESRD群體預(yù)計到2030年達(dá)到130萬。當(dāng)前，大約65%的普遍ESRD群體使用血液透析治療(大約264，710位患者)。在1997年到2001年間，普遍血液透析群體每年增長4. 5%。使用醫(yī)療保險數(shù)據(jù)，已經(jīng)確定了到2001年，總的ESRD費用達(dá)到155億美元，整個2420億醫(yī)療保險預(yù)算的6. 4% (從所有的來源，總成本達(dá)到228億美元)。實際上，血管通路相關(guān)發(fā)病的年度費用在美國當(dāng)前超過每年10億美元。血管通路失效是血液透析群體中發(fā)病的單一最重要原因。分析美國腎臟數(shù)據(jù)系統(tǒng)(USRDS)數(shù)據(jù)的新近報告發(fā)現(xiàn)，總體的初級未協(xié)助的通路開通率I年僅53%。I年初級未協(xié)助的通路開通率，對于血管通路結(jié)構(gòu)例如涉及ePTFE ■修復(fù)性橋(prosthetic bridge)的動靜脈移植物是49%，對于動靜脈(AV)瘺是62 %。在1、3和5年對于首次通路的累積的開通率分別地對于下臂瘺是54%、46%和36%，對于AV移植物是54%、28%和0%。當(dāng)前，在美國涉及ePTFE修復(fù)性橋的移植物的使用占據(jù)了所有血液透析通路過程的70%，國家腎臟基金會當(dāng)前建議AV瘺是血管通路的優(yōu)選的方法。預(yù)期的是，將來在美國在新的AV瘺比例方面將有提聞。自生的動靜脈瘺歷史上被認(rèn)為是血液透析患者中血管通路的最好選擇。當(dāng)在手術(shù)建成之后AV瘺成功地熟化之時，它可以以低并發(fā)癥風(fēng)險和低校正幾率起作用數(shù)年。然而，報道的AV瘺非熟化比率很廣泛地變動，但保持在約20 — 50%。非熟化一般被定義為不能允許用于透析的瘺的重復(fù)性插管，或在手術(shù)建成之后12周內(nèi)不能獲得充足的透析血流。AV瘺非熟化的發(fā)生可能部分地取決于用于形成AV瘺的血管的質(zhì)量和大小。血管特征的手術(shù)前評定已經(jīng)顯示了在鑒定用于AV瘺建成的適合的血管中具有有益的效果。血管通路結(jié)構(gòu)的失效可歸因于各種不同的急性和慢性現(xiàn)象的累積效應(yīng)，特別是在接合點和它的下游周圍物的所謂“趾部”處。例如，AV移植可能在靜脈接合側(cè)的接合點處發(fā)展出移植相關(guān)的狹窄和移植相關(guān)的閉塞。在一份公開的報告中，從患有移植相關(guān)的接合性狹窄的患者取下的片段的組織學(xué)檢查揭示了由平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的內(nèi)膜增生。移植血栓形成也可能在ePTFE透滲析移植中引起血管通路功能障礙。此外，在靜脈和動脈的一般分離之后使靜脈段暴露于動脈血流和壓力可能引起不可避免的缺血和重灌注損傷。外科操作，例如縫合，也可以引起對靜脈和動脈中血管中層的內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞的直接傷害。在天然或移植接合的建成期間對動脈和靜脈內(nèi)皮的損傷可能影響開放和閉塞率。除了在血管通路結(jié)構(gòu)的形成期間與切割和縫合靜脈和動脈相關(guān)的物理傷害之外，提高的壁壓力和剪切力也可能引起對內(nèi)皮的物理和/或生物化學(xué)的損傷。已經(jīng)暗示，動脈血壓可能改變內(nèi)皮生長調(diào)節(jié)化合物的正常產(chǎn)生，以及在靜脈的血管中層產(chǎn)生形態(tài)學(xué)的和生物化學(xué)的改變。
血管通路失效的當(dāng)前治療是外科校正或有或沒有展伸的血管成形術(shù)。在這些一般為多病的患者中外科治療可能是危險的，血管成形術(shù)的和展伸的長期結(jié)果由于它們自身的失敗率一般是令人失望的。為了血液透析目的以及為了外周循環(huán)而改善血管通路的目標(biāo)是維持原始移植位置的解剖學(xué)完整性，以允許血液流速來支持透析治療或外周旁路位點具有充足血流。促進(jìn)新建成的血管通路結(jié)構(gòu)的成功熟化或已存在血管通路結(jié)構(gòu)的延長的熟化的其他因素仍然是不清楚的。然而，相對少的隨機(jī)化臨床試驗已經(jīng)在血管通路失效預(yù)防領(lǐng)域?qū)嵤┝恕Ｔu估血管通路失效的原因的研究得到了不一致的結(jié)論。實際上，在目前，盡管面臨這個難題，臨床醫(yī)師沒有對功能性透滲析通路瘺的延長存活有效的外科、治療或藥理學(xué)措施。明顯地，在病人護(hù)理這個重要領(lǐng)域終存在著需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用了以下發(fā)現(xiàn)，包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料，當(dāng)向血管通路結(jié)構(gòu)局部地提供時，可以促進(jìn)結(jié)構(gòu)的形成和/或增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的熟化，以及延長結(jié)構(gòu)的熟化的、功能性狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明，所述可植入材料位于處在或鄰近于或接近于血管通路結(jié)構(gòu)的血管的外表面上。本發(fā)明可以有效地促進(jìn)新建的血管通路結(jié)構(gòu)的整合和/或增強(qiáng)其熟化；提高和維持現(xiàn)有的功能性結(jié)構(gòu)的功能壽命；以及，可以有助于搶救失效的或失效中的結(jié)構(gòu)。在一個方面，本發(fā)明是處理患者中血管通路結(jié)構(gòu)的方法，包括步驟在所述血管通路結(jié)構(gòu)處、鄰近或附近放置包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料，其中所述可植入材料有效提高所述結(jié)構(gòu)的功能。根據(jù)如下所述的某些實施方式，所述血管通路結(jié)構(gòu)用于透滲析。根據(jù)各種實施方式，所述血管通路結(jié)構(gòu)是動靜脈的天然瘺、動靜脈的移植物、外周移植物、靜脈導(dǎo)管或內(nèi)駐的端口。在一個實施方式中，所述動靜脈移植物包含修復(fù)性橋。在其他實施方式中，所述導(dǎo)管是內(nèi)駐的雙管腔導(dǎo)管，處理所述內(nèi)駐的雙管腔導(dǎo)管提高了臨床穩(wěn)定性來足以允許血液透析。在一個實施方式中，處理所述血管通路結(jié)構(gòu)提高了流過所述結(jié)構(gòu)和流向所述結(jié)構(gòu)下游的正常的或近正常的血流。例如，正常的或近正常的血流是處在足以防止血液透析期間的再循環(huán)的速度的血流。根據(jù)其他的實施方式，處理所述血管通路結(jié)構(gòu)提高了正常的或近正常的血管直徑，并降低了血液透析的流動再循環(huán)。
對動靜脈的天然瘺來說，處理所述動靜脈的天然瘺增強(qiáng)了臨床熟化足以允許血液透析，降低了動靜脈的天然瘺的熟化中的延遲，改進(jìn)重復(fù)插管。對于動靜脈移植物來說，處理所述動靜脈移植物提高了臨床穩(wěn)定性足以恢復(fù)正常的或近正常的循環(huán)。在各種實施方式中，所述可植入材料降低了具有通路結(jié)構(gòu)的患者中校正的發(fā)生。在一個實施方式中，增強(qiáng)熟化的特征在于重復(fù)地將導(dǎo)管插入所述瘺用于透滲析的能力。根據(jù)另一個實施方式，增強(qiáng)熟化的特征在于在透滲析期間獲得充足血流的能力。優(yōu)選的，充足的血流包含約350mL/分鐘的速度。根據(jù)各種實施方式，生物相容性材料在動靜脈瘺上的應(yīng)用在使用治療試劑、物理擴(kuò)張或展伸之后或同時進(jìn)行。動靜脈瘺是橈頭的、頭臂的或臂貴要的(brachiobasilic)。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明是在人體中防止動靜脈瘺熟化失敗的方法，包括步驟將包含生物相容性基質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞的可植入材料放置在位于、鄰近或接近所述瘺的位置，從而防止瘺熟化失敗。在一個實施方式中，熟化失敗的特征在于不能重復(fù)地將導(dǎo)管插入所述瘺用于透滲析，或在透滲析期間不能獲得充足的血流，其中所述充足的血流 包括約350mL/分鐘的速度。在其他實施方式中，成熟失敗的特征在于在建成之后至少2個月、至少3個月、或至少4個月不能向動靜脈瘺中插入導(dǎo)管。在另一個實施方式中，本發(fā)明是維持動靜脈移植物的血流速度足以允許透滲析的方法，包括提供包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料的步驟，其中以有效維持移植物的血流速度足以允許透滲析的數(shù)量，在所述動靜脈移植物的靜脈流出區(qū)域的修復(fù)性橋處、其鄰近或附近，將所述可植入材料放置在所述動靜脈移植物的外表面上。在一個實施方式中，所述動靜脈移植物的靜脈流出區(qū)域處的血流速度基本上相似于所述流出區(qū)域上游的血流速度。在另一個實施方式中，本發(fā)明是維持外周旁路移植物的正常血流足以維持外周循環(huán)的方法，包括提供包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料的步驟，其中以有效維持所述旁路移植物的血流速度足以允許維持外周循環(huán)的數(shù)量，在修復(fù)性橋處、其鄰近或附近，將所述可植入材料放置在所述旁路移植物的外表面上。在一個實施方式中，流入血液速度和流出血液速度是基本上相似的。在另一個實施方式中，本發(fā)明是維持動靜脈移植物的血壓足以允許透滲析的方法，包括提供包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料的步驟，其中以有效維持血壓足以允許透滲析的數(shù)量，在所述動靜脈移植物的靜脈流出區(qū)域的修復(fù)性橋處、其鄰近或附近，將所述可植入材料放置在所述動靜脈移植物的外表面上。在一個實施方式中，所述動靜脈移植物的靜脈流出區(qū)域處的血壓基本上相似于所述流出區(qū)域上游的血壓。所述修復(fù)性橋選自隱靜脈；牛異種移植物；臍靜脈；滌綸；PTFE ;ePTFE，聚氨基甲酸酯；牛腸系膜靜脈；和低溫保存的股靜脈同種異體移植物。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述修復(fù)性橋是ePTFE。在另一個實施方式中，本發(fā)明是促進(jìn)動靜脈移植物或外周旁路移植物的修復(fù)性橋的組織整合的方法，包括提供包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料的步驟，其中以有效促進(jìn)所述橋的組織整合的數(shù)量，在修復(fù)性橋處、其鄰近或附近，將所述可植入材料放置在所述動靜脈移植物或所述外周旁路移植物的外表面上。在某些實施方式中，所述可植入材料促進(jìn)所述修復(fù)性橋的內(nèi)管腔表面之內(nèi)或附近的平滑肌細(xì)胞增殖或遷移，或促進(jìn)所述修復(fù)性橋的內(nèi)管腔表面之內(nèi)或附近的內(nèi)皮細(xì)胞增殖或遷移。在某些其他實施方式中，所述可植入材料促進(jìn)所述移植物處、其鄰近或附近的平滑肌細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞增殖。在另一個實施方式中，本發(fā)明是預(yù)防或降低動靜脈瘺或動靜脈移植物發(fā)生開裂的方法，包括提供包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料的步驟，其中以有效預(yù)防或降低開裂發(fā)生率的數(shù)量，在所述動靜脈移植物的靜脈流出區(qū)域的修復(fù)性橋處、其鄰近或附近，將所述可植入材料放置在所述瘺或動靜脈移植物的外表面上。根據(jù)其他實施方式，所述提供步驟在天然動靜脈瘺失效之后或在天然或隱靜脈血管外周旁路失效之后作為介入性治療來進(jìn)行。在另一個方面，本發(fā)明是適合于處理血管通路結(jié)構(gòu)的包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料。所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞或具有內(nèi)皮樣表型的細(xì)胞。所述生物相容性基質(zhì)是柔 性平面形式或可流動組合物。在特別優(yōu)選的實施方式中，所述細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞。所述柔性平面形式被配置用于在血管通路結(jié)構(gòu)處、其鄰近或附近植入。在某些實施方式中，這種形式限定了槽隙。根據(jù)可流動組合物的一個實施方式，所述可流動組合物是保持形狀的組合物。在其他實施方式中，本發(fā)明是包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料，適用于通過防止動靜脈瘺熟化失敗來增強(qiáng)動靜脈瘺熟化的方法。所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞或具有內(nèi)皮樣表型的細(xì)胞，所述生物相容性基質(zhì)是柔性平面形式或可流動組合物。在一個實施方式中，所述柔性平面形式被配置用于在天然瘺處、其鄰近或附近植入。在某些實施方式中，這種形式被配置，從而它限定了槽隙或一系列槽隙。對于所述可流動組合物，它是保持形狀的組合物。在另一個實施方式中，本發(fā)明是包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料，其中所述可植入材料被放置在修復(fù)性橋處、其鄰近或附近的血管的外表面。所述修復(fù)性橋位于或接近動靜脈移植物的靜脈流出區(qū)域，或位于或接近流出口。在另一個方面，本發(fā)明是用于保存包含生物相容性基質(zhì)和移接的細(xì)胞的可植入材料的轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物。所述轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物包含一定量的VEGF,當(dāng)細(xì)胞在低于所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)溫度的溫度下保存在所述轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物中時，VEGF的量足以維持細(xì)胞存活力或抑制性表型、以及使細(xì)胞維持存活延長的時間。在另一個方面，本發(fā)明是在低于細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)溫度的溫度下長期保存包含生物相容性基質(zhì)和移接的細(xì)胞的可植入材料的方法。所述方法包括將所述可植入材料浸浴在轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物中的步驟，所述轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物包含在保存期間足以維持細(xì)胞活力或抑制性表型的量的VEGF。當(dāng)在低于所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)溫度的溫度下在所述轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物中保存時，所述細(xì)胞長時間保持存活。根據(jù)一個實施方式，所述轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物含有一定量的VEGF，VEGF的量足以在低于所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)溫度的溫度下維持細(xì)胞活力或抑制性表型，并且高于在所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)溫度下所需的VEGF數(shù)量。根據(jù)一個實施方式，所述VEGF數(shù)量是約4ng/
mLo根據(jù)其他實施方式，所述可植入材料在低于37°C的溫度下或在環(huán)境溫度下在所述轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物中保存約I周、約2周、或約3周的長時間。所述細(xì)胞是保存時是近融合的(near-confluent)、融合的(confluent)或融合后的(post-confluent)并且至少 80 %存活的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞。
在另一個方面，本發(fā)明是用于低溫保存包含生物相容性基質(zhì)和移接的細(xì)胞的可植入材料的低溫保存介質(zhì)組合物。所述低溫保存介質(zhì)組合物包含低溫保存劑、多糖和血清。當(dāng)保存在至少約一 4°C時，細(xì)胞活力或抑制性表型以及基質(zhì)完整性被保持長時間。在一個實施方式中，所述低溫保存介質(zhì)組合物中血清的數(shù)量超過用于細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)的血清數(shù)量，例如，20 %血清或50 %血清。在一個實施方式中，所述血清是胎兒牛血清。在一個實施方式中，所述低溫保存介質(zhì)組合物中的多糖超過用于細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)的多糖數(shù)量，例如，至少約4%多糖或至少約4. 5%多糖。在一個實施方式中，所述多糖是葡聚糖。在另一個實施方式中，所述低溫保存介質(zhì)組合物進(jìn)一步包含約10% DMS0。根據(jù)一個實施方式，所述低溫保存介質(zhì)組合物用于在至少約一 80°C、至少約一140°C或至少約一 160°C下保存。根據(jù)各種實施方式，所述長時間是約I個月、約6個月或約I年。在一個實施方式中，細(xì)胞活力是至少約80%。
在另一個方面，本發(fā)明是低溫保存的可植入材料，包含用細(xì)胞移接的生物相容性基質(zhì)和足以在低溫保存時維持細(xì)胞活力或抑制性表型以及基質(zhì)完整性的體積的低溫保存介質(zhì)組合物，其中所述低溫保存介質(zhì)組合物包含低溫保存劑、多糖和血清。在另一個方面，本發(fā)明是制備包含生物相容性基質(zhì)和移接的細(xì)胞的可植入材料的方法。所述方法包括步驟提供包含細(xì)胞的工作細(xì)胞庫、提供水化的生物相容性基質(zhì)材料、用來自所述工作細(xì)胞庫的細(xì)胞播種所述水化的生物相容性基質(zhì)材料、將所述細(xì)胞播種的生物相容性基質(zhì)材料放置在孵育器中直到所述細(xì)胞近融合、融合或融合后，以及評定所述細(xì)胞播種的生物相容性基質(zhì)材料的細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞活力和細(xì)胞功能。在一個實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟將所述細(xì)胞播種的生物相容性基質(zhì)材料放置在適合于低溫保存的小瓶中，向近融合的、融合的、或融合后的細(xì)胞播種的生物相容性基質(zhì)材料中引入一定體積的低溫保存介質(zhì)組合物，所述低溫保存介質(zhì)組合物包含低溫保存劑、多糖和血清，在所述材料被低溫保存時，所述體積的組合物足以保持細(xì)胞活力或抑制性表型以及基質(zhì)完整性,將所述含有細(xì)胞播種的生物相容性基質(zhì)材料和低溫保存介質(zhì)組合物的小瓶放置在冷凍容器中，向所述冷凍容器中引入控制冷凍速度的試劑、將含有所述試劑的所述冷凍容器放置在至少一 4°C的冷凍器中，從所述至少約一 4°C冷凍器中移出所述冷凍容器，將所述冷凍容器放置在至少約一 80°C的冷凍器中。在另一個實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟從至少一 80°C冷凍器中移出所述冷凍容器，以及將所述冷凍容器置于至少一 160°C的冷凍器中。在另一個實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟從所述冷凍器中移出所述小瓶，將所述小瓶放置在環(huán)境溫度空氣中約15分鐘，隨后將所述小瓶放置在環(huán)境溫度水浴中約15分鐘，從所述小瓶中移出所述可植入材料，在清洗介質(zhì)組合物中清洗所述可植入材料約5分鐘，以及將所述可植入材料放置在細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中約48小時。在另一個實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟從所述冷凍器中移出所述小瓶，將所述小瓶放置在環(huán)境溫度空氣中約15分鐘，隨后將所述小瓶放置在環(huán)境溫度水浴中約15分鐘，從所述小瓶中移出所述可植入材料，以及在清洗溶液組合物中清洗所述可植入材料約30分鐘。在另一個實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟將所述細(xì)胞播種的生物相容性基質(zhì)材料放置在適合于保存的小瓶中，向近融合、融合或融合后的細(xì)胞播種的生物相容性基質(zhì)材料中引入一定體積的轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物，所述轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物包含一定量的VEGF，足以在所述材料保存在所述組合物中時維持細(xì)胞活力或抑制性表型。在另一個實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟制備細(xì)胞播種的生物相容性基質(zhì)材料，用于根據(jù)公開的方法低溫保存或用于根據(jù)公開的方法保存，制備小瓶，用于轉(zhuǎn)移，和轉(zhuǎn)運所述外盒到臨床位置用于向患者施用。在另一個實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟將含有細(xì)胞播種的生物相容性基質(zhì)材料的小瓶放置到內(nèi)盒中，將所述內(nèi)盒放置到隔離的外盒中，以及提供產(chǎn)品文件。在所述方法的一個實施方式中，所述細(xì)胞播種的生物相容性基質(zhì)材料是臨床試驗材料，所述患者是臨床試驗中的參與者。在所述方法的另一個實施方式中，所述可植入材料以工業(yè)規(guī)模制備。在另一個方面，本發(fā)明是實施任何在此公開的方法的機(jī)器人系統(tǒng)。在另一個方面，本發(fā)明是制造包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料的方法， 所述方法包括步驟使用適合的試劑和條件使細(xì)胞與生物相容性基質(zhì)接觸，其中所述細(xì)胞的數(shù)量足以增殖(populate)所述基質(zhì)并生長到融合、近融合或融合后的群體，以及進(jìn)一步的，其中所述基質(zhì)用與細(xì)胞類型無關(guān)的、未經(jīng)兼容性測試的、未匹配的細(xì)胞增殖。在另一個方面，本發(fā)明是提供根據(jù)這種方法制造的可植入材料的方法。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明是根據(jù)這種方法制造的包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料。


在附圖中，相同的附圖標(biāo)記一般在不同的視圖中指代相同的部分。并且，所述附圖沒有按比例或成比例繪制，而重點一般是說明本發(fā)明的原理。圖I是根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式，用于向管形解剖結(jié)構(gòu)的外表面施用的可植入材料的柔性平面形式的示意性立體圖。圖2A是根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式，用于向管形解剖結(jié)構(gòu)的外表面施用的可植入材料的輪廓化柔性平面形式的示意性立體圖。圖2B、圖2C、圖2D、圖2E、圖2F和圖2G是根據(jù)本發(fā)明的各種示例性實施方式包含槽隙的可植入材料的輪廓化柔性平面形式的示意立體圖。圖3A和圖3B是根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式的代表性細(xì)胞生長曲線。圖4A、圖4B和圖4C說明了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式從頂部透視的、施用具有多個柔性平面形式的可植入材料到血管接合點的外表面的一系列步驟。圖5是根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式，向血管接合點的外表面施用的輪廓化形式的可植入材料的俯視圖。圖6是根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式，向管形解剖結(jié)構(gòu)施用的柔性平面形式可植入材料的俯視圖。圖7是根據(jù)本發(fā)明的示例性實施方式，制備、保存和轉(zhuǎn)移用于向接受者施用的可植入材料的方法的流程圖。
具體實施例方式如在此解釋的，本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，基于細(xì)胞的治療可以用于處理血管通路結(jié)構(gòu)。以下呈現(xiàn)的教導(dǎo)提供了制造和使用本發(fā)明的材料和方法的足夠指導(dǎo)，進(jìn)一步為鑒定適合的指標(biāo)和受試者提供了足夠的指導(dǎo)，用于測試、測量和監(jiān)視本發(fā)明的材料和方法的性倉泛。因而，已經(jīng)開發(fā)了基于細(xì)胞的治療，用于臨床上管理血管通路并發(fā)癥和/或失效。本發(fā)明的示范性的實施方式包含適用于在此描述的處理范例的生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞。特別地，在一個優(yōu)選的實施方式中，所述可植入材料包含生物相容性基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞。在一個實施方式中，所述可植入材料具有柔性平面形式，并且包含內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞，優(yōu)選人大動脈內(nèi)皮細(xì)胞，以及生物相容性基質(zhì)Gelfoam 明膠海綿(Pfizer，NewYork, NY,以下稱“Gelfoam基質(zhì)”)。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，所述可植入材料具有可流動形式，并且包含內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞，優(yōu)選人大動脈內(nèi)皮細(xì)胞，以及生物相容性基質(zhì)Gelfoam⑧明膠顆粒或粉末(Pfizer, New York, NY,以下稱“Gelfoam顆粒”)。本發(fā)明的可植入材料包含在生物相容性基質(zhì)之上、之中和/或之內(nèi)移接的細(xì)胞。移接是指經(jīng)由細(xì)胞與細(xì)胞和/或細(xì)胞與基質(zhì)相互作用可靠地連接，從而細(xì)胞經(jīng)得起在此公開的準(zhǔn)備性操作的苛刻條件。如在此其他地方說明的，可植入材料的操作性實施方式包括具有優(yōu)選表型的近融合、融合或融合后的細(xì)胞群體。要理解的是，可植入材料的實施方式可 能在準(zhǔn)備性操作期間脫落細(xì)胞，和/或某些細(xì)胞不是與其他細(xì)胞一樣可靠地連接的。全部需要的是，可植入材料包含滿足在此闡述的功能或表型指標(biāo)的細(xì)胞。本發(fā)明的可植入材料是基于組織工程原理開發(fā)的，代表了解決上述臨床需求的新方法。本發(fā)明的可植入材料是獨特的，原因在于在所述生物相容性基質(zhì)之上、之中和/或之內(nèi)移接的活細(xì)胞能夠在生理學(xué)反饋控制之下以生理學(xué)比例供給血管通路結(jié)構(gòu)和相關(guān)的基于脈管系統(tǒng)多細(xì)胞的產(chǎn)物。如在此其他地方描述的，適合與可植入材料使用的細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞。通過這些細(xì)胞的多化合物本地遞送以及生理學(xué)上動態(tài)的給藥提供了對過程的更有效調(diào)節(jié)，所述過程負(fù)責(zé)維持功能性血管通路結(jié)構(gòu)和減少血管通路并發(fā)癥和/或失效。重要地，由于被放置在血管的非腔體表面，例如，在外膜或接觸血管的外表面處，本發(fā)明的可植入材料的例如內(nèi)皮細(xì)胞被保護(hù)免于受到血管管腔內(nèi)的侵蝕性血流的影響。本發(fā)明的可植入材料，當(dāng)纏繞在、沉積在或以其他方式與這種外部目標(biāo)位點即接合點和/或其周圍接觸時，用來重建穩(wěn)態(tài)。也就是說，本發(fā)明的可植入材料可以提供一種環(huán)境，其模擬了支持性的生理，并有助于血管通路結(jié)構(gòu)形成、熟化、整合和/或穩(wěn)定。對于本發(fā)明來說，接觸是指直接或間接地與在此其他地方定義的腔外或非腔表面相互作用。對于某些優(yōu)選的實施方式來說，實際的物理接觸不是有效性所需的。在其他實施方式中，實際的物理接觸是優(yōu)選的。實踐本發(fā)明所需的全部是，以有效治療受損或患病位置的數(shù)量、可植入材料在受損或患病位置處、鄰近或附近發(fā)生腔外或非腔沉積。對于某些疾病或損傷來說，患病或損傷位置可以臨床地顯現(xiàn)在內(nèi)管腔表面上。對于其他疾病或損傷來說，患病或損傷位置可以臨床地顯現(xiàn)在腔外或非腔表面上。在某些疾病或損傷中，患病或損傷的位置可以臨床地顯現(xiàn)在內(nèi)管腔表面以及腔外或非腔表面上。本發(fā)明對于治療任何上述臨床表現(xiàn)是有效的。例如，內(nèi)皮細(xì)胞可以釋放各種各樣的試劑，其組合起來可以抑制或緩解與血管通路結(jié)構(gòu)建成之后的急性并發(fā)癥相關(guān)的有害生理學(xué)事件。如在此例示的，概括了正常的生理和給藥的組合物和使用方法對于增強(qiáng)血管通路結(jié)構(gòu)形成、熟化、整合和/或位點，以及促進(jìn)這種血管通路結(jié)構(gòu)的長期開放是有用的。一般地，處理包括在血管通路結(jié)構(gòu)位置處、其鄰近或附近，例如，在操作中涉及的動脈和靜脈管腔外側(cè)的血管周圍間隙中放置本發(fā)明的可植入材料，。當(dāng)纏繞、環(huán)繞、沉積或以其他方式接觸損傷的、外傷的或患病血管時，所述可植入材料的細(xì)胞可以為血管系統(tǒng)提供生長調(diào)節(jié)化合物，例如，對血管內(nèi)的底層平滑肌細(xì)胞提供。預(yù)期的是，當(dāng)位于腔外位置時，所述可植入材料的細(xì)胞提供了多種調(diào)節(jié)化合物的連續(xù)供應(yīng)，所述化合物可以滲透血管組織并到達(dá)管腔，而所述細(xì)胞被保護(hù)免于受到血管中血流的有害機(jī)械作用。如在此描述的，一個優(yōu)選的腔外位置是血管的外表面。使用本發(fā)明的優(yōu)選實施方式處理可以促進(jìn)正常的或近正常的痊愈和正常的生理。相反地，在缺少本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的處理時，正常的生理痊愈被損害，例如，天然內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞可能在血管通路結(jié)構(gòu)建成之后以過度地或不受控制的速度異常生長，弓丨起有害的臨床結(jié)果，包括血管通路結(jié)構(gòu)失效。因而，如在此預(yù)期的，使用本發(fā)明的可植入材料處理將改善接合位置處天然組織的痊愈以維持血管通路結(jié)構(gòu)開放。對于本發(fā)明來說，血管通路結(jié)構(gòu)可以形成為各種構(gòu)型。血管通路結(jié)構(gòu)可以包括天然發(fā)生的或手術(shù)創(chuàng)建的動靜脈瘺、動靜脈移植物、外周旁路移植物、內(nèi)駐靜脈導(dǎo)管、內(nèi)駐血 管端口、或其他被創(chuàng)建以改善患者中的血管通路的血管接合結(jié)構(gòu)。另外，血管通路結(jié)構(gòu)的各種實施方式形成為各種構(gòu)型，包括面對面、端對面、端對端和面對端接合點。血管通路結(jié)構(gòu)也可以放置在各種解剖學(xué)位置中。本發(fā)明的可植入材料可以以各種構(gòu)型放置在要處理的血管通路結(jié)構(gòu)處。根據(jù)某些實施方式，本發(fā)明的可植入材料可以置于接合接點以及置于遠(yuǎn)離接合點的近端靜脈段。在其他實施方式中，本發(fā)明的可植入材料可以置于動脈段、近端靜脈段、遠(yuǎn)端靜脈段，和/或橋接血管通路結(jié)構(gòu)。在另一個實施方式中，所述可植入材料也可以置于接合接點處的移植材料上或移植材料的一部分上。血管可以完全或部分地接觸，例如，本發(fā)明的可植入材料可以周向地或以弧形構(gòu)型應(yīng)用于血管。血管和/或血管通路結(jié)構(gòu)僅需要與足夠改善、形成、熟化、整合和/或穩(wěn)定血管通路結(jié)構(gòu)的數(shù)量的可植入材料接觸。動靜脈瘺。根據(jù)某些實施方式，為血管通路創(chuàng)建的動靜脈瘺(“AV瘺”)可以用本發(fā)明的可植入材料處理。AV瘺可以置于患者體內(nèi)的各種位置，包括，例如，放置在頸部、腕、上臂或小臂。臨床的AV瘺結(jié)構(gòu)包括橈頭的(在橈動脈和頭靜脈之間)、Brescia-Cimino (在腕內(nèi)橈動脈和頭靜脈的面對面接合)、頭臂的(在肱動脈和頭靜脈之間)、臂-肘前的(肱動脈和肘前靜脈之間)、臂貴要的(移位的貴要靜脈)、尺頭的Ulnarcephalic)(尺動脈和頭靜脈之間)和隱靜脈回路(隱靜脈和股動脈的右側(cè))瘺。AV瘺手術(shù)的并發(fā)癥一般在三個階段出現(xiàn)。這些階段是通常以血栓形成為特征的人為急性階段、臨床標(biāo)志是瘺不能熟化的中間階段，和最后的，例如可能由于漸進(jìn)性靜脈狹窄造成的已經(jīng)建成的功能性瘺的更慢性的失效。AV瘺熟化的特征包括，例如重復(fù)地將導(dǎo)管插入所述瘺用于進(jìn)行透滲析的能力。AV瘺熟化的另一特征是獲得對血液透析有用的充足透滲析血流的能力。充足的血流至少是使用透滲析機(jī)器足夠支持透滲析的流速，從而不出現(xiàn)再循環(huán)。對本發(fā)明來說，充足的透滲析血流是在瘺的建成之后不超過24周，優(yōu)選超過20周，更優(yōu)選16周、最優(yōu)選十二周的時間點至少約350mL/分鐘的血流。AV瘺不能熟化的機(jī)理當(dāng)前理解為包括，例如，瘺血管的早期血栓形成、在結(jié)合位點處或附近的狹窄、附屬靜脈的存在，包括側(cè)突或靜脈側(cè)枝、不足夠的靜脈大小，包括不足夠的靜脈內(nèi)徑，和由于漸進(jìn)性狹窄造成的晚期瘺失效。通過轉(zhuǎn)移血流和通過不允許與瘺相連的靜脈變?yōu)樽銐虼笮∫栽试S插管，附屬的靜脈可以阻止瘺的發(fā)育。當(dāng)前認(rèn)為，附屬靜脈可以響應(yīng)于例如瘺中狹窄的存在而發(fā)育。AV瘺熟化的機(jī)理是多模式的,一般需要對多種臨床征候的評定。單獨的缺少狹窄一般是成熟的AV瘺的不充分指標(biāo)。
此外，認(rèn)為足夠用于透滲析目的的AV瘺需要瘺的熟化以及足以支持透滲析的血流，所述瘺的熟化就是在瘺的靜脈段發(fā)生的、容許瘺被重復(fù)地插入導(dǎo)管的那些變化。即使在存在很少血流時，AV瘺可以保持開放，但是開發(fā)的AV瘺可能臨床上足以進(jìn)行透滲析。對于本發(fā)明來說，用于透滲析的臨床上充足的血流是約150 - 500mL/分鐘、優(yōu)選約300 —500mL/分鐘、最優(yōu)選約350 — 400mL/分鐘；適合的血壓是約50 — 180mmHg，優(yōu)選約50 —120mmHgo對于本發(fā)明來說，相信的是，使用本發(fā)明的可植入材料處理提供了有益的自我平衡性環(huán)境，從而無論在瘺建成時或更晚的階段被放置在瘺鄰近或附近時，在AV瘺熟化中常見的并發(fā)癥，例如血栓形成、狹窄、凝結(jié)和/或附屬靜脈的生長被減少。這種類型的有益環(huán)境允許AV瘺繼續(xù)熟化和/或保持在成熟階段。例如，AV瘺靜脈增厚并能夠引導(dǎo)高流動、高壓血液時，功能上地實現(xiàn)熟化。用在此提供的可植入材料處理AV瘺增強(qiáng)了瘺的熟化和/或防止瘺不能熟化。對于本發(fā)明來說理解的是，AV瘺熟化的增強(qiáng)包括在瘺功能中的任何改善，包括它的形成、達(dá)到功能狀態(tài)所需的時間以及維持瘺處于成熟形態(tài)形式。手術(shù)后即時的血栓形成可能阻止開放的AV瘺的形成并引起瘺的早期失效。如在此解釋的，在手術(shù)時使用本發(fā)明的可植入材料處理可以防止AV瘺由于手術(shù)后血栓形成即時失效。例如，所述可植入材料釋放降低血栓形成的抗血栓性介體，可以在整個瘺形成或熟化階段維持瘺的開放。在手術(shù)時在AV瘺位置處或附近放置可植入材料也可以通過以下措施來增強(qiáng)熟化在接合點處或附近降低狹窄、容許瘺變?yōu)樽銐虼笮∫蕴峁┏渥愕难鱽碇С滞笣B析、促進(jìn)靜脈和動脈的擴(kuò)張、降低寄生性附屬靜脈的形成、維持天然的附屬靜脈來增強(qiáng)瘺的熟化、以及改善靜脈的大小。另外，AV瘺比AV瘺移植物需要更長的時間段來達(dá)到熟化。在瘺熟化期間，一般使用透皮導(dǎo)管或內(nèi)駐導(dǎo)管來進(jìn)行血液透析，導(dǎo)致感染風(fēng)險提高和損害中央靜脈的開放性。在瘺建成時在AV瘺位點防止可植入材料可以降低瘺熟化所需的時間，從而降低相關(guān)的感染風(fēng)險和損害中央靜脈的開放性。在內(nèi)駐導(dǎo)管的位置處放置可植入材料可以降低與內(nèi)駐導(dǎo)管相關(guān)的血栓形成、內(nèi)膜增生和再狹窄的風(fēng)險，從而降低相關(guān)的感染風(fēng)險和損害中央靜脈的開放性。最后，在此描述的可植入材料的使用可以降低成熟AV瘺的晚期失效。由于晚期的漸進(jìn)性狹窄，成熟的瘺可能經(jīng)歷減少的血流和增加的靜脈狹窄。瘺狹窄或閉塞到足以使血流降低到低于透滲析所需水平的程度，可能需要介入性血管成形術(shù)或瘺的展伸來恢復(fù)足夠的血流水平。這種介入性治療增大了靜脈狹窄和閉塞的風(fēng)險，進(jìn)一步阻止了成熟瘺的形成。此外，展伸可能引起在展伸的血管遠(yuǎn)端和近端的一部分中被處理的血管形成閉塞性血栓形成或再狹窄，通常稱為邊緣效應(yīng)。可植入材料的應(yīng)用可以產(chǎn)生主動的改變(血管擴(kuò)張與同時抑制靜脈新內(nèi)膜增生的組合)，從而防止晚期的漸進(jìn)性狹窄，增大成熟瘺的血流，降低對復(fù)原性血管成形術(shù)或阻塞瘺的展伸的需求，防止展伸相關(guān)的邊緣效應(yīng)，以及延長成熟瘺的使用期和可用性。
本發(fā)明的可植入材料可以在許多不同階段的任何時候向瘺提供。例如，在手術(shù)時的處理可以防止AV瘺不能成熟和/或可以增強(qiáng)瘺的熟化。可植入材料通常也可以在開始手術(shù)之后提供來促進(jìn)愈合，以及在形成了成熟AV瘺之后提供來維持它處于臨床上穩(wěn)定的狀態(tài)。另外，所述可植入材料也可以援救隨后將失效的成熟的AV瘺，和/或可以延長成熟瘺的使用期。這些情況是AV瘺熟化增強(qiáng)的非限制性實例。因而，預(yù)期的是，可植入材料不僅可以在創(chuàng)建AV瘺的手術(shù)開始時使用，還可以在隨后的時間點使用(例如，用于維持成熟AV瘺或援救成熟的瘺以免失效)。隨后的施用可以手術(shù)地或非侵入性地實現(xiàn)。動靜脈移植物。根據(jù)其他的實施方式,為血管通路創(chuàng)建的動靜脈移植物(“AV移植物”)可以用本發(fā)明的可植入材料處理。AV移植物可以是前臂直移植物、前臂回路移植物或上臂移植物的形式。動脈流入位置包括，但不限于，頸總動脈、腕處的橈動脈、肘窩處的肱動脈、臂的低位部分的肱動脈、腋下的肱動脈、腋動脈和股動脈。靜脈流出位置包括，但不限于，中部的肘前靜脈、近端頭靜脈、遠(yuǎn)端頭靜脈、手肘水平的貴要靜脈、上臂水平的貴要靜脈、腋靜脈、頸靜脈和股靜脈。其他適合于AV移植物形成的動脈和靜脈位置包括胸壁(腋動脈到鎖骨下靜脈)、低位末端(股動脈/靜脈、隱靜脈、或脛骨(前)動脈、主動脈到大靜脈、腋動脈到股靜脈或股動脈到腋靜脈。 對于本發(fā)明來說，涉及適合于透滲析的修復(fù)性橋的功能性AV移植物能夠引導(dǎo)高流動、高壓的血液通過該修復(fù)性橋。在這種AV移植物中，所述移植物的靜脈流出區(qū)域處的血流速度基本上相似于所述移植物流出區(qū)域上游的血流速度。適合于透滲析的血流速度是約150 — 500mL/分鐘、優(yōu)選約300 — 500mL/分鐘、最優(yōu)選約350 — 400mL/分鐘；適合的血壓是約 50 - 180mmHg，優(yōu)選約 50 — 120mmHg。由于移植物相關(guān)的內(nèi)膜增生，隨后是在靜脈-移植物接合點處或在近端靜脈段處移植物相關(guān)的血栓形成，造成AV移植物通常失效。由于天然血管和修復(fù)性橋材料之間不良的組織整合和橋材料與血管的最后開裂，AV移植物也是容易失效的。對于本發(fā)明來說，使用本發(fā)明的可植入材料處理提供了有益的自我平衡性環(huán)境，從而無論在移植物創(chuàng)建時或更晚的階段，與AV移植物整合和熟化相關(guān)的并發(fā)癥，例如血栓形成、狹窄、凝結(jié)和/或開裂被減小。這種類型的有益環(huán)境容許與AV移植物相關(guān)的血管完全地與修復(fù)性橋材料整合。例如，AV移植物整合并能夠引導(dǎo)高流動、高壓血液時，功能上地實現(xiàn)熟化。如在此展現(xiàn)的，使用可植入材料處理AV移植物增強(qiáng)了移植物的整合和熟化。對于本發(fā)明來說，理解的是，AV移植物整合和/或熟化的增強(qiáng)包括在移植物的功能方面的任何改善，包括它的形成、達(dá)到功能狀態(tài)所需的時間、以及移植物保持其功能形式。手術(shù)后即時的與移植物相關(guān)的血栓形成能夠阻止組織整合和開放AV移植物的最后形成，并可以引起移植物的早期失效。如在此解釋的，在手術(shù)時的處理可以防止AV移植物由于手術(shù)后血栓形成而即時失效。例如，所述可植入材料釋放降低血栓形成的抗血栓性介體，并在整個移植物整合和熟化階段維持開放的移植物。在手術(shù)時，在AV移植物接合點處、鄰近或附近；在移植物的靜脈流出區(qū)域處、鄰近或附近；和/或在移植物處、鄰近或附近放置可植入材料也可以通過在移植物接合點處或附近減少即時血栓形成和漸進(jìn)性狹窄來增強(qiáng)整合和熟化。這種治療效果容許移植物有足夠的時間來變得與修復(fù)性橋材料充分整合、最小化血管血栓形成和閉塞、并維持足夠的血管內(nèi)徑來支持足夠透滲析的血流。
可植入材料的施用也可以最小化成熟AV移植物的晚期失效。由于晚期的漸進(jìn)性狹窄，成熟的移植物能夠經(jīng)歷減小的血流和增大的靜脈狹窄。可植入材料的應(yīng)用可以產(chǎn)生主動的改變(血管擴(kuò)張與同時抑制靜脈新內(nèi)膜增生的組合)，從而防止晚期的漸進(jìn)性狹窄，增大成熟移植物的血流，以及延長成熟 移植物的使用期和可用性。如在此展現(xiàn)的，使用本發(fā)明的可植入材料 處理AV移植物接合點促進(jìn)了適合于透滲析的功能性AV移植物的形成。進(jìn)一步理解的是，對于本發(fā)明來說，功能性AV移植物的形成包括移植物的臨床功能的任何改善、或移植物接合點的形成過 程或修復(fù)性橋的整合過程、和/或移植物接合點保持成熟形式，包括開裂發(fā)生率的降低。如臨床醫(yī)師公認(rèn)的，AV移植物的足夠性需要移植物支持和維持足夠的血流。對于用于血液透析的AV移植物來說，充足的血流至少是足夠支持使用透滲析機(jī)器進(jìn)行透滲析的流速，從而不出現(xiàn)再循環(huán)。臨床上失效的AV移植物是不能支持足夠支持透滲析的血流的移植物。預(yù)期的是，通過促進(jìn)能夠支持透滲析的充足血流的功能性移植物的形成，本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式將延遲AV移植物失效的發(fā)作或降低AV移植物失效。外周旁路移植物。根據(jù)其他的實施方式，被創(chuàng)建來繞過失效的外周血管的外周移植物可以使用本發(fā)明的可植入材料處理。外周旁路移植物可以置于各種解剖學(xué)位置，包括末端，例如低于或高于膝蓋的腿的區(qū)域。外周旁路移植物可以用于繞過阻塞的外周血管，包括在外周動脈或靜脈中的堵塞。外周旁路移植物可以用于修復(fù)和/或維持通向末端的正常血流，例如，足以維持正常或近正常外周循環(huán)的血流速度。根據(jù)某些實施方式，外周旁路移植物在高于堵塞區(qū)域或低于堵塞區(qū)域處形成。在某些實施方式中，本發(fā)明可以用于改善具有包含天然材料的橋的外周旁路的功能、整合、熟化和/或穩(wěn)定；在某些其它實施方式中，所述移植物具有修復(fù)性橋。對于外周旁路移植物來說，可植入材料可以置于移植物一端或兩端的血管的外表面上和/或移植物材料的外表面上。在某些實施方式中，所述可植入材料可以在一端或兩端接觸外周旁路移植物接點。在某些其他實施方式中，所述植入物可以置于外周旁路移植物上游的血管外部。在手術(shù)時在外周旁路移植物的流入或流出區(qū)域處或附近放置可植入材料的優(yōu)選實施方式也可以增強(qiáng)功能性移植物的形成、促進(jìn)整合和/或防止開裂。對于本發(fā)明來說，功能性外周旁路移植物能夠在正常壓力下引導(dǎo)正常的血流。膝蓋以下的旁路移植物的正常流速是約50 - 150mL/分鐘、優(yōu)選約80 — IOOmL/分鐘；膝蓋以上的旁路移植物的正常流速是約50 - 150mL/分鐘，優(yōu)選約80 — IOOmL分鐘；腳移植物的正常流速是約25 — 30mL/分鐘。適合的血壓是約50 — 180mmHg,優(yōu)選約50 — 12OmmHg0對于如在此描述的經(jīng)處理的外周旁路移植物來說，流出速率基本上相似于流入速率。本發(fā)明恢復(fù)了通向低位肢端的充足血流，并減少了與通向低位肢端的血流不足相關(guān)的癥狀。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式通過促進(jìn)形成具有足夠維持外周循環(huán)的血流的功能性外周旁路移植物延遲了外周旁路移植物失效的發(fā)作或降低了外周旁路移植物失效。對于本發(fā)明來說，任何修復(fù)性橋材料適合于創(chuàng)建血管通路結(jié)構(gòu)，只要它支持在AV移植物的情況下血液透析所需的血流速度和壓力，并且支持在外周旁路移植物的情況下外周循環(huán)所需的血流速度和壓力。一般地，修復(fù)性橋優(yōu)選地是柔性的，與細(xì)胞整合相容的，并且具有合適的大小來支持所需的血流速度。一個優(yōu)選的實施方式利用了 PTFE、或ePTFE、聚四氟乙烯橋；另一個實施方式利用Dacron (E. I. duPont de Nemours and Co.)。修復(fù)性橋也可以由修飾的PTFE材料、聚氨基甲酸酯、碳包被的PTFE和復(fù)合移植物形成。PTFE移植物可以制作成各種物理構(gòu)型，包括錐形、延伸的、棱紋狀的、平滑的，可以含有多種水平的PTFE。修復(fù)性移植物也可以包括末梢修飾，包括靜脈貼片、軸環(huán)、和插入在動脈和瘺之間的套管。其他實施方式包括天然材料，例如隱靜脈移植物、臍靜脈移植物、股靜脈同種異體移植物和生物學(xué)異種移植，包括牛頸動脈和牛腸系膜靜脈移植物。包含上述任一種的復(fù)合移植物也是此處預(yù)期的。熟練醫(yī)師將認(rèn)可適合的等價物。另外地和重要地，對于AV移植物或外周旁路移植物來說，正常或近正常的痊愈速度促使內(nèi)皮細(xì)胞在修復(fù)性橋的腔表面增殖，從而促進(jìn)移植物和相連血管系統(tǒng)的整合。為了促進(jìn)整合，可植入材料的細(xì)胞提供的治療因子擴(kuò)散到管壁。對于合成的移植物材料來說，合成材料的孔隙也可以影響治療因子到達(dá)在合成移植物的腔表面上增殖的細(xì)胞的能力。PTFE移植物。在某些優(yōu)選的實施方式中，15 — 25cm長度的6 — mm內(nèi)徑PTFE管被 用于形成移植物(Atrium Advanta VS Standard Wall PTFE graft, 0. 6mm, Atrium MedicalCorp, Hudson, NH)0特別優(yōu)選的移植物材料PTFE是柔性的聚合物，其已經(jīng)顯示了用于外科操作時是非血栓性的。預(yù)期的是，替代的聚合物材料，例如Dacron ，具有與PTFE類似的性質(zhì),也可以用作移植物材料。移植物可以被切割成期望的長度來便于在特定患者中精確放置。移植物可以是前臂回路移植物或直移植物。移植物的末端可以被切割成角、具有凸緣，或具有其他的構(gòu)型，足以提高移植物末端的表面積用于縫合或足以改善移植物在特定患者中的適應(yīng)即可。移植物的末端也可以粗糙化或以其他方式修飾來促進(jìn)細(xì)胞粘附。另外，移植物材料可以包被有明膠、白蛋白或另一種治療試劑。 最后，為失效中或失效的AV移植物或外周旁路移植物提供可植入材料可以引起原始移植物的復(fù)原，從而恢復(fù)移植物的功能。在相關(guān)的環(huán)境中，失效的天然AV瘺可以用與本發(fā)明的可植入材料組合的AV移植物替換，作為介入性治療。血管通路導(dǎo)管。根據(jù)某些實施方式，為血管通路創(chuàng)建的內(nèi)駐靜脈導(dǎo)管可以用本發(fā)明的可植入材料處理。導(dǎo)管可以置于患者體內(nèi)的各種位置，包括，例如，放置在頸部、胸部和腹股溝。對于血液透析來說，當(dāng)瘺在熟化時或移植物在手術(shù)后整合時，雙管腔導(dǎo)管可以被植入作為臨時血管通路。由于與導(dǎo)管相關(guān)的內(nèi)膜增生，隨后是在靜脈-導(dǎo)管的通路接合點處或在近端靜脈段處與導(dǎo)管相關(guān)的血栓形成，造成血管通路導(dǎo)管通常過早地失效。對于本發(fā)明來說，使用本發(fā)明的可植入材料處理提供了有益的自我平衡性環(huán)境，從而無論在導(dǎo)管放置時或更晚的階段與血管通路導(dǎo)管功能相關(guān)的并發(fā)癥，例如血栓形成、狹窄和/或凝結(jié)被減少。對于本發(fā)明來說，理解的是，血管通路導(dǎo)管功能的增強(qiáng)包括導(dǎo)管功能方面的任何改善，或?qū)Ч芫S持功能形式方面的任何改善。血管通路端口。根據(jù)某些實施方式，為血管通路創(chuàng)建的內(nèi)駐端口可以用本發(fā)明的可植入材料處理。端口可以置于患者體內(nèi)的各種位置，包括，例如，放置在臂、胸部和腹股溝中的靜脈或動脈位置。由于與端口相關(guān)的內(nèi)膜增生，隨后是在靜脈-端口接合點處或在近端靜脈節(jié)處與端口相關(guān)的血栓形成，導(dǎo)致血管通路端口一般過早地失效。
對于本發(fā)明來說，使用本發(fā)明的可植入材料處理提供了有益的自我平衡性環(huán)境，從而無論在端口放置時或更晚的階段與血管通路端口功能相關(guān)的并發(fā)癥，例如血栓形成、狹窄和/或凝結(jié)在端口處被減少。對于本發(fā)明來說，理解的是，血管通路端口功能的增強(qiáng)包括端口功能方面的任何改善，或端口維持功能形式方面的任何改善。一般問題。在本發(fā)明的某些實施方式中，在所述可植入材料的施用之前、同時或之后施用其他治療試劑。例如，可以施用防止或減少血凝塊形成、血小板凝聚或其他類似堵塞的試劑。示范性的試劑包括，例如，硫酸乙酰肝素和TGF-P。取決于植入物需要的臨床指標(biāo)，其他細(xì)胞因子或生長因子也可以摻入到可植入材料中，包括VEGF，來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞重生，以及包括b-FGF來促進(jìn)移植物整合。其他治療試劑種類包括，但不限于，抗增殖試劑和抗腫瘤試劑。實例包括雷帕霉素、紫杉醇(paclitaxel)和E2F誘物(Decoy)試劑。任何上述試劑可以局部地或全身地施用；如果局部地施用，某些試劑可以被包被在可植入材料內(nèi)或由所述細(xì)胞提供。 另外，介導(dǎo)積極的組織重塑的試劑也可以與在此描述的可植入材料實施方式組合施用。例如，某些試劑可以促進(jìn)在血管損傷的部位，包括外科位置處正常的或正常樣的管腔再生或腔組織重塑。再一次，這些試劑可以包含在所述可植入材料內(nèi)或由所述細(xì)胞提供。如臨床醫(yī)師所公認(rèn)的，足夠血液透析的血管通路需要血管通路結(jié)構(gòu)成熟和具有充足的血流。如在此其他地方說明的，熟化涉及在靜脈中發(fā)生的解剖變化，其允許透滲析期間重復(fù)的插管。允許重復(fù)性插管的某些改變涉及血管大小和/或血管壁增厚和/或管腔直徑。并且，如在此解釋的，某一些上述變化允許足夠支持透滲析的血流速度。此外，如在此其他地方說明的，臨床上失效的血管通路結(jié)構(gòu)是不能重復(fù)地將導(dǎo)管插入用于透滲析的結(jié)構(gòu)，和不能支持足以支持透滲析的血流的結(jié)構(gòu)。這些臨床失效可以直接與如上所述的解剖參數(shù)中的功能障礙直接相關(guān)。因而，本發(fā)明還提供了實現(xiàn)血管通路相關(guān)的臨床終點的方法，包括提高插管頻率、改善血管通路結(jié)構(gòu)血流、提高血管壁厚度、維持管腔直徑、和/或上述的組合，其中所述方法包括以有效實現(xiàn)一種或多種上述終點的數(shù)量在所述血管通路結(jié)構(gòu)處、鄰近或附近放置所述可植入材料的步驟。此外，本發(fā)明還提供了鑒定成功地熟化的血管通路結(jié)構(gòu)的方法，其中所述方法包括監(jiān)視以下臨床參數(shù)的任一項的步驟重復(fù)的插管；足夠在透滲析期間防止再循環(huán)的血流；血管壁增厚；足以在透滲析期間允許血液流動的管腔直徑，其中所述成功地熟化的血管通路結(jié)構(gòu)展現(xiàn)至少一種上述參數(shù)。本發(fā)明的可植入材料可以應(yīng)用于需要介入性治療以維持穩(wěn)態(tài)的任何管形解剖結(jié)構(gòu)。管形的解剖結(jié)構(gòu)包括血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、生殖泌尿系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、肺系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及腦和脊髓的室系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。如在此預(yù)期的，管形解剖結(jié)構(gòu)是具有內(nèi)部腔表面和腔外表面的那些結(jié)構(gòu)。對于本發(fā)明來說，腔外表面可以是但不限于管形結(jié)構(gòu)的外表面。在某些結(jié)構(gòu)中，所述內(nèi)部腔表面是內(nèi)皮細(xì)胞層；在某些其他結(jié)構(gòu)中，內(nèi)部腔表面是非內(nèi)皮細(xì)胞層。細(xì)胞來源。如在此描述的，本發(fā)明的可植入材料包括細(xì)胞。細(xì)胞可以是同種異體的、異種的或自體的。在某些實施方式中，活細(xì)胞的來源可以來自適合的供體。在某些其他實施方式中，細(xì)胞的來源可以來自尸體或來自細(xì)胞庫。在一個當(dāng)前優(yōu)選的實施方式中，所述細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實施方式中，這種內(nèi)皮細(xì)胞從血管組織獲得，優(yōu)選但不限于動脈組織。如以下例示的，適合使用的一種血管內(nèi)皮細(xì)胞是主動脈內(nèi)皮細(xì)胞。適合使用的另一種血管內(nèi)皮細(xì)胞是臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。以及，適合使用的另一種血管內(nèi)皮細(xì)胞是冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞。適合本發(fā)明使用的其他種類的血管內(nèi)皮細(xì)胞包括肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞和髂動脈內(nèi)皮細(xì)胞。在另一種當(dāng)前的優(yōu)選實施方式中，適合的內(nèi)皮細(xì)胞可以從非血管組織獲得。非血管組織可以來自此處的其他地方描述的任何管形解剖結(jié)構(gòu)，或可以來自任何非血管組織或器官。在又一個實施方式中，內(nèi)皮細(xì)胞可以來自內(nèi)皮祖細(xì)胞或干細(xì)胞；在又一個實施方式中，內(nèi)皮細(xì)胞可以一般地來自祖細(xì)胞或干細(xì)胞。在其他優(yōu)選的實施方式中，細(xì)胞可以是來自血管、非血管組織或器官的同種異體的、異種的或自體的非內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明還預(yù)期遺傳改變的、修飾的或工程化的任何上述細(xì)胞。
在進(jìn)一步的實施方式中，兩種或多種細(xì)胞被共培養(yǎng)來制備當(dāng)前的組合物。例如，第一細(xì)胞可以導(dǎo)入到生物相容的可植入材料中并培養(yǎng)直到融合。第一細(xì)胞類型可以包括，例如，平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的組合、任何其他期望的細(xì)胞類型或適合于創(chuàng)建有助于內(nèi)皮細(xì)胞生長的環(huán)境的期望細(xì)胞類型的組合。一旦第一細(xì)胞類型達(dá)到融合，第二細(xì)胞類型被播種到生物相容性基質(zhì)之中、之上或之內(nèi)的第一融合細(xì)胞類型的頂部，并培養(yǎng)直到第一細(xì)胞類型和第二細(xì)胞類型達(dá)到融合。第二細(xì)胞類型可以包括，例如，內(nèi)皮細(xì)胞或任何其他期望的細(xì)胞類型或細(xì)胞類型的組合。預(yù)期的是，第一和第二細(xì)胞類型可以逐步地、或作為單一混合物來引入。還預(yù)期的是，可以改變細(xì)胞密度來改變平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例。為了防止平滑肌細(xì)胞或其他傾向于過度增殖的細(xì)胞類型的過度增殖，可以修改培養(yǎng)過程。例如，在第一細(xì)胞類型融合之后，可以在引入第二細(xì)胞類型之前用適合于第二細(xì)胞類型的附著因子包被培養(yǎng)物。示范性的附著因子包括用明膠包被培養(yǎng)物來改善內(nèi)皮細(xì)胞的附著。根據(jù)另一個實施方式，肝素可以在培養(yǎng)第二細(xì)胞類型期間添加到培養(yǎng)基中來降低第一細(xì)胞類型的增殖并優(yōu)化期望的第一細(xì)胞類型與第二細(xì)胞類型的比例。例如，在平滑肌細(xì)胞的初步生長之后，可以施用肝素來控制平滑肌細(xì)胞生長以實現(xiàn)更大的內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞的比例。在優(yōu)選的實施方式中，通過首先用平滑肌細(xì)胞種植生物相容性可植入材料創(chuàng)建共培養(yǎng)物，來創(chuàng)建血管結(jié)構(gòu)。一旦平滑肌細(xì)胞達(dá)到融合，將內(nèi)皮細(xì)胞播種到可植入材料上培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞表面頂部來創(chuàng)建模擬的血管。這種實施方式可以根據(jù)在此描述的方法應(yīng)用至|J，例如，AV移植物或外周旁路移植物，來促進(jìn)修復(fù)性移植物材料的整合。所有需要的是，當(dāng)前組合物的細(xì)胞展現(xiàn)一種或多種優(yōu)選的表型或功能性質(zhì)。如在此較早描述的，本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)當(dāng)與優(yōu)選的基質(zhì)(在此其他地方描述)相連時具有可易于鑒定的表型的細(xì)胞可以促進(jìn)、修復(fù)和/或以其他方式調(diào)節(jié)與血管通路結(jié)構(gòu)例如動靜脈瘺或動靜脈移植物的處理相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生理機(jī)能和/或腔穩(wěn)態(tài)。對于本發(fā)明來說，本發(fā)明的細(xì)胞的一種這樣優(yōu)選的、可易于鑒定的典型表型是抑制或以其他方式干擾血管平滑肌細(xì)胞增殖的能力，如以下描述的體外分析所測定的。這在此稱為抑制性表型。由當(dāng)前組合物的細(xì)胞展現(xiàn)的另一種可容易鑒定的表型是，它們是抗血栓性的或能夠抑制血小板粘附和聚集。抗血栓活性可以使用如下所述的體外硫酸乙酰肝素分析和/或體外血小板凝聚分析來測定。在本發(fā)明的典型操作性實施方式中，細(xì)胞不必展現(xiàn)超過一種上述表型。在某些實施方式中，細(xì)胞可以展現(xiàn)超過一種上述表型。雖然上述表型各自代表了功能性的內(nèi)皮細(xì)胞，例如但不限于血管內(nèi)皮細(xì)胞，但是展現(xiàn)了這種表型的非內(nèi)皮細(xì)胞對于本發(fā)明來說被考慮為內(nèi)皮樣的，并因而適用于本發(fā)明。內(nèi)皮樣的細(xì)胞在此也稱為內(nèi)皮細(xì)胞的功能類似物；或內(nèi)皮細(xì)胞的功能模擬物。因而，僅僅舉例來說，適用于在此公開的材料和方法的細(xì)胞還包括產(chǎn)生內(nèi)皮樣細(xì)胞的干細(xì)胞或祖細(xì)胞；非內(nèi)皮細(xì)胞來源的但功能上表現(xiàn)像使用在此列出的參數(shù)的內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞；任何來源的、被工程化或以其他方式被修飾以具有使用在此列出的參數(shù)的內(nèi)皮樣功能的細(xì)胞。一般地，當(dāng)以融合、近融合或融合后群體存在并與例如在此其他地方描述的優(yōu)選的生物相容性基質(zhì)相連時，本發(fā)明的細(xì)胞展現(xiàn)一種或多種上述表型。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的是，細(xì)胞的融合、近融合或融合后群體可以通過各種技術(shù)容易地鑒定，最常見和廣泛 接受的技術(shù)是直接顯微鏡檢查。其他的技術(shù)包括使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞計數(shù)技術(shù)評估單位表面積的細(xì)胞數(shù)量，所述標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞計數(shù)技術(shù)例如但不限于血球計數(shù)器或庫爾特計數(shù)器。另外，對于本發(fā)明來說，內(nèi)皮樣細(xì)胞包括但不限于功能上和表型上模仿或模擬融合的、近融合的或融合后內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞，如通過在此所列的參數(shù)所測量的。因而，使用以下闡述的詳細(xì)說明和指導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)的醫(yī)師將理解如何生產(chǎn)、使用、測試和鑒定在此公開的可植入材料的操作性實施方式。也就是說，在此提供的教導(dǎo)公開了制備和使用本發(fā)明的可植入材料所必需的所有內(nèi)容。進(jìn)一步的，在此提供的教導(dǎo)公開了鑒定、制備和使用含有操作上等效的細(xì)胞的組合物所必需的所有內(nèi)容。實際上，所有需要的是含等效細(xì)胞的組合物對于根據(jù)在此公開的方法處理血管通路結(jié)構(gòu)是有效的。熟練醫(yī)師將理解的是，當(dāng)前組合物的等效實施方式可以僅使用常規(guī)實驗和在此提供的教導(dǎo)來鑒定。在某些優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的可植入材料中使用的內(nèi)皮細(xì)胞從人類尸體供體的主動脈分離。每一批細(xì)胞來自單個或多個供體，廣泛地測試內(nèi)皮細(xì)胞純度，生物學(xué)功能，以及細(xì)菌、真菌、已知的人類病原體和其他外來試劑的存在。使用公知的技術(shù)低溫保存細(xì)胞并入庫，用于稍后在培養(yǎng)中擴(kuò)增，從而隨后配制在生物相容性可植入材料中。細(xì)胞制備。如上所述，適合的細(xì)胞可以從各種組織類型和細(xì)胞類型獲得。在某些優(yōu)選的實施方式中，可植入材料中使用的人類主動脈內(nèi)皮細(xì)胞分離自尸體供體的主動脈。在其他實施方式中，豬的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(Cell Applications, San Diego, CA)通過用于分離人類主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的相似操作分離自正常的豬主動脈。每一批細(xì)胞來自單個或多個供體，廣泛地測試內(nèi)皮細(xì)胞活力，純度，生物學(xué)功能，以及支原體、細(xì)菌、真菌、酵母、已知的人類病原體和其他外來試劑的存在。使用公知的技術(shù)進(jìn)一步擴(kuò)增、表征和低溫保存細(xì)胞，形成處于第三到第六次傳代的工作細(xì)胞庫，用于稍后在培養(yǎng)中擴(kuò)增，從而隨后配制到生物相容性可植入材料中。在通過在每個燒瓶中添加約15ml內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基預(yù)處理的T-75燒瓶中制備人或豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞。人類主動脈內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)皮生長培養(yǎng)基(EGM-2，CambrexBiosciences, East Rutherford, NJ)中制備。EGM-2 由補(bǔ)充有含 2% FBS 的 EGM-2 單等分量(singlequot)的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBM-2, Cambrex Biosciences)構(gòu)成。豬細(xì)胞在補(bǔ)充有5% FBS和50ii g/ml慶大霉素的EBM-2中制備。將燒瓶置于維持在約37°C和5%C02/95%空氣、90%濕度的孵化器中至少30分鐘。從一 160°C到一 140°C冷凍器中移出一個或兩個細(xì)胞的小瓶，在約37°C解凍。每個解凍細(xì)胞的小瓶以大約3X IO3個細(xì)胞每cm3的密度、優(yōu)選不低于I. OX IO3和不超過7. OX IO3的密度播種到兩個T-75燒瓶中；將含有上述細(xì)胞的燒瓶放回孵化器中。在約8 — 24小時之后，除去消耗了的培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基替換。每兩到三天更換培養(yǎng)基，此后，直到細(xì)胞達(dá)到約85 - 100%的融合，但優(yōu)選不低于60%和不超過100%。當(dāng)所述可植入材料預(yù)計用于臨床應(yīng)用時，在人類主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的解凍后培養(yǎng)中和本發(fā)明的可植入材料的制備中僅使用無抗生素的培養(yǎng)基。然后除去內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基，用IOml HEPES緩沖鹽水(HEPES)沖洗單細(xì)胞層。除去HEPESj^W 2ml胰蛋白酶來從T-75燒瓶表面剝離細(xì)胞。一旦發(fā)生分離，添加3ml胰蛋白酶中和溶液(TNS)來終止酶反應(yīng)。添加另外5ml HEPES，使用血球計對細(xì)胞計數(shù)。離心細(xì)胞懸浮液，對于人類細(xì)胞，使用無抗生素的EGM-2調(diào)節(jié)到密度大約I. 75X IO6個細(xì)胞/ml，或?qū)τ谪i細(xì)胞，使用補(bǔ)充有5% FBS和50ii g/ml慶大霉素的EBM-2調(diào)節(jié)到密度大約I. 50 X IO6個細(xì)胞/ml。 生物相容性基質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，所述可植入材料包含生物相容性基質(zhì)。所述基質(zhì)對于細(xì)胞生長和附著到基質(zhì)之上或之內(nèi)是容許的。所述基質(zhì)是柔性的和貼附的(conformab I e )。所述基質(zhì)可以是固體、半固體或可流動的多孔組合物。對于本發(fā)明來說，可流動組合物是指可以利用注射或注射型遞送裝置，例如但不限于，針、注射器或?qū)Ч苁┯玫慕M合物。采用擠壓、噴出或排出的其他遞送裝置在此也是預(yù)期的。多孔基質(zhì)是優(yōu)選的。優(yōu)選的可流動組合物是保持形狀的。所述基質(zhì)也可以是具有柔性平面形式。所述基質(zhì)也可以是凝膠、泡沫、懸浮液、顆粒、微載體、微囊或纖維結(jié)構(gòu)的形式。當(dāng)前優(yōu)選的基質(zhì)具有顆粒形式。所述基質(zhì)，例如當(dāng)植入到血管的外表面上時，在其生物侵蝕之前可以存留在植入位置至少約56 — 84天,優(yōu)選約至少7天,更優(yōu)選約至少14天,最優(yōu)選約至少28天。一種優(yōu)選的基質(zhì)是Gelfoam (Pfizer, New York, NY),—種可被吸收的明膠海綿(以下稱“Gelfoam基質(zhì)”)。Gelfoam基質(zhì)是從特別處理的、純化的豬皮明膠溶液制備的多孔的和柔性的外科海綿。根據(jù)另一個實施方式，所述生物相容性基質(zhì)材料可以是經(jīng)修飾的基質(zhì)材料。當(dāng)細(xì)胞與基質(zhì)相連時，可以選擇對基質(zhì)材料的修飾，來優(yōu)化和/或控制細(xì)胞的功能，包括如上所述的細(xì)胞的表型(例如，抑制性表型)。根據(jù)一個實施方式，對基質(zhì)材料的修飾包括用附著因子或增強(qiáng)細(xì)胞抑制平滑肌細(xì)胞增殖能力的粘附肽來包被所述基質(zhì)，以降低炎癥、提高硫酸乙酰肝素產(chǎn)量、提高前列環(huán)素產(chǎn)量，和/或提高TGF-P1產(chǎn)量。示范性的附著因子包括，例如，纖連蛋白、血纖蛋白凝膠、和利用標(biāo)準(zhǔn)的水成碳二亞胺化學(xué)作用(aqueouscarbodiimide)共價連接的細(xì)胞粘附配體(包括例如RGD)。其他細(xì)胞粘附配體包括具有細(xì)胞粘附識別序列的肽，所述細(xì)胞粘附識別序列包括但不限于RGDY、REDVY, GRGDF, GPDSGR、GRGDY 和 REDV。根據(jù)另一個實施方式，所述基質(zhì)是Gelfoam以外的基質(zhì)。其他示范性的基質(zhì)材料包括，例如，血纖蛋白凝膠、藻酸鹽、聚苯乙烯磺酸鈉微載體、膠原包被的葡聚糖微載體、PLA/PGA和pHEMA/MMA共聚物(每種共聚物的聚合比例從I 一 100%)。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，這些其他的基質(zhì)被修飾以包括附著因子或粘附肽，如以上敘述和描述的。示范性的附著因子包括，例如，明膠、膠原、纖連蛋白、血纖蛋白凝膠、和利用標(biāo)準(zhǔn)的水成碳二亞胺化學(xué)作用共價連接的細(xì)胞粘附配體(包括RGD)。其他細(xì)胞粘附配體包括具有細(xì)胞粘附識別序列的肽，所述細(xì)胞粘附識別序列包括但不限于RGDY、REDVY, GRGDF, GPDSGR、GRGDY和REDV。根據(jù)另一個實施方式，所述生物相容性基質(zhì)材料被物理地修飾來改善對基質(zhì)的細(xì)胞附著。根據(jù)一個實施方式，所述基質(zhì)被交聯(lián)來增強(qiáng)它的機(jī)械性能，和改善它的細(xì)胞附著和生長性質(zhì)。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，首先使用硫酸鈣交聯(lián)藻酸鹽基質(zhì)，隨后是使用氯化鈣和常規(guī)方案實施第二交聯(lián)步驟。根據(jù)又一個實施方式，改變所述生物相容性基質(zhì)的孔徑大小。優(yōu)選的基質(zhì)孔徑大小是約25 ii m到約100 V- m ;優(yōu)選約25 y m到50 y m ;更優(yōu)選約50 y m到75 y m ;進(jìn)一步優(yōu)選約75 ii m到100 u m。其他優(yōu)選的孔徑大小包括低于約25 y m和高于約100 u m的孔徑大小。根據(jù)一個實施方式，所述孔徑大小使用鹽浸出技術(shù)來改變。氯化鈉被混合到基質(zhì)材料和溶劑的溶液中，將溶液注入模具中，容許溶劑蒸發(fā)。然后將基質(zhì)/鹽塊浸入水中，鹽浸出并留 下多孔結(jié)構(gòu)。選擇溶劑使得基質(zhì)溶于溶液中而鹽不溶。一種示范性的溶液包括PLA和二氯甲烷。根據(jù)可選擇的實施方式，將二氧化碳?xì)馀菀氲椒枪虘B(tài)形式的基質(zhì)中，然后用合適的表面活性劑穩(wěn)定。隨后利用真空除去氣泡，留下多孔結(jié)構(gòu)。根據(jù)另一個實施方式，采用凍干技術(shù)來控制基質(zhì)的孔徑大小，利用冰微粒的冷凍速度來形成不同大小的孔徑。例如，約0. I - 2%豬或牛明膠的明膠溶液可以注入到模具或平皿中，并在各種不同溫度預(yù)先冷凍，然后凍干一段時間。然后可以利用，優(yōu)選的，紫外光(254nm)或通過添加戊二醛(甲醛)來交聯(lián)材料。預(yù)冷凍溫度(例如，一 20°C、一 80°C或一180°C)、凍干溫度(在約一 50°C凍干)和明膠濃度(0. 1%到2. 0% ;孔徑大小一般與溶液中明膠的濃度成反比)的變化都可能影響產(chǎn)生的基質(zhì)材料的孔徑大小，并且可以被修改來產(chǎn)生優(yōu)選的材料。熟練技術(shù)人員將理解，適合的孔徑大小是促進(jìn)和維持具有在此其他地方描述的表型的最佳的細(xì)胞群體的孔徑大小。柔性平面形式。如在此教導(dǎo)的，平面形式的生物相容性基質(zhì)可以配置成各種形狀和大小，優(yōu)選適合于植入在瘺、移植物、外周移植物或其他血管通路結(jié)構(gòu)和其周圍之處、鄰近或附近的形狀和大小，所述形狀和大小能夠貼附通路結(jié)構(gòu)和其相連血管的輪廓化表面。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，調(diào)整單片基質(zhì)的大小并配置單片基質(zhì)，以應(yīng)用于要處理的特定血管通路結(jié)構(gòu)。根據(jù)一個實施方式，所述生物相容性基質(zhì)被配置為柔性平面形式。為向管狀結(jié)構(gòu)例如但不限于血管施用，或為向血管通路結(jié)構(gòu)例如但不限于血管接合點施用而配置的示范性的實施方式在圖I中說明。長度、寬度、厚度和表面積的特征沒有按比例或以成比例方式在圖I中描繪；圖I是非限制性的示例性實施方式。參考圖1，柔性平面形式20由一片合適的生物相容性基質(zhì)形成。所有需要的是，柔性平面形式20是柔性的、貼附的和/或適合于管狀結(jié)構(gòu)例如血管的輪廓化的外表面。柔性平面形式20可以接觸血管的外表面，可以包裹外表面，或可以卷繞外表面。根據(jù)圖2A中說明的一個示范性實施方式，輪廓化的柔性平面形式20’可以被配置以含有可分界的區(qū)域，例如體30，連接到橋50，連接到片40。片40是可通過橋50從體30分離的，而這幾個區(qū)域形成連續(xù)的整體。根據(jù)一個示范性實施方式，這幾個區(qū)域的內(nèi)部邊緣被設(shè)置來限定輪廓化的柔性平面形式20'中的內(nèi)部槽隙60。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，限定內(nèi)部槽隙60的這幾個區(qū)域進(jìn)一步限定了位于輪廓化的柔性平面形式20’內(nèi)部的第一端點62，位于輪廓化的柔性平面形式20’的外部邊緣上的第二端點64，以及寬度66。在這個特定的不范性實施方式中，第一端點 62處在片40和橋50之間的邊界上；第二端點64處在片40和體30之間的邊界上。在某些實施方式中，預(yù)期的是由以上描述的片40、體30和橋50限定槽隙60的寬度66，優(yōu)選是約0. 01到約0. 04，更優(yōu)選約0. 05到約0. 08，最優(yōu)選約0. 06英寸。優(yōu)選的，柔性平面形式20’的槽隙60的寬度66具有足夠的尺寸，以阻止移接的細(xì)胞形成跨越槽隙60的寬度66的不間斷的融合層或細(xì)胞橋。然而預(yù)期的是，限定槽隙60和槽隙寬度66的實施方式可以如在此描述的使用，即使僅僅通過切割或以其他方式阻斷這種細(xì)胞層或細(xì)胞橋而使細(xì)胞跨越寬度66。本發(fā)明進(jìn)一步預(yù)期圖I的柔性平面形式20’可以適合于在即將使用之前限定槽隙60，僅通過指導(dǎo)熟練醫(yī)師使用解剖刀或其他刀具來部分地切割所述平面形式，從而限定槽隙。部分地，在此公開的發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，輪廓化的或貼附的柔性平面形式容許可植入材料最佳地應(yīng)用到管狀結(jié)構(gòu)而不損害植入物或移接其上的細(xì)胞的完整性。一種優(yōu)選的實施方式優(yōu)化了與手術(shù)處理的血管的解剖結(jié)構(gòu)的接觸和相符，并控制可植入材料疊蓋的程度。可植入材料在外膜間隙內(nèi)的過度疊蓋可以在處理的血管上引起壓力點，潛在地限制血流通過血管或產(chǎn)生其他可能延遲和/或抑制穩(wěn)態(tài)和正常痊愈的破壞。熟練醫(yī)師將認(rèn)識到植入時的過度疊蓋，并將認(rèn)識到重新放置或改變例如修整可植入材料的需要。另外，在其他實施方式中，可植入材料的疊蓋能夠引起散布在可植入材料內(nèi)的治療試劑的過量給藥。如在此其他地方描述的，化學(xué)物質(zhì)或其他外源提供的治療試劑可以任選地添加到植入物中。在某些其他實施方式中，這種試劑可以添加到生物相容性基質(zhì)并在不存在細(xì)胞的情況下施用；在這種方式下使用的生物相容性基質(zhì)任選的限定槽隙。相比之下，不充分接觸目標(biāo)管狀結(jié)構(gòu)的可植入材料能夠引起對該移接的細(xì)胞所提供的臨床益處的不充分暴露，或添加到所述可植入材料中的治療試劑的不足給藥。熟練的醫(yī)師將認(rèn)識到在植入時次最優(yōu)接觸對于重新放置和/或其他可植入材料的需要。可流動組合物。在此處預(yù)期的某些實施方式中，本發(fā)明的可植入材料是包含顆粒狀生物相容性基質(zhì)的可流動組合物。用于能夠通過進(jìn)入血管內(nèi)部長度來管腔內(nèi)(血管內(nèi))施用、或通過透皮局部施用的可注射型遞送裝置的、任何非固體可流動組合物是此處預(yù)期的。可流動組合物優(yōu)選的是保持形狀的組合物。因而，在此處預(yù)期的、在可流動型顆粒狀基質(zhì)之中、之上或之內(nèi)包含細(xì)胞的可植入材料，可以被配制用于任何可注射遞送裝置，所述遞送裝置內(nèi)徑范圍從約22規(guī)格(gauge)到約26規(guī)格，并能夠遞送約50mg包含顆粒材料、在約I到約3ml中含有約I百萬個細(xì)胞的可流動組合物。根據(jù)當(dāng)前優(yōu)選的實施方式，可流動組合物包含生物相容的顆粒狀基質(zhì)，例如Gelfoam 顆粒、Gelfoam 粉末或粉碎的Gelfoam (Pfizer Inc.，New York, NY)(以下稱“Gelfoam顆粒”)，其為來自豬皮明膠的產(chǎn)品。根據(jù)另一種實施方式，所述顆粒狀基質(zhì)是Cytodex-3 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)微載體，包含與交聯(lián)葡聚糖的基質(zhì)聯(lián)結(jié)的變性膠原。根據(jù)可選擇的實施方式，所述生物相容性可植入顆粒狀基質(zhì)是經(jīng)修飾的生物相容性基質(zhì)。修飾包括以上對于可植入基質(zhì)材料描述的那些。適合按這種方式使用的可流動組合物的實例在同一天提交的共同待決申請PCT/
US_ (代理人編號No. ELV — 008PC)中公開，其完整內(nèi)容通過引用并入本文；以
及在同一天提交的共同待決申請PCT/US_(代理人編號No. ELV - 009PC)
中公開，其完整內(nèi)容通過引用并入本文。生物相容性基質(zhì)的細(xì)胞播種。適合的生物相容性基質(zhì)的預(yù)先切割的片段或適合的生物相容性可流動基質(zhì)的等分量，通過添加沒有抗生素的EGM-2在大約37°C和5% C02/95%空氣中重新水化12到24小時。然后從它們的重新水化容器中移出可植入材料，放置到各個組織培養(yǎng)平皿中。生物相容性基質(zhì)以大約1.5 — 2. OX IO5個細(xì)胞(I. 25 -
I.66X IO5個細(xì)胞/cm3基質(zhì))的優(yōu)選的密度播種，放置到維持在大約37°C和5% C02/95%空氣、90%濕度的孵化器中3 - 4小時以促進(jìn)細(xì)胞附著。播種的基質(zhì)然后放置到各個容器(American Master Tech, Lo di, CA)管中，各自裝有帶0. 2 ii m過濾器的帽子和EGM-2,在大約37°C和5%C02/95%空氣下孵育。每兩到三天更換培養(yǎng)基，此后，直到細(xì)胞達(dá)到融合。在一個優(yōu)選的實施方式中的細(xì)胞優(yōu)選是第6次傳代，但是可以使用更少或更多次傳代的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的其他實施方式的其可植入材料制備方案在提交的共同待決申請PCT/US_
(代理人編號No. ELV - 009PC)中公開，其完整內(nèi)容通過引用并入本文。細(xì)胞生長曲線和融合。在或大約在第3或4、6或7、9或10、和12或13天移出可植入材料的樣品，計數(shù)細(xì)胞并評定活力，構(gòu)建生長曲線和評估以評估生長特點，和確定是否達(dá)到融合、近融合或融合后。在圖3A和圖3B中呈現(xiàn)了來自包含豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞植入物的可植入材料的兩個制品的代表性生長曲線。在這些實例中，所述可植入材料具有柔性平面形式。一般地，普通技術(shù)人員將理解早期、中期和晚期時間點的可接受細(xì)胞生長的特征，例如在早期時間點觀察到細(xì)胞數(shù)量增加(當(dāng)參考圖3A時，約2 — 6天之間)，隨后是近融合階段(參考圖3A時，在約6 - 8天之間)，隨后是一旦細(xì)胞達(dá)到融合時細(xì)胞數(shù)量的平臺期(參考圖3A時，在約8 — 10天之間)，和當(dāng)細(xì)胞是融合后時細(xì)胞數(shù)量的維持(參考圖3A時，在約10 - 14天之間)。對于本發(fā)明來說，處于平臺期至少72小時的細(xì)胞群體是優(yōu)選的。通過使用0. 8mg/ml膠原酶在胰蛋白酶-EDTA溶液中形成的溶液完全消化可植入材料的等分量，實現(xiàn)細(xì)胞計數(shù)。在測量消化的可植入材料的體積之后，用0.4%錐蟲藍(lán)稀釋已知體積的細(xì)胞懸液(細(xì)胞錐蟲藍(lán)為4:1)，通過錐蟲藍(lán)排阻評定活力。使用血球計數(shù)器計數(shù)活細(xì)胞、非存活細(xì)胞和總細(xì)胞。通過將活細(xì)胞數(shù)目相對于培養(yǎng)天數(shù)作圖來構(gòu)建生長曲線。在達(dá)到融合之后將細(xì)胞裝運和移植。對于本發(fā)明來說，融合被定義為當(dāng)可植入材料是柔性平面形式(I. 0X4. 0X0. 3cm)時存在至少約4X IO5個細(xì)胞/cm3，當(dāng)是柔性組合物時優(yōu)選每等分量(50 - 70mg)約7 X IO5到I X IO6個總細(xì)胞。對這兩者，細(xì)胞活力至少約90%，但優(yōu)選不低于80%。如果到第12或13天細(xì)胞不融合，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育一天。繼續(xù)這個過程直到達(dá)到融合或直到播種后14天。在第14天，如果細(xì)胞沒有融合，全部丟棄。如果在進(jìn)行過程中檢查之后確定細(xì)胞是融合的，進(jìn)行最后的培養(yǎng)基更換。這種最后的培養(yǎng)基更換使用沒有酚紅和沒有抗生素的EGM-2進(jìn)行。在培養(yǎng)基更換之后立刻地給試管裝上無菌栓塞密封帽用于裝運。功能評估。對于在此描述的發(fā)明來說，在植入之前進(jìn)一步測試可植入材料的功能。例如，在培養(yǎng)期間收集條件培養(yǎng)基來確定培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的硫酸乙酰肝素、轉(zhuǎn)化生長因子-P i (TGF-0 :)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)和氧化氮的水平。在某些優(yōu)選的實施方式中，當(dāng)總細(xì)胞是至少約2、優(yōu)選至少約4X IO5個細(xì)胞/cm3的柔性平面形式；活細(xì)胞的百分比是至少約80 - 90%、優(yōu)選彡90%、最優(yōu)選至少約90% ;條件培養(yǎng)基中硫酸乙酰肝素是至少約0. 5 — I. O、優(yōu)選至少約I. 0微克/IO6個細(xì)胞/天時，所述可植入材料可以用于在此描述的目的。在條件培養(yǎng)基中TGF-P丨是至少約200 - 300、優(yōu)選至少約300皮克/ml/天；條件培養(yǎng)基中的b-FGF是少于約200皮克/ml、優(yōu)選不超過約400皮克/ml。硫酸乙酰肝素水平可以使用常規(guī)的二甲基亞甲基藍(lán)色-軟骨素酶ABC消化分光光度分析來測定。總硫酸化糖胺聚糖(GAG)水平使用二甲基亞甲基藍(lán)(DMB)染料結(jié)合分析來測定，其中未知樣品與使用在集中培養(yǎng)基中稀釋的已知數(shù)量的純化硫酸軟骨素產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。在添加DMB顯色試劑之前將其他的條件培養(yǎng)基樣品與軟骨素酶ABC混合來消化 軟骨素和硫酸皮膚素。在與GAG標(biāo)準(zhǔn)物混合的DMB染料的最大波長吸光度下，一般約515 —525nm下，測定所有的吸光度。通過從條件培養(yǎng)基樣品中的總硫酸化糖胺聚糖濃度中減去軟骨素和硫酸皮膚素的濃度，計算每IO6個細(xì)胞每天的硫酸乙酰肝素濃度。軟骨素酶ABC活性通過消化純化的硫酸軟骨素樣品來確認(rèn)。如果低于100%的純化的硫酸軟骨素被消化，適當(dāng)?shù)匦Ｕ龡l件培養(yǎng)基樣品。硫酸乙酰肝素水平也可以使用采用單克隆抗體的ELISA分析來測定。TGF-P1和b-FGF水平可以使用采用單克隆或多克隆抗體、優(yōu)選多克隆抗體的ELISA分析來測定。對照集中培養(yǎng)基也可以使用ELISA分析來測定，根據(jù)對照培養(yǎng)基中存在的TGF- P !和b-FGF水平適當(dāng)?shù)匦Ｕ龢悠贰Ｑ趸?NO)水平可以使用標(biāo)準(zhǔn)的格里斯反應(yīng)分析來測定。氧化氮的短暫和揮發(fā)性特性使他不適合大多數(shù)檢測方法。然而，氧化氮的兩種穩(wěn)定的分解產(chǎn)物，硝酸鹽(NO3)和亞硝酸鹽(NO2)可以使用常規(guī)光度方法來檢測。在存在硝酸鹽還原酶的情況下，格里斯反應(yīng)分析酶學(xué)地轉(zhuǎn)化硝酸鹽成為亞硝酸鹽。作為有色的偶氮染料產(chǎn)物以色譜方式檢測亞硝酸鹽，在約540nm的范圍內(nèi)吸收可見光。系統(tǒng)中存在的氧化氮的水平通過以下方法測定轉(zhuǎn)化所有的硝酸鹽為亞硝酸鹽、測定未知樣品中亞硝酸鹽的總濃度、然后比較產(chǎn)生的亞硝酸鹽的濃度與使用轉(zhuǎn)變成亞硝酸鹽的已知數(shù)量的硝酸鹽產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用如上所述的定量硫酸乙酰肝素、TGF-^1, NO和/或b_FGF分析，以及如下的對平滑肌細(xì)胞生長和血栓形成抑制作用的定量體外分析，來評定較早描述的優(yōu)選的抑制性表型。對于本發(fā)明來說，當(dāng)一種或多種這些可選擇的體外分析確定了可植入材料展現(xiàn)優(yōu)選的抑制性表型時，可植入材料準(zhǔn)備好用于植入。為了評估對體外的平滑肌細(xì)胞生長的抑制作用，測定與培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的抑制作用大小。豬或人類主動脈平滑肌細(xì)胞稀疏地播種到24孔組織培養(yǎng)平板中的平滑肌細(xì)胞生長培養(yǎng)基(SmGM-2，Cambrex BioScience)中。容許細(xì)胞附著24小時。然后使用含有
0.2% FBS的平滑肌細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SmBM)替換該培養(yǎng)基達(dá)48 — 72小時來延滯細(xì)胞生長。從融合后內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物制備條件培養(yǎng)基，用2XSMC生長培養(yǎng)基I :1稀釋，并添加到培養(yǎng)物中。對平滑肌細(xì)胞生長的抑制作用的陽性對照被包括在每個分析中。在三到四天之后，使用庫爾特計數(shù)器計數(shù)每個樣品中的細(xì)胞數(shù)量。通過比較即將添加條件培養(yǎng)基之前每反應(yīng)孔的平滑肌細(xì)胞數(shù)目和暴露于條件培養(yǎng)基之后三到四天的數(shù)目，以及對照培養(yǎng)基的數(shù)目(有和沒有添加生長因子的標(biāo)準(zhǔn)生長培養(yǎng)基)，測定條件培養(yǎng)基對平滑肌細(xì)胞增殖的影響。與條件培養(yǎng)基樣品相關(guān)的抑制作用的大小同與陽性對照相關(guān)的抑制作用的大小相比較。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，如果條件培養(yǎng)基抑制了肝素對照物所能抑制的量約20%，所述可植入材料被認(rèn)為是抑制性的。為了評估體外的血栓形成抑制作用，測定與培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的硫酸乙酰肝素水平。硫酸乙酰肝素具有抗增殖和抗血栓性質(zhì)。使用以上詳細(xì)描述的常規(guī)的二甲基亞甲基藍(lán)-軟骨素酶ABC分光光度法分析或ELISA分析，計算出每IO6個細(xì)胞的硫酸乙酰肝素的濃度。當(dāng)條件培養(yǎng)基中的硫酸乙酰肝素是至少約0.5 — I. O、優(yōu)選至少約1.0微克/IO6個細(xì)胞/天時，所述可植入材料可以用于在此描述的目的。評估血栓形成抑制作用的另一種方法涉及測定與富血小板血漿相關(guān)的體外血小板凝聚抑制作用的大小。通過在室溫下向豬血液樣品添加檸檬酸鈉來獲得豬血漿。檸 檬酸化的血漿以柔和的速度離心，來將血紅細(xì)胞和白細(xì)胞提取到團(tuán)粒(pellet)中，留下血小板懸浮在血漿中。從融合后內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物制備條件培養(yǎng)基，并添加到富血小板血漿的等分量中。向血漿添加血小板聚集劑(激動劑)作為對照。血小板激動劑通常包括花生四烯酸(arachidonate)、ADP、膠原、腎上腺素和瑞斯托菌素(ristocetin)(可從Sigma-Aldrich Co.，St. Louis, MO獲得)。其他的血衆(zhòng)等分量不添加血小板激動劑或條件培養(yǎng)基，來評定基線的自發(fā)血小板凝聚。用于抑制血小板凝聚的陽性對照也被包括在每個分析中。示范性的陽性對照包括阿斯匹林、肝素、阿昔單抗(abciximab)(ReoPro , Eli Lilly, Indianapolis, IN)、替羅非班(tirofiban) (Aggrastat , Merck &Co. , Inc. , Whitehouse Station,NJ)或依替巴妝(eptifibatide)(IntegHlill , Vli LlenniumPharmaceuticals, Inc. , Cambridge, MA)D然后使用聚集計測量所有測試條件的產(chǎn)生的血小板聚集。聚集計通過監(jiān)視光密度來測量血小板聚集。血小板聚集時，更多的光線可以通過樣本。聚集計以“血小板聚集單位”報告結(jié)果，這是血小板聚集速度的函數(shù)。作為在添加激動劑之后6分鐘的最大聚集來評定聚集。通過比較添加條件培養(yǎng)基之前的基線血小板聚集以及富血小板血漿暴露于條件培養(yǎng)基之后的血小板聚集，以及比較陽性對照，來測定條件培養(yǎng)基對血小板聚集的影響。結(jié)果表示為占基線的百分比。與條件培養(yǎng)基樣品相關(guān)的抑制作用的大小同與陽性對照相關(guān)的抑制作用的大小相比較。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，如果條件培養(yǎng)基抑制了陽性對照所能抑制的約20%，所述可植入材料被認(rèn)為是抑制性的。當(dāng)準(zhǔn)備植入時，具有柔性平面形式的可植入材料供應(yīng)至最終產(chǎn)物容器中，各自優(yōu)選含有1X4X0. 3cm (I. 2cm3)的無菌片，所述無菌片具有優(yōu)選大約5 — 8X 105、優(yōu)選至少約4 X IO5個細(xì)胞/cm3，和至少約90 %的活細(xì)胞，例如，來自單一尸體供體來源的人類主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，每立方厘米，在大約45 - 60ml、優(yōu)選約50ml內(nèi)皮生長培養(yǎng)基中(例如，不包含酚紅和抗生素的內(nèi)皮生長培養(yǎng)基(EGM-2)。當(dāng)使用豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞時，生長培養(yǎng)基也是不包含酚紅的EBM-2，但補(bǔ)充有5% FBS和50 u g/ml慶大霉素。在其他優(yōu)選的實施方式中，包含可流動顆粒形式的可植入材料在最終產(chǎn)物容器中提供，包括，例如，裝備有過濾帽子的密封的組織培養(yǎng)容器或預(yù)先裝載的注射器，各自優(yōu)選含有約50 — 60mg顆粒材料，使用約7 X IO5到約I X IO6個總內(nèi)皮細(xì)胞移接，這些細(xì)胞存在于每等分量約45 — 60ml、優(yōu)選約50ml內(nèi)皮生長培養(yǎng)基中。可植入材料的貨架壽命。包含融合、近融合或融合后細(xì)胞群體的可植入材料可以在室溫下以穩(wěn)定和存活條件維持至少兩周。優(yōu)選的，這種可植入材料被保持在約45 -60ml、更優(yōu)選50ml有或沒有額外的FBS的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基包含沒有酚紅的EGM-2培養(yǎng)基。FBS可以添加到轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的體積中，直至約10% FBS，或約12% FBS的總濃度。然而，由于FBS必需在植入之前從可植入材料中除去，優(yōu) 選的是限制轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中使用的FBS的數(shù)量來降低植入前所需的清洗時長。可植入材料的低溫保存。包含融合的細(xì)胞群體的融合可植入材料可以被低溫保存，用于保存和/或轉(zhuǎn)運到臨床，而在最后解凍時不降低它的臨床效力或完整性。優(yōu)選的，所述可植入材料低溫保存在15ml冷凍管(Nalgene , Nalge Nunc Int’ I, Rochester, NY)中、存在于含有約5 %到20 % DMS0、約2 — 8 %葡聚糖和約50 — 75 % FBS的約5ml CryoStorCS-10溶液(BioLife Solutions, Oswego, NY)中。將冷凍管置于冷異丙醇(或控制冷凍速度的任何這樣的試劑中)水浴中，轉(zhuǎn)移到約一 80°C冷凍器約4小時，隨后轉(zhuǎn)移到液氮中(約一150 到一165。。)。可植入材料的低溫保存的等分量然后在室溫下慢慢解凍約15分鐘，隨后在室溫水浴中繼續(xù)解凍大約15分鐘。然后在約15ml洗滌培養(yǎng)基中洗滌材料約3次。洗滌培養(yǎng)基包含沒有酚紅、有50 u g/ml慶大霉素的EBM。前兩次清洗操作在室溫下進(jìn)行約5分鐘。最終的清洗操作在37°C在5% CO2中進(jìn)行約30分鐘。在解凍和清洗操作之后，容許低溫保存的材料在約IOml再生溶液中靜息約48小時。對于豬內(nèi)皮細(xì)胞，再生溶液是補(bǔ)充有5% FBS和50 u g/ml慶大霉素、在37°C在5% CO2中的EBM-2。對于人內(nèi)皮細(xì)胞，再生溶液是沒有抗生素的EGM-2。進(jìn)一步的解凍后調(diào)節(jié)可以在使用和包裝用于保存或轉(zhuǎn)運之前另外進(jìn)行至少24小時。在即將植入之前，傾倒培養(yǎng)基，在約250 - 500ml無菌鹽水(USP)中清洗可植入材料。如有必要，最終產(chǎn)品中的培養(yǎng)基含有少量的FBS來在轉(zhuǎn)運到臨床位置期間維持細(xì)胞活力。FBS已經(jīng)根據(jù)Title9CFR:Animal and Animal Products廣泛地測試了細(xì)菌、真菌和其他病毒劑的存在。僅在植入之前采取清洗操作，其降低轉(zhuǎn)運的FBS的數(shù)量，優(yōu)選降低到單位植入物0 — 60ng之間。每個人患者的總細(xì)胞載荷優(yōu)選是大約I. 6 — 2. 6 X 104個細(xì)胞每kg體重,但是不低于約2 X IO3以及不超過約2 X IO6個細(xì)胞每kg體重。如在此預(yù)期的，本發(fā)明的可植入材料包含細(xì)胞，優(yōu)選血管內(nèi)皮細(xì)胞，其優(yōu)選是約90%存活的、密度優(yōu)選約4X 105個細(xì)胞/cm3柔性平面形式，當(dāng)融合時，產(chǎn)生含有至少約
0.5 - I. O、優(yōu)選至少約I. 0微克/IO6個細(xì)胞/天的硫酸乙酰肝素，至少約200 - 300、優(yōu)選至少約300皮克/ml/天的TGF-P丨，和低于至少約210皮克/ml、優(yōu)選不超過約400皮克/ml的b-FGF的條件培養(yǎng)基。柔性平面形式的可植入材料的遞送一般問題。可植入材料可以以各種形式施用給血管通路結(jié)構(gòu)。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，所述可植入材料是按形狀和大小切割的柔性平面形式，使其適合于植入到瘺、移植物、外周移植物或其他血管通路結(jié)構(gòu)和其周圍附近，并且其可以貼附在通路結(jié)構(gòu)和它相連的血管的輪廓化表面。
根據(jù)優(yōu)選的實施方式，為向要處理的血管通路結(jié)構(gòu)應(yīng)用來調(diào)整單片可植入材料的大小。根據(jù)另ー個實施方式，超過一片的柔性平面形式的可植入材料，例如ニ、三、四、五、六、七、八或更多片基質(zhì)材料，可以用于單個血管通路位置。另外，沿著血管通路結(jié)構(gòu)長度的超過ー個位置可以用一片或多片可植入材料處理。例如，對于動靜脈移植物來說，每個近端靜脈接合點、遠(yuǎn)端靜脈接合點和遠(yuǎn)端靜脈節(jié)可以用一片或多片所述可植入基質(zhì)材料處理。根據(jù)ー個非限制性實施方式，所述可植入材料被配置以貼附血管的外表面。在圖I中說明了示范性的非限制性平面形式。參考圖1，示范性的柔性平面形式20具有長度12、寬度14和高度16。根據(jù)ー個優(yōu)選的實施方式，柔性平面形式20的長度12是約2cm到約6cm，柔性平面形式20的寬度14是約0. 5cm到約2cm，柔性平面形式20的高度16是約0. Icm到約 0. 5cm。根據(jù)另ー個實施方式，柔性平面形式20可以配置為解剖學(xué)上輪廓化的形式，其貼附血管或血管通路結(jié)構(gòu)的外表面。在圖2A中描繪了被配置用于向血管通路結(jié)構(gòu)施用的示范性的解剖學(xué)輪廓化的柔性平面形式20’，并在以下更詳細(xì)地討論。 如在此的其他地方說明的，圖2A的輪廓化的柔性平面形式20’可以配置為各種幾何形式。例如，根據(jù)ー個實施方式，輪廓化的柔性平面形式20’含有限定內(nèi)部槽隙60的幾個區(qū)域。根據(jù)其他實施方式，輪廓化的柔性平面形式20’的邊緣和/或內(nèi)部槽隙60的邊緣是有角度的或曲線的。根據(jù)另ー個實施方式，輪廓化的柔性平面形式20’的高度16’跨越長度12’和/或?qū)挾?4’地變化。另外，取決于輪廓化的柔性平面形式20’的構(gòu)型和預(yù)期目的，可以有ー個、或超過ー個的片40、橋50和/或槽隙60。對于槽隙的特征，可以在輪廓化的柔性平面形式20’之中、之上或之內(nèi)的任何地方限定槽隙。槽隙可以被限定為寬度均ー或?qū)挾扔凶兓２巯犊梢员幌薅榫€性、非線性或曲線的。參考圖2B、圖2C、圖2D和圖2E，其描繪了含有至少ー個槽隙60的本發(fā)明的輪廓化柔性平面形式20’的多種實施方式，在某些實施方式中所述輪廓化的柔性平面形式20’可以限定ー個或超過ー個的槽隙，并可以根據(jù)在此公開的方法來使用。在輪廓化的柔性平面形式20’之上或之內(nèi)限定的槽隙60可以沿著所述輪廓化的柔性平面形式20’的任何邊緣排列，或可以穿透到輪廓化的形式20’的內(nèi)部。現(xiàn)在參考圖2E，在所述輪廓化的柔性平面形式20’之中或之內(nèi)的槽隙60的寬度66或總體形狀可以被限定為寬度均一或?qū)挾扔凶兓梢韵薅榫€性、非線性或曲線的。對于圖2F和圖2G，輪廓化的柔性平面形式20’可以限定分別具有不同寬度66和66’的槽隙60或60’。如所描繪的，圖2G的槽隙60’和寬度66’代表一種實施方式,其中醫(yī)師在植入之時，切割在此其他地方提出的柔性平面形式20’，從而將它轉(zhuǎn)變成圖2G中描繪的輪廓化的柔性平面形式20’。根據(jù)ー個實施方式，端對面血管接合點連接，例如動靜脈瘺，可以使用本發(fā)明的可植入材料處理。在圖4A、圖4B和圖4C中說明了將柔性平面形式的可植入材料遞送到端對面血管接合點的示范性方法的步驟。參考圖4A，通過將第一片可植入材料22的ー個末端34或第二末端36移至接合段110下部，直到第一片可植入材料22的中段32處在接點112處，在此血管100、110會合，向血管通路結(jié)構(gòu)提供第一片可植入材料22。末端34、36然后在接點112卷繞縫合線114，保持可植入材料中心在縫合線114上。根據(jù)ー個實施方式,第一片可植入基質(zhì)材料22的末端34,36可以相互疊蓋僅僅足以固定第一片可植入基質(zhì)材料22就位即可。根據(jù)另ー個實施方式，第一片可植入基質(zhì)材料22的末端34、36不相互疊蓋。第一片可植入基質(zhì)材料22或任何其他片可植入基質(zhì)材料的末端34、36，不必相互會合、相互疊蓋、或卷繞任一血管100、110的整個圓周。根據(jù)ー個優(yōu)選的實施方式，第一片可植入材料22的末端34、36卷繞接合接點112盡可能遠(yuǎn)而不拉伸或撕扯。所有需要的是，實現(xiàn)血管的充分覆蓋。熟練技術(shù)人員將理解何時恰當(dāng)?shù)貙崿F(xiàn)可植入材料的施用。參考圖4B，根據(jù)另ー個實施方式，任選的應(yīng)用第二片可植入材料24，第二片可植入材料24的中段42中心在接合接點112處、鄰近或附近。第二片可植入材料24的末端44,45卷繞血管100。如在圖4A中對于第一片可植入材料22所描述的，第二片可植入基質(zhì)材料24的末端44、46可以但不需要接觸、疊蓋、或卷繞任一血管100、110的整個圓周。參考圖4C，根據(jù)又ー個實施方式，第三片可植入材料26任選的置于處理的血管 100的近端血管段116處、接合接點112的遠(yuǎn)端。根據(jù)ー個實施方式，第三片可植入材料26沿著血管100的長度縱向地放置，第三片可植入材料26的第一末端54在接合接點112處、其鄰近或附近，第三片可植入材料26的第二末端56遠(yuǎn)離接合接點112。如在圖4A中對于第一片可植入材料22所描述的，第三片可植入基質(zhì)材料26的末端54、56可以但不需要接觸、疊蓋、或卷繞血管100的整個圓周。根據(jù)可選擇的實施方式，限定槽隙60的單片輪廓化柔性平面形式20’，例如圖2A中說明的示范性輪廓化的形式，被提供給血管通路結(jié)構(gòu)，例如端對面接合點。在圖5中說明了在端對面接合點處、鄰近或附近植入限定槽隙60的輪廓化的柔性平面形式20’的可植入材料。當(dāng)可植入材料以纏繞方式使用時，預(yù)期的是單片的可植入基質(zhì)材料足夠處理接合點和鄰近的脈管系統(tǒng)。調(diào)整每個輪廓化的柔性平面形式20’的大小和形狀，用于應(yīng)用到特定血管通路結(jié)構(gòu)，并因而，被預(yù)先形成以提供足夠的覆蓋和充足水平的內(nèi)皮細(xì)胞因子和/或治療試劑，來為該特定的血管通路結(jié)構(gòu)和附近的脈管系統(tǒng)創(chuàng)建自我平衡的環(huán)境。參考圖5，根據(jù)ー個實施方式，通過從片40分離體30，向接合點提供限定槽隙的單個輪廓化的柔性平面形式20’。體30沿著主要血管100的表面放置。橋50置于主要血管100的表面上，以及ニ級血管110的分支的下方。然后將片40圍繞分支的血管110，將片40沿著分支的血管110的上表面放置。根據(jù)圖5，單片的輪廓化的柔性平面形式20’含有兩個參照點70、80 (還參見圖2A)。當(dāng)施用到端對面接合點的位置時，如圖5中說明的，對準(zhǔn)兩個參照點70、80。第一參照點70位于片40上，第二參照點80位于橋50上(還參見圖2A)。在輪廓化的柔性平面形式20’的一個實施方式中，在植入之前，參照點70、80分開約二分之一英寸、優(yōu)選小于約I英寸、更優(yōu)選約I英寸、最優(yōu)選不超過I. 5英寸的距離。當(dāng)輪廓化的柔性平面形式20’被施用到接合點的位置時，槽隙特征所允許的輪廓化的柔性平面形式20’圍繞分支的血管110的旋轉(zhuǎn)使得參照點70、80對準(zhǔn)。根據(jù)ー個實施方式(再次參考圖4A、圖4B和圖4C)，例如，當(dāng)處理動靜脈移植物時，第一片可植入材料22和第二片可植入材料24分別被應(yīng)用到近端靜脈接合點和遠(yuǎn)端靜脈接合點。另外，第三片可植入材料26可以位于遠(yuǎn)端靜脈、遠(yuǎn)端靜脈接合點的下游。根據(jù)圖6中例示的又一個可選擇的示范性實施方式，柔性平面形式20中的單片可植入材料20應(yīng)用到管狀結(jié)構(gòu)例如血管100上。預(yù)期的是，可植入材料可以應(yīng)用于管狀結(jié)構(gòu)，例如不含有血管通路結(jié)構(gòu)的血管。例如，血管通路結(jié)構(gòu)下游的靜脈部分可能經(jīng)歷加重的炎癥、血栓形成、再狹窄或閉塞，其由血管通路結(jié)構(gòu)的形成或被處理的靜脈部分上游的血管通路結(jié)構(gòu)處的粘針(needle stick)引起。在這種情況下，本發(fā)明的可植入材料可以處理、管理和/或改善這些狀況，這些狀況在距離血管通路結(jié)構(gòu)一定距離處出現(xiàn)。可流動組合物中可植入材料的遞送一般問題。本發(fā)明的可植入材料當(dāng)處于可流動組合物形式時包含顆粒狀生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞，優(yōu)選內(nèi)皮細(xì)胞，更優(yōu)選血管內(nèi)皮細(xì)胞，所述細(xì)胞是約90%存活的，優(yōu)選密度約0. 8 X 104個細(xì)胞/mg，更優(yōu)選約I. 5 X 104個細(xì)胞/mg，最優(yōu)選約2 X 104個細(xì)胞/ml，所述細(xì)胞可以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有至少0. 5 — I. O、優(yōu)選至少約I. 0微克/IO6個細(xì)胞/天的硫酸こ酰肝素，至少約200 — 300、優(yōu)選至少約300皮克/ml/天的TGF-P p以及低于約200皮克/ml和優(yōu)選不超過約400皮克/ml的b_FGF ；以及，所述細(xì)胞顯示早前描述的抑制性表型。
對于本發(fā)明來說，一般地，可流動顆粒材料的施用被定位到血管通路結(jié)構(gòu)處、其鄰近或附近的位置。可植入材料的沉積位置是腔外。如在此預(yù)期的，局部的、腔外的沉積可以如下實現(xiàn)。在特別優(yōu)選的實施方式中，所述可流動組合物首先使用適合的針、導(dǎo)管或其他適合的透皮注射型遞送裝置透皮地施用，進(jìn)入血管周圍間隙然后沉積在腔外位置。做為選擇，所述可流動組合物使用針、導(dǎo)管或其他適合的遞送裝置透皮地遞送，連同鑒定步驟來便于向期望的腔外位置的遞送。鑒定步驟可以在透皮膚遞送之前或同時發(fā)生。所述鑒定步驟可以使用血管內(nèi)超聲、其他的常規(guī)超聲、熒光檢查和/或內(nèi)窺鏡檢查方法來實現(xiàn)，略舉數(shù)例。任選地進(jìn)行所述鑒定步驟，而不是實踐本發(fā)明的方法必要的。所述可流動組合物也可以腔內(nèi)地，即，血管內(nèi)地施用。例如，所述組合物可以通過能插入到血管內(nèi)的任何設(shè)備來遞送。在這種情況下，這樣的管腔內(nèi)遞送裝置具備橫貫或穿透設(shè)備，其穿透血管的腔壁來到達(dá)血管的非腔表面。然后所述可流動組合物在血管通路結(jié)構(gòu)位置處、鄰近或附近沉積在血管的非腔表面上。在此預(yù)期的是，非腔的、也稱為腔外的表面可以包括血管的外部表面或血管周表面，或可以處在血管的外膜、血管中層或內(nèi)膜之內(nèi)。對于本發(fā)明來說，非腔的或腔外的表面是除了管腔內(nèi)表面之外的任何表面。在此預(yù)期的穿透設(shè)備可以允許，例如，單個遞送點或以期望的幾何構(gòu)型排列的多個遞送點來實現(xiàn)可流動組合物向血管的非腔表面的遞送，而不破壞血管通路結(jié)構(gòu)。可以排列多個遞送點，例如，環(huán)形、牛眼形、或線列排列，略舉數(shù)例。所述穿透設(shè)備也可以是展伸穿孔器的形式，例如但不限于，包括多個遞送點的氣球支架(balloon stent)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述穿透設(shè)備在所述血管通路結(jié)構(gòu)位置的近端或遠(yuǎn)端經(jīng)由血管的內(nèi)腔表面插入。在某些臨床受試者中，穿透設(shè)備在血管通路結(jié)構(gòu)位置處的插入可能破壞血管通路結(jié)構(gòu)和/或引起動靜脈移植物或外周移植物的開裂。因而，在這些受試者中，應(yīng)當(dāng)小心地在離血管通路結(jié)構(gòu)一定距離的位置插入所述穿透設(shè)備，優(yōu)選由臨床醫(yī)師取決于手頭的特定環(huán)境確定該距離。優(yōu)選的，可流動組合物沉積在血管的血管周表面上，在要處理的血管通路結(jié)構(gòu)的位置，或在血管通路結(jié)構(gòu)位置的鄰近或附近。所述組合物可以沉積在相對于血管通路結(jié)構(gòu)的各種位置，例如，在近端接合點處、在遠(yuǎn)端接合點處、鄰近于任ー接合點、例如，接合點的上游，對著接合點的外部血管表面。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，鄰近的位置位于血管通路結(jié)構(gòu)位置的約2mm到20mm之內(nèi)。在另ー個優(yōu)選的實施方式中，位置在約21mm到40mm之內(nèi)；在又一個優(yōu)選的實施方式中，位置在約41_到約60_之內(nèi)。在另ー個優(yōu)選的實施方式中，位置在約61mm到IOOmm之內(nèi)。做為選擇,鄰近的位置是任何其他的、臨床醫(yī)師確定的鄰近位置，在此沉積的組合物能夠展現(xiàn)對于血管通路結(jié)構(gòu)附近的血管的期望效果。在另ー個實施方式中，所述可流動組合物直接遞送到血管通路結(jié)構(gòu)處、鄰近或附近的手術(shù)暴露的腔外位置。在這種情況下，通過對該位置的直接觀察來引導(dǎo)和指導(dǎo)遞送。還是在這種情況下，通過同時使用如上所述的鑒定步驟，可以幫助遞送。再一次地，鑒定步驟是任選的。腔外施用。對于本發(fā)明來說，可流動組合物的施用被定位到鄰近于、附近于、或需要處理的位置之處的位置。如在此預(yù)期的，局部的、腔外的沉積可以如下實現(xiàn)。
使用針、導(dǎo)管或其他適合的遞送裝置透皮地遞送可流動組合物。做為選擇，與導(dǎo)引方法的使用同時地透皮遞送所述可流動組合物，來便于向需要處理的位置的遞送。在進(jìn)入血管周圍間隙時，臨床醫(yī)師將所述可流動組合物沉積在需要處理的位置之處、鄰近或附近的腔外位置。透皮遞送最佳地可以通過常規(guī)超聲、熒光檢查、內(nèi)窺鏡檢查方法來導(dǎo)引和指導(dǎo)，略舉數(shù)例。在另ー個實施方式中，所述可流動組合物局部地遞送到需要處理的位置之處、鄰近或附近的手術(shù)暴露的腔外位置。在這種情況下，通過直接觀察需要處理的位置來導(dǎo)引和指導(dǎo)遞送洞樣在這種情況下，通過同時使用如上所述的其他導(dǎo)引方法，可以幫助遞送。適合按這種方式使用的可流動組合物的實例在同一天提交的共同待決申請PCT/
US_(代理人編號No ELV 一 008PC)中公開，其完整內(nèi)容通過引用并入本文；
以及在同一天提交的共同待決申請PCT/US_(代理人編號No ELV 一 009PC)
中公開，其完整內(nèi)容通過引用并入本文。接合密封劑。在某些其他實施方式中，本發(fā)明的可流動組合物另外可以特別地充當(dāng)接合密封劑，或一般地充當(dāng)外科密封劑。在這種雙重目的實施方式中，當(dāng)與結(jié)構(gòu)的外表面接觸、或應(yīng)用到外表面上的弧中、或繞圓周地應(yīng)用時，所述組合物對于密封兩個或多個管狀結(jié)構(gòu)的接點、或密封管狀結(jié)構(gòu)中的空隙也是有用的。這種密封劑可以消除縫合的需求，所述縫合可能進(jìn)ー步損傷血管組織，例如，引起腔內(nèi)皮的傷害。這種密封劑可以在接合點附近提供額外的穩(wěn)定性，從而加強(qiáng)任何縫合修復(fù)。所有需要的是，這種雙重目的組合物的密封劑型性質(zhì)不影響或損害細(xì)胞的期望表型的一致性表達(dá)和所述組合物的基于細(xì)胞的功能。對于某些密封劑實施方式來說，所述可流動組合物包含生物相容性基質(zhì)，所述生物相容性基質(zhì)本身包含具有密封劑性質(zhì)的成分，例如但不限于血纖蛋白網(wǎng)絡(luò)，同時還具有支持內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞群體的必需性質(zhì)。并且，生物相容性基質(zhì)本身可以具有密封劑性質(zhì)，以及支持細(xì)胞群體所需的那些性質(zhì)。對于其他實施方式來說，密封劑功能可以由細(xì)胞至少部分地貢獻(xiàn)。例如，預(yù)期的是，與該組合物相連的細(xì)胞可以產(chǎn)生能修飾基質(zhì)的物質(zhì)，從而所述基質(zhì)獲得密封劑性質(zhì)，同時還展現(xiàn)/維持它們的必需細(xì)胞功能。某些細(xì)胞可以天然地產(chǎn)生這種物質(zhì)，而其他細(xì)胞可以被工程化來產(chǎn)生。
制備、保存和轉(zhuǎn)運可植入材料的方法獲得和制備細(xì)胞的方法。所述可植入材料包含同種異體的、異種的或自體的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞。所述內(nèi)皮細(xì)胞從患者、尸體或細(xì)胞庫獲得。所述內(nèi)皮細(xì)胞來源于血管組織，更優(yōu)選來源于主動脈組織、最優(yōu)選冠狀動脈組織、肺動脈組織或髂動脈組織。做為選擇，內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞來源于非血管組織或器官、內(nèi)皮祖細(xì)胞或其他祖細(xì)胞，或來自干細(xì)胞。根據(jù)其他實施方式，所述細(xì)胞被遺傳地改變、修飾或工程化。廣泛地測試來自供體的每ー批細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞純度，生物學(xué)功能，以及支原體、細(xì)菌、真菌、酵母、已知的人類病原體和其他外來試劑的存在。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，細(xì)胞從0型血的供體獲得。所述細(xì)胞使用公知的技術(shù)進(jìn)ー步擴(kuò)增至第2代或第4代、表征、并低溫保存在一 140°C，來形成主細(xì)胞庫，用于稍后制備工作細(xì)胞庫、在培養(yǎng)基中擴(kuò)增以及隨后在可植入材料中制劑。選擇的主細(xì)胞庫然后在含有約15mL內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基的T_75燒瓶中擴(kuò)增形成 工作細(xì)胞庫。將燒瓶置于維持在大約37°C和5% C02/95%空氣、90%濕度的孵化器中至少30分鐘。從ー 160°C — 140°C冷凍器中移出ー個或兩個小瓶，在大約37°C解凍。每瓶解凍的細(xì)胞以約3 X IO3個細(xì)胞每cm3，但優(yōu)選不低于I. OX IO3以及不超過7. OX IO3的密度播種到兩個T-75燒瓶中。含有細(xì)胞的燒瓶放回孵化器中。在約8 — 24小時之后，除去消耗了的培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基替換。每兩到三天更換培養(yǎng)基，此后，直到細(xì)胞達(dá)到約85 — 100%的融合，但不低于60%和不超過100%。當(dāng)所述可植入材料預(yù)計用于臨床應(yīng)用時，在細(xì)胞的解凍后培養(yǎng)中和本發(fā)明的可植入材料制備中僅使用無抗生素的培養(yǎng)基。然后除去內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基，用IOmL HEPES緩沖鹽水(HEPES)沖洗單細(xì)胞層。除去HEPES，添加2mL胰蛋白酶(約0. 25mg/mL)來從T-75燒瓶表面剝離細(xì)胞。一旦發(fā)生分離，添加3mL胰蛋白酶中和溶液(TNS)來終止酶反應(yīng)。添加另外5mL HEPES，使用血球計對細(xì)胞計數(shù)。對細(xì)胞懸液離心并使用沒有抗生素的EGM-2調(diào)節(jié)到約I. 75 X IO6個細(xì)胞/mL的
山I又o如果細(xì)胞將被冷凍形成工作細(xì)胞庫，使用額外的10% FBS (最終12% FBS)和10%ニ甲亞砜(DMSO)補(bǔ)充培養(yǎng)基。將一毫升體積的產(chǎn)生的細(xì)胞懸浮液分散到冷凍管中，并置于ー 80°C的冷凍器中4 一 24小吋。冷凍的細(xì)胞，即，工作細(xì)胞庫，然后轉(zhuǎn)移到設(shè)置在一140°C的冷凍器用于保存直到使用。在第5代時冷凍工作細(xì)胞庫。制備可植入材料的方法。生物相容性基質(zhì)的預(yù)切片或可流動基質(zhì)的等分量通過添加沒有抗生素的EGM-2在大約37°C和5% C02/95%空氣中12到48小時來再水化。然后從它的再水化容器中移出基質(zhì)材料，放置到単獨的組織培養(yǎng)平皿中。用來自工作細(xì)胞庫的細(xì)胞以大約1.5 — 2.0X105個細(xì)胞(I. 25 — 1.66X105個細(xì)胞/cm3基質(zhì))的優(yōu)選的密度播種基質(zhì)材料，放入維持在大約37°C和5% C02/95%空氣、90%濕度的孵化器中3 — 4小時以促進(jìn)細(xì)胞附著。根據(jù)ー個實施方式，播種的基質(zhì)然后放入具有帶0. 2 過濾器的帽子且裝有EGM-2的、單獨的可密封容器或試管，在大約37°C和5% C02/95%空氣中孵育。每兩到三天更換培養(yǎng)基，此后，直到細(xì)胞達(dá)到融合。根據(jù)可選擇的實施方式，播種的基質(zhì)放入具備栓塞密封蓋的單獨的可密封容器或試管中，并用10% CO2吹洗。根據(jù)這種方法，每次更換培養(yǎng)基時用10% CO2吹洗容器。測定細(xì)胞融合和功能的方法。在或大約在第3或4、6或7、9或10、以及12或13天時移出可植入材料的樣品。對細(xì)胞計數(shù)并評定活力，構(gòu)建生長曲線并進(jìn)行評估，以評定生長特征和確定是否已經(jīng)達(dá)到融合、近融合或融合后。通過使用HEPES/CaC12溶液中的0. 5mg/mL膠原酶的溶液完全消化可植入材料的等分量，實現(xiàn)細(xì)胞計數(shù)。在測量消化的可植入材料的體積之后，用0.4%錐蟲藍(lán)稀釋已知體積的細(xì)胞懸液(細(xì)胞錐蟲藍(lán)為4:1)，通過錐蟲藍(lán)排阻評定活力。使用血球計計數(shù)活細(xì)胞、非存活細(xì)胞和總細(xì)胞。通過將活細(xì)胞數(shù)目相對于培養(yǎng)天數(shù)作圖來構(gòu)建生長曲線。優(yōu)選的，包含細(xì)胞的可植入材料在細(xì)胞達(dá)到融合之后植入，但可以使用融合后或近融合的細(xì)胞。如果到第12或13天細(xì)胞不融合，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育額外一天。繼續(xù)這個過程直到達(dá)到融合或直到播種后14天。在第14天，如果細(xì)胞還沒有融合，該批次一般地但不是必需地被丟棄。如果在進(jìn)行過程中檢查之后確定細(xì)胞是融合的，進(jìn)行最后的培養(yǎng)基更換。這種最后的培養(yǎng)基更換使用沒有酚紅和沒有抗生素的EGM-2進(jìn)行。在更換培養(yǎng)基之后立刻地給試管緊密地裝上無菌栓塞密封帽用于裝運。在植入之前進(jìn)ー步測試可植入材料的功能標(biāo)志。例如，在培養(yǎng)期間收集條件培養(yǎng)基來確定培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的硫酸こ酰肝素、轉(zhuǎn)化生長因子-P i (TGF-P :)、堿性成纖維 細(xì)胞生長因子(b-FGF)和氧化氮(NO)的水平，以及細(xì)胞體外抑制平滑肌細(xì)胞生長和血栓形成的能力。根據(jù)早先描述的分析和參數(shù)評估條件培養(yǎng)基。當(dāng)前優(yōu)選的分析是硫酸こ酰肝素分析，其可以單獨使用來確認(rèn)功能。做為選擇，它可以與用于移接的細(xì)胞產(chǎn)生的TGF-^1.b-FGF和NO的ー種或多種分析組合使用，和/或組合在此其他地方描述的體外抑制平滑肌細(xì)胞分析。低溫保存可植入材料的組合物和方法。包含移接到生物相容性基質(zhì)中的近融合、融合或融合后細(xì)胞群體的可植入材料，可以被低溫保存用于延長保存數(shù)月到數(shù)年，或無限期保存。除了降低生產(chǎn)時間和成本之外，低溫保存提供了可用的、完全測試的、活的和確認(rèn)功能的可植入材料，用于在任何時候臨床使用，而沒有任何生產(chǎn)和運輸相關(guān)的延遲。當(dāng)細(xì)胞是近融合、融合或融合后的時，可植入材料可以被低溫保存。根據(jù)各種實施方式，所述可植入材料在細(xì)胞播種到生物相容性基質(zhì)中之后低溫保存10到14天、更優(yōu)選在播種之后保存10到12天、最優(yōu)選播種之后保存12天。一般地，在播種后10天或約10天內(nèi)皮細(xì)胞是融合前或融合的，在播種后12天或約12天內(nèi)皮細(xì)胞是融合后2 — 3天的。在低溫保存之前和任選低溫保存之后，評估可植入材料的細(xì)胞數(shù)量、活力和功能指標(biāo)。示范性的細(xì)胞功能分析包括評估硫酸こ酰肝素(HS)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-P I、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)和氧化氮(NO)的水平，以及抑制培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞(SMC)生長的能力。此外，在向患者施用可植入材料之前，廠家和/或醫(yī)師可以使用如上詳細(xì)描述的錐蟲藍(lán)分析評定細(xì)胞活力。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，如果總細(xì)胞計數(shù)等于或大于400，000個細(xì)胞/cm3、80%到90%或更多的細(xì)胞是存活的、硫酸こ酰肝素以0. 23ii g/mL/天或更高的量存在，TGF-P1以300pg/mL/天或更高的量存在，則所述可植入材料是可接受的。根據(jù)其他的實施方式，如果b-FGF的水平是300pg/mL/天或更低,則所述可植入材料是可接受的。根據(jù)ー個實施方式，所述可植入材料被低溫保存在低溫保存介質(zhì)組合物中，所述低溫保存介質(zhì)組合物包含補(bǔ)充有多糖和血清的低溫保存劑。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述可植入材料被低溫保存在低溫保存介質(zhì)組合物中，所述低溫保存介質(zhì)組合物包含約5mL的CryoStor CS-10 溶液(BioLife Solutions, Oswego, NY),所述溶液含有約 10% DMSO 并補(bǔ)充有約4. 5%葡聚糖和約50% FBS0根據(jù)其他的實施方式，F(xiàn)BS的濃度大于細(xì)胞培養(yǎng)中使用的FBS的量，所述濃度是約20 %到80 %，更優(yōu)選約40 %到60 %，最優(yōu)選約50 %。根據(jù)其他的實施方式，DMSO的濃度是約5%到20% DMS0，更優(yōu)選約7%到15%，最優(yōu)選約10% DMS0。根據(jù)其他的實施方式，葡聚糖的濃度是約2%到8%，更優(yōu)選約4%到6%，最優(yōu)選約4. 5 %。根據(jù)ー個實施方式，葡聚糖具有約10，000到500，000、更優(yōu)選約20，000到200，000、最優(yōu)選約70，000的分子量。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述低溫保存介質(zhì)組合物具有約6. 8到8. O、更優(yōu)選約7. 2到7. 6、最優(yōu)選約7. 4的pH值。根據(jù)低溫保存的ー種方法，所述可植入材料從它的細(xì)胞培養(yǎng)物小瓶中轉(zhuǎn)移到15mL冷凍瓶(Nalgene , Nalge Nunc Int’ I, Rochester, NY)中，所述冷凍瓶中添加了約 5mL 的低溫保存介質(zhì)組合物。根據(jù)其他的實施方式，所述冷凍瓶具有約6到IOmL的體積，更優(yōu)選具有約10到15mL的體積,和最優(yōu)選具有約15ml的體積。根據(jù)ー個實施方式，所述冷凍瓶中低溫保存介質(zhì)與空氣的體積比是約I :1到I :2、更優(yōu)選約I :1到2 :3、最優(yōu)選約I :1。根據(jù)低溫保存的ー種方法，所述裝有可植入材料和低溫保存介質(zhì)組合物的冷凍瓶被置于冷凍容器(Mr. Frosty , Nalge Nunc Int’1，Rochester, NY)中。向所述冷凍容器中 添加異丙醇來填充約二分之一的冷凍容器體積。根據(jù)ー個實施方式，所述冷凍容器然后轉(zhuǎn)移到一 20°C冷凍器中。根據(jù)另ー個實施方式，所述冷凍容器然后轉(zhuǎn)移到一 80°C冷凍器中。根據(jù)進(jìn)ー步的實施方式，在一 80°C冷凍器中保持約16小時之后，冷凍容器被轉(zhuǎn)移到液氮氣相中(大約一 140°C到一 160°C)。根據(jù)各種實施方式，所述冷凍容器被保持在約ー 4°C到一160°C、更優(yōu)選約ー 20°C、約ー 80°C或一 160°C，最優(yōu)選約ー 140°C到一 160°C。根據(jù)各種實施方式，所述可植入材料可以保持在低溫保存狀態(tài)2個月、4個月、6個月、8個月、10個月、12個月和更久。如果所述可植入材料不被慢慢地解凍，所述生物相容性材料傾向于分裂成幾片，降低基質(zhì)完整性、細(xì)胞融合性和活力。通過慢慢地解凍所述可植入材料，改善了材料的完整性。根據(jù)慢慢解凍可植入材料的優(yōu)選的方法，含有所述冷凍的可植入材料和冷凍保存介質(zhì)的冷凍瓶從冷凍器(約ー 4°C到一 80°C)或液氮氣相(大約一 40°C到一 160°C)中取出，在室溫下解凍約15分鐘，隨后在室溫水浴中另外解凍15分鐘。然后從所述冷凍瓶中移出可植入材料，洗滌來除去剰余的低溫保存介質(zhì)。根據(jù)ー個實施方式，在實驗室中解凍所述可植入材料用于體外評定。依據(jù)這種實施方式，所述可植入材料在15mL洗滌培養(yǎng)基(EBM-PRF和50 u g/ml慶大霉素)中在室溫下洗滌兩次達(dá)5分鐘，隨后在約15mL洗滌培養(yǎng)基中在37°C和5% CO2中最后洗滌30分鐘。在洗滌過程之后，可植入材料置于37°C和5% CO2的IOmL EGM-2中達(dá)約48小時的恢復(fù)時間。在臨床使用之前，或用于隨后可植入材料為了轉(zhuǎn)運的包裝，任選地可以調(diào)整可植入材料另外24小時。根據(jù)另ー個實施方式，在臨床中解凍所述可植入材料用于患者植入。依據(jù)這種實施方式，所述可植入材料從冷凍瓶中移出，并在約500mL洗滌培養(yǎng)基中洗滌兩次。根據(jù)各種實施方式，在室溫下，所述洗滌培養(yǎng)基包含USP級別鹽水、乳酸化的林格氏溶液和EBM -PRF0所述可植入材料保持在第一洗滌培養(yǎng)基溶液中約I到40分鐘，更優(yōu)選約2到25分鐘，保持在第二洗滌培養(yǎng)基溶液中約I到20分鐘，更優(yōu)選約I到10分鐘。從所述第二洗滌培養(yǎng)基中移出可植入材料并植入患者中。延長可植入材料的貨架壽命的組合物和方法。包含包埋入生物相容性基質(zhì)的近融合、融合或融合后的內(nèi)皮細(xì)胞群體的可植入材料的實施方式可以在室溫下以存活、貨架穩(wěn)定的條件維持用于保存和/或轉(zhuǎn)運約21到28天。根據(jù)其他的實施方式，所述可植入材料可以在室溫維持至少約I周、至少約2周、至少約3周或至少約4周。根據(jù)各種實施方式，在將細(xì)胞播種到生物相容性材料中之后10到14天，可以制備可植入材料用于在室溫下保存。根據(jù)當(dāng)前優(yōu)選的實施方式，在播種后12天制備所述可植入材料用于在室溫下保存。根據(jù)另ー個當(dāng)前優(yōu)選的實施方式，在播種后10天制備所述可植入材料用于在室溫下保存。在保存在轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中之前或任選的之后，可以評估所述所述可植入材料的細(xì)胞數(shù)量、和活力與功能指標(biāo)。示范性的細(xì)胞功能分析包括評估硫酸こ酰肝素(HS)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-P1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)和氧化氮(NO)的水平，以及抑制培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞(SMC)生長的能力。此外，在向患者施用可植入材料之前，廠家和/或醫(yī)師可以使用如上詳細(xì)描述的錐蟲藍(lán)分析評定細(xì)胞活力。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，如果總細(xì)胞計數(shù)等于或大于400，000個細(xì)胞/Cm3、80%到90%或更多的細(xì)胞是存活的、硫酸こ酰肝素以
0.23 u g/mL/天或更高的量存在，TGF-P I以300pg/mL/天或更高的量存在，則所述可植入材料是可接受的。根據(jù)其他的實施方式，如果b-FGF的水平是300pg/mL/天或更低，則所述可植入材料是可接受的。所述可植入材料在室溫下保持在包含補(bǔ)充的EGM-2的轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物中。當(dāng)用于細(xì)胞培養(yǎng)目的時，標(biāo)準(zhǔn)的、未補(bǔ)充的EGM-2含有約2% FBSJA 0. 2mg/mL氫化可的松、約2ng/mL VEGF、約 4ng/mL hFGF、約 5ng/mLR3-IGF_l、約 75mg/mL 抗壞血酸、約 10ng/mL hEGF 和約Ing/mL肝素。根據(jù)其他的實施方式，所述未補(bǔ)充的EGM-2進(jìn)ー步含有抗生素，包括但不限于約30 u g/ml慶大霉素或約15ng/ml兩性霉素-B。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述可植入材料在室溫下保存在轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物中，所述轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物包含沒有酌 紅的約50mT, EGM-2 (Cambrex BioScience, EastRutherford, NJ)、補(bǔ)充有額外的約2ng/mLVEGF、使轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中VEGF的總濃度到約4ng/mL。根據(jù)其他的實施方式，正常的EGM-2補(bǔ)充以約0. I到4ng/mL VEGF、更優(yōu)選約I到3ng/mL VEGF，以及最優(yōu)選約2ng/mL VEGF。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，在細(xì)胞暴露之前轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基pH值是約7. 4到8. O。隨著對細(xì)胞的暴露的提高，轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的pH值降低，在細(xì)胞暴露之后產(chǎn)生約6. 8到7. 4的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基pH值。根據(jù)另ー個實施方式，所述可植入材料在室溫下保存在轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物中，所述轉(zhuǎn)移介質(zhì)組合物包含沒有酌 紅的約50mT, EGM-2 (Cambrex BioScience, EastRutherford, NJ)、補(bǔ)充有額外的約8% FBS、使轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中FBS的總濃度到約10%。根據(jù)其他的實施方式，正常的EGM-2補(bǔ)充以約I到50% FBS、更優(yōu)選約2到20% FBS、和最優(yōu)選約 8% FBS0轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的體積是在低于約37°C的溫度下，例如在室溫下維持可植入材料的活力多至約21到28天的重要條件。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的體積應(yīng)當(dāng)足以提供最佳濃度或稀釋度的細(xì)胞廢物產(chǎn)物，而同時提供最佳濃度的細(xì)胞分泌的有益產(chǎn)物。一般地，維持可植入材料的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的最佳體積隨著溫度降到低于37°C而提高，37°C是細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)溫度。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述可植入材料在室溫下保存在約50mL的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中。根據(jù)其他的實施方式，所述可植入材料保存在約28到150mL轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基、更優(yōu)選約50到IOOmL轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基、和最優(yōu)選約50mL轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中。根據(jù)ー個實施方式，轉(zhuǎn)運小瓶含有約4. 2 — 17X IO5個細(xì)胞/cm3基質(zhì)材料。根據(jù)另ー個實施方式，所述轉(zhuǎn)運小瓶含有約0. I — 0. 4 X IO5個細(xì)胞/mL轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。根據(jù)貨架壽命保存的ー種方法，可植入材料保持在它的細(xì)胞培養(yǎng)小瓶中用于保存和/或轉(zhuǎn)運。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述細(xì)胞培養(yǎng)小瓶是50mL細(xì)胞培養(yǎng)小瓶(Evergreenbcientmc, Los Angeles,しA;Becton, Dickenson and Company, Franklin しakes，NJ)。根據(jù)保存的另ー種方法，所述可植入材料在30mL細(xì)胞培養(yǎng)小瓶中培養(yǎng)，然后在保存和/或轉(zhuǎn)運之前從它的細(xì)胞培養(yǎng)小瓶中 轉(zhuǎn)移到50mL轉(zhuǎn)運小瓶中以容納更大體積的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基。根據(jù)保存的進(jìn)ー步的方法，所述可植入材料從它的細(xì)胞培養(yǎng)小瓶中轉(zhuǎn)移到150mL轉(zhuǎn)運小瓶(Na I gene , Nalge Nunc Int’1，Rochester, NY)中。根據(jù)各種實施方式，所述轉(zhuǎn)運小瓶具有約53到58mL的體積,更優(yōu)選約54到56mL的體積,和最優(yōu)選約57ml的體積。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，所述轉(zhuǎn)運小瓶含有至少約5到6mL的5% C02/95%空氣，或空氣體積與培養(yǎng)基和可植入材料的體積的比例約為I :8到I :12，更優(yōu)選約I :10。在室溫下保存之前，從小瓶移除過濾器帽，用栓塞密封帽(Evergreen Scientific, Los Angeles, CA)密封小瓶，并蓋緊帽子。用于可植入材料的地面和航空運輸?shù)陌b。根據(jù)以下方法之一包裝可植入材料的轉(zhuǎn)運小瓶，其被包裝用于環(huán)境溫度下保存和設(shè)計用于經(jīng)由地面載體或航空載體運輸。根據(jù)ー種方法，在兩個可重新密封的塑料袋的每ー個中裝入三個轉(zhuǎn)運小瓶，并密封袋子。兩個袋子(六個小瓶)然后包裝到內(nèi)盒中。根據(jù)另ー種方法，將每個小瓶置于單獨的可重新封裝的塑料袋中，將袋子密封。然后將四個小瓶包裝到塑料圓筒中。所描述的包裝結(jié)構(gòu)的每ー種是被設(shè)計以提供多個邊界層以保護(hù)產(chǎn)物免于熱量影響、轉(zhuǎn)運損壞和維持清潔的無菌的環(huán)境。內(nèi)盒或塑料圓筒然后包裝到保溫的外部裝運盒中。所述外部裝運盒利用泡沫填充物和凝膠填充物來維持期望的熱環(huán)境(優(yōu)選約15 — 25°C)并保護(hù)對抗轉(zhuǎn)運損壞。包括在每個產(chǎn)品中的是合適的文件。裝有可植入材料的小瓶以及所述內(nèi)盒或塑料圓筒和所述外部裝運盒也被適當(dāng)?shù)貥?biāo)記。根據(jù)以下方法之一包裝可植入材料的冷凍瓶，用于在ー 20°C、一 80°C、或一 140°C到一 160°C下保存和設(shè)計用于經(jīng)由地面載體或航空載體運輸。根據(jù)ー種方法，將每個冷凍瓶置于單獨的可重新封裝的塑料袋中，將袋子密封。所述冷凍瓶然后包裝到含有干冰的保溫的內(nèi)盒，例如Styrofoam (Dow Chemical Co.，Midland, Ml)內(nèi)盒中。冷凍瓶被埋入或浸入干冰中。所述內(nèi)盒利用干冰(優(yōu)選約ー 80°C)來維持期望的熱環(huán)境(優(yōu)選約ー 80°C到一160°C)，和保護(hù)所述冷凍瓶對抗轉(zhuǎn)運損壞。StyTOfoam 內(nèi)盒然后包裝到保溫的外部裝運盒中。根據(jù)ー個實施方式，在到達(dá)臨床時，冷凍瓶被置于ー 20°C或一 80°C冷凍器中持續(xù)延長的保存時間。根據(jù)另ー個實施方式，在到達(dá)臨床時，所述冷凍瓶經(jīng)歷清洗和解凍操作，如上所述，用于即時的患者植入。根據(jù)各種實施方式，在使用之前，所述可植入材料可以通過低溫保存在低溫保存介質(zhì)中維持約ー個月到一年，之前和/或之后是在約室溫下在轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中保存約至少三周，同時維持了所述可植入材料的活力和功能。在即將植入之前，所述可植入材料可以從轉(zhuǎn)運、低溫保存或條件培養(yǎng)基中移出，在約250 — 500mL無菌鹽水(USP)中洗滌兩次或三次來除去剩余的培養(yǎng)基成分，包括FBS。在植入之前，可植入材料的樣品等分量可以由廠家和/或由醫(yī)師檢測活力，例如使用以上詳細(xì)描述的錐蟲藍(lán)分析進(jìn)行檢測。在由申請人或申請人的代理人收到對可植入材料的需求時,將啟動以下例示的一系列事件低溫保存的植入物將如上所述在干冰中準(zhǔn)備轉(zhuǎn)運，植入物將如上所述在室溫下準(zhǔn)備轉(zhuǎn)運，或?qū)⑼ㄟ^用細(xì)胞播種生物相容性基質(zhì)來制備植入物并允許體外生長直到它展現(xiàn)如上所述的ー種或多種功能表型。用于播種的細(xì)胞可以從以上解釋的細(xì)胞庫獲得，或可以直接從植入物的預(yù)定接受者獲得。不考慮可植入材料中存在的細(xì)胞來源或類型，不需要首先測試細(xì)胞與預(yù)定接受者的相容性。也就是說，使用本發(fā)明的可植入材料處理在生產(chǎn)或植入之前不需要相對于預(yù)定的接受者來細(xì)胞分型、細(xì)胞匹配或細(xì)胞相容性測試。當(dāng)根據(jù)在此列出的教導(dǎo)制備時，使用可植入材料的治療是與細(xì)胞類型無關(guān)的、細(xì)胞相容性自由的、匹配自由的治療方式。本發(fā)明的這種特征與常規(guī)的基于細(xì)胞、組織或器官的治療形成鮮明的對照，其通常需要預(yù)先測試來確定在預(yù)定接受者和要植入的細(xì)胞、組織或器官之間存在匹配；在缺乏匹配的情況下，將不進(jìn)行治療。本發(fā)明避免了預(yù)先測試以確定匹配存在的需要，從而為臨床醫(yī)師提供了可容易獲得的、不間斷的可植入材料供應(yīng)，用于在此描述的任一種損傷或疾病的治療。 實施例 實施例I :人AV瘺研究這個實施例提供了測試和使用可植入材料的優(yōu)選的實施方式的實驗方案，所述可植入材料包含血管內(nèi)皮細(xì)胞來增強(qiáng)瘺的熟化和/或防止瘺熟化失敗。使用標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)操作，在期望的解剖位置創(chuàng)建動靜脈瘺。然后將柔性平面形式的可植入材料放置在手術(shù)創(chuàng)建的瘺鄰近的血管周圍間隙中；以下列出了ー個示范性操作的細(xì)節(jié)。如較早描述的，可以改變可植入材料的放置和構(gòu)型以適合臨床環(huán)境。在這項研究中，在至少圖I或2A中描繪了優(yōu)選的示范性柔性平面形式。以下列出的實驗和方案提供了足夠的指導(dǎo)I.評估在3個月時熟化失敗的動靜脈瘺對于這項研究，熟化失敗被定義為在瘺建成后約12周內(nèi)不能允許瘺的重復(fù)性插管用于透滲祈，和不能獲得35 — 500mL/分鐘的范圍內(nèi)足夠的透滲析血流，優(yōu)選至少350mL/分鐘的血流。采用標(biāo)準(zhǔn)的臨床實踐。2.在第5天、2周、I、3和6個月和隨后的時間點，通過彩色流動多普勒超聲來評估通路流速和解剖結(jié)構(gòu)(區(qū)域狹窄％ )。如彩色流動多普勒超聲所測量的，在基線測量(手術(shù)后第5天)和手術(shù)后6個月之間絕對通路流量降低。與基線(手術(shù)后第5天的值)相比時，在6個月時多普勒超聲確定狹窄量。采用標(biāo)準(zhǔn)的臨床實踐。3.評估與使用同種異體的細(xì)胞產(chǎn)品相關(guān)的HLA抗體反應(yīng)。在第5天、2周、1、3和6個月時供體HLA抗體的存在的定量免疫學(xué)評估結(jié)果與手術(shù)前水平相比。采用標(biāo)準(zhǔn)的臨床實踐。特別地，該研究包括10位經(jīng)歷動靜脈瘺手術(shù)的尿毒癥患者。經(jīng)歷AV瘺手術(shù)的這些患者將接受(手術(shù)后立即)兩個(2) 1X4X0. 3cm (I. 2cm3)柔性平面形式實施方式的應(yīng)用；ー個(i)置于接合接點，另ー個縱向地置于遠(yuǎn)離接合點的近端靜脈段上。其他5位患者將被編入，但不接受植入物。這5名患者將用于與標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理比較。在第5天、2周和在1、3和6個月時將進(jìn)行臨床跟蹤。使用彩色流動多普勒超聲的通路流量測定將在手術(shù)后第5天進(jìn)行，來確定基線水平，隨后在手術(shù)后2周、I個月、3個月和6個月進(jìn)行。對展現(xiàn)了低于約350mL/分鐘的絕對流量、或在早先測量中展現(xiàn)了超過25%的流量降低、或展現(xiàn)大于50%區(qū)域狹窄(如多普勒超聲所測量的)的患者進(jìn)行血管造影。對于血管造影所測定的大于50 %的狹窄病變，允許補(bǔ)救性臨床介入，例如血管成形木。對具有12周內(nèi)未能熟化的瘺的患者將進(jìn)行診斷成像。允許標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)救性臨床介入，包括血管成形術(shù)和手術(shù)來打結(jié)側(cè)枝或修正瘺，以幫助未能在12周內(nèi)熟化的瘺實現(xiàn)功能性熟化。每位患者的研究參與持續(xù)時間將是6個月。從而，總共15名患者將加入這個試驗。十名患者將各自接受2個植入物，接受標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理的5名患者用于比較。經(jīng)歷用于血液透析通路的AV瘺放置的患者也將被編入。根據(jù)以下研究設(shè)計，用本發(fā)明的可植入材料處理的十名處理的患者將各自接受標(biāo) 準(zhǔn)的AV瘺放置、藥物治療、處理和植入物。這些患者的前5名將接受柔性平面形式的兩個移植物，ー個處在結(jié)合點位置，另ー個縱向地置于遠(yuǎn)離接合點的近端靜脈段上。在處理了這個第一組中的最后一名患者之后，在下一組的處理之前存在ー個月的觀察期。在從前5名患者獲得滿意的I個月數(shù)據(jù)之后，將處理后5名患者。五名患者將被編入臨床試驗，將接受標(biāo)準(zhǔn)的AV瘺放置、藥物治療、處理，但沒有可植入材料。這些患者將用于與標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理比較，將接受與植入物處理的患者類似的成像和免疫學(xué)跟蹤。常規(guī)的AV瘺手術(shù)操作將根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作技術(shù)進(jìn)行。在瘺完成之時，但在植入之前，進(jìn)行對流出靜脈直徑的測量。無齒鑷子被用于從清洗碗中輕輕地取出平面形式的可植入材料。在通路手術(shù)完成并在進(jìn)行了所有基線測量的情況下確定流經(jīng)瘺的流量之后，應(yīng)用可植入材料。在放置可植入材料之前，控制所有的出血，使要處理的區(qū)域盡可能干燥。在植入物放置之后將不再沖洗該區(qū)域。ー個或兩個植入物將用于處理接合位置。另ー個植入物用于處理遠(yuǎn)離接合點的近端靜脈段。在某些實施方式中，通過將植入物的一端移至接合段下部，直到植入物的中部處在血管的匯合點上，來處理端對面血管連接。然后將兩端卷繞縫合線，保持植入物中心在縫合線上。通過從接合位置開始將可植入材料縱向地沿靜脈的長度放置，處理近端靜脈段(遠(yuǎn)離靜脈-動脈接合點)。可植入材料不需要完全地卷繞靜脈的圓周。在AV瘺手術(shù)之后的醫(yī)院恢復(fù)過程期間，使用標(biāo)準(zhǔn)的護(hù)理操作跟蹤患者。緊密地監(jiān)視生命體征。記錄伴隨的藥物治療。告知患者在第5天、2周以及在1、3和6個月時的跟蹤訪問需求。將在手術(shù)后5天(基線)、2周和此后1、3和6個月時記錄通路流量。狹窄的程度還將通過多普勒超聲在第5天測定來建立基線水平，再次在2周、1、3和6個月測定用于比較目的。在手術(shù)后5天、2周、I、3和6個月獲得5cc全血樣本來提供血清，用于測定抗HLA抗體水平。使用彩色流動多普勒超聲在手術(shù)后第5天(±24小吋)測定通路流量來建立基線測量值，并在手術(shù)后2周(±2天)、I個月(±4天)、3和6個月(±7天)測定。對展現(xiàn)了低于約350mL/分鐘的絕對流量、或在他們早先測量中展現(xiàn)了超過25%的流量降低、或展現(xiàn)大于50%區(qū)域狹窄(如多普勒超聲所測量的)的患者進(jìn)行血管造影。對于血管造影所測定的大于50%狹窄的狹窄病變，允許補(bǔ)救性臨床介入，例如血管成形木。對具有12周內(nèi)未能熟化的瘺的患者將進(jìn)行診斷成像。允許標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)救性臨床介入，包括血管成形術(shù)和手術(shù)來打結(jié)側(cè)枝或修正瘺，以幫助未能在12周內(nèi)熟化的瘺實現(xiàn)功能性熟化。這種介入可以繼之以可植入材料的植入，來增強(qiáng)修正的瘺的熟化和/或維持修正的瘺的功能和援救正在失效或已失效的瘺。AV瘺研究的預(yù)期結(jié)果。預(yù)期的是，如上所述用本發(fā)明的可植入材料處理的患者將展示瘺熟化增強(qiáng)和/或防止瘺熟化失敗的ー種或多種標(biāo)志。特別地，處理的患者將分別顯示，例如，改善的血流量、直至足夠透滲析的流量(例如，35 — 500mL/分鐘范圍內(nèi)的血流，優(yōu)選至少350mL/分鐘)和/或重復(fù)地套管插入所述瘺用于透滲析的改善的能力。瘺熟化的另一種標(biāo)志是脈壁厚度；成功地熟化的或熟化中的瘺展現(xiàn)出脈壁增厚。這將根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的臨床實踐使用血管內(nèi)超聲(IVUS)來測量。簡要地，IVUS將用于測量脈壁厚度并描繪內(nèi)膜和中層之間的厚度。處理的瘺或?qū)φ寨泴⒈徊迦雽?dǎo)管，超聲探針置于目標(biāo)靜脈和動脈內(nèi)部。功能性瘺的又ー個標(biāo)志是充足的管腔直徑。預(yù)期的是，本發(fā)明的可植入材料將允許維持充足的管腔直徑，從而允許血液以適合于有效透滲析的速度不受阻礙地流動，即，略大于透滲析機(jī) 器的泵速度的血流量；或至少足以防止透滲析期間的再循環(huán)的血液速度。從瘺建成后第5天開始和此后的手術(shù)后至少3個月，使用瘺的血管造影來連續(xù)監(jiān)視管腔直徑。利用標(biāo)準(zhǔn)的多普勒超聲方案，將手術(shù)后管腔的狹窄與血流速度相關(guān)聯(lián)。預(yù)期的是，所述可植入材料將防止或延遲變窄，所述變窄阻擋血流使其低于在此描述的適合透滲析的速度。表征了失效瘺的這種管腔變窄，可以由于狹窄和內(nèi)膜的相關(guān)增厚而引起，或可以通過血管的皺縮和/或收縮而沒有任何相關(guān)的增厚而引起。對于實際的增厚來說，血管成形術(shù)介入是當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)的臨床手段；對于皺縮和/或收縮來說，例如由于消極組織重塑的皺縮和/或收縮，擴(kuò)張術(shù)是當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)的臨床介入。預(yù)期的是，植入物處理的瘺將不需要血管成形術(shù)或擴(kuò)張術(shù)。作為整體，處理的患者預(yù)計在至少ー種這些前述的熟化標(biāo)志方面與對照相比至少顯示了増加的差異。實施例2 AV移植物動物研究這個實施例提供了實驗方案，用于測試和使用本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式來促進(jìn)動物測試受試者中功能性AV移植物的形成。使用標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)操作，在頸動脈和頸靜脈之間創(chuàng)建AV移植物。然后將可植入材料放置在每個手術(shù)創(chuàng)建的AV移植物接合點鄰近的血管周圍間隙中；以下列出了ー個示范性操作的細(xì)節(jié)。如較早描述的，可植入材料的放置和構(gòu)型可以改變。在這項研究中，所述可植入材料具有如圖4A、圖4B和圖4C描繪的柔性平面形式。特別地，該研究包括經(jīng)歷了 AV移植物手術(shù)的26名豬測試受試者。常規(guī)的AV移植手術(shù)操作將根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作技術(shù)進(jìn)行。在移植手術(shù)完成以及移植物通暢之后，可植入材料被應(yīng)用到AV移植物接合點和周圍，如以下描述的。對于經(jīng)歷了 AV移植手術(shù)的每個測試受試者，將ー個六毫米內(nèi)徑的PTFE移植物置于測試受試者的左側(cè)頸總動脈和右側(cè)外頸靜脈之間。使用運動6 — 0聚丙烯縫合線，在移植物的每個末端創(chuàng)建傾斜的端對面接合點。在了之后，所有測試受試者接受內(nèi)部起作用的肝素和每天施用阿斯匹林。十位測試受試者在手術(shù)當(dāng)天接受包含主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的可植入材料。五個這樣的植入物被應(yīng)用給每個測試受試者。兩個接合位置的每ー個都用兩個植入物卷繞。在這種環(huán)境下，將可植入材料的一端移至接合段下部，直到植入物的中部處在血管和移植物的匯合點上。然后將植入物兩端卷繞縫合線，保持植入物中心在縫合線上。末端最低限度地疊蓋來固定材料就位。對于每個測試受試者，另外ー個植入物場區(qū)那個接合點處開始沿著近端靜脈段的長度縱向地放置。植入物不完全地卷繞靜脈的圓周。用可植入材料纏繞接合點位置，例如，如圖4A和圖4B中說明的。另外，通過從接合位置開始將可植入材料縱向地沿靜脈的長度放置，例如，如圖4C中說明的，來處理近端靜脈段(靜脈-動脈接合點的遠(yuǎn)端)。十名測試受試者接受沒有細(xì)胞的對照植入物，在手術(shù)當(dāng)天將對照植入物卷繞接合點位置并置于移植物的近端靜脈段上，例如，如圖4A、圖4B和圖4C中描繪的。其他6名測試受試者不接受任何ー種類型的植入物。這6名測試受試者將用于與標(biāo)準(zhǔn)照料比較。根據(jù)體重的總細(xì)胞載荷是大約2. OX 105個細(xì)胞姆kg。預(yù)期的是,這種細(xì)胞載荷是如下所述將用于人類臨床研究的估計的細(xì)胞載荷的大約至少6 — 10倍。 手術(shù)操作。產(chǎn)生15cm的中線縱向頸部切ロ，分離左側(cè)頸總動脈，之后是右側(cè)外頸靜脈。從周圍組織剝離8cm靜脈段，從靜脈伸出的所有分支用3 — 0絲縫線連接。夾住左側(cè)頸動脈，進(jìn)行7mm直徑的環(huán)向動脈切開術(shù)。使用連續(xù)的6 — 0聚丙烯縫合線,在動脈和6mm內(nèi)徑PTFE移植物之間產(chǎn)生傾斜的端對面接合點。一旦形成，除去動脈夾具，用肝素-鹽水溶液沖洗移植物。記錄動脈進(jìn)入移植物的流量。移植物然后穿過胸鎖乳突肌肉之下并進(jìn)入右側(cè)外頸靜脈附近。直接在外頸靜脈上進(jìn)行7mm直徑環(huán)向靜脈切開木。然后使用連續(xù)的6 — 0聚丙烯縫合線在PTFE移植物和右側(cè)外頸靜脈之間以傾斜的端對面接合完成動靜脈移植物，(移植物的長度在15 — 25cm之間,在放置之時記錄)。除去所有夾具，確認(rèn)移植物通暢。遠(yuǎn)尚PTFE接合點的左側(cè)頸動脈用3 — 0絲縫線雙重地結(jié)扎。在完成接合之后，定位PTFE動靜脈移植物以防止扭結(jié)。PTFE動靜脈移植物使用23-規(guī)格(gauge)蝴蝶針在頸動脈-移植物接合點遠(yuǎn)端透皮地插管。為了確認(rèn)放置，將血液吸出到具有IOcc注射器的系統(tǒng)中。然后用IOcc鹽水沖洗系統(tǒng)。然后在研究動物的頸部上放置C-臂熒光鏡，從而可以顯現(xiàn)靜脈-移植物接合點和靜脈流出道。在連續(xù)的熒光檢查之下，注射10 — 15cc的含碘造影劑(iodinated contrast) (Renograffin,全強(qiáng)度)。記錄并保存電影血管造影片，用于與預(yù)先處死而得到的血管造影片比較。在血管造影完成之后，將接合點位置包在濕潤的4〃X4〃紗布棉拭中。維持接合點位置的壓カ持續(xù)大約5分鐘的時間，之后除去紗布棉拭，檢查接合位置。如滲血所證明的，如果還沒有實現(xiàn)止血，再次纏繞該位置另外的5分鐘。如果從該位置的出血是嚴(yán)重的，在外科醫(yī)生的判斷下放置其他縫合線。一旦實現(xiàn)止血，用無菌鹽水填充頸部傷ロ，使用6mm跨音速流量探測器在遠(yuǎn)端靜脈流出道處進(jìn)行流量探測分析。如有必要，除去鹽水，使接合點盡可能干燥，用包含主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的可植入材料或?qū)φ罩踩胛飦硖幚怼）`些位置不用任ー種植入物處理，直到已經(jīng)控制了所有的出血，確認(rèn)移植物通暢，使該區(qū)域盡可能干燥。完成吋，按層閉合傷ロ，容許動物從麻醉中恢復(fù)。在手術(shù)前作為100U/kg的彈丸注射加上35U/kg/hr的連續(xù)輸注來施用肝素，維持直到手術(shù)結(jié)束。根據(jù)需要施用另外的彈丸劑量(100U/kg)，以維持ACT ^ 200秒。
移植物開通性。在手術(shù)之后立即地、手術(shù)后3 — 7天以及此后每周一次地，使用彩色流動多普勒超聲和跨音速流量探測器(Transonic Systems, Inc. , Ithaca, NY)通過通路流量測定來確認(rèn)AV移植物開通性。嚴(yán)密監(jiān)視移植物的血流量。病理過程。動物試驗受 試者使用戊巴比妥鈉(65mg/kg，IV)麻酔。暴露PTFE移植物，進(jìn)行PTFE移植物和靜脈接合點的數(shù)字?jǐn)z影。PTFE動靜脈移植物然后使用23-規(guī)格蝴蝶針在頸動脈-移植物接合點遠(yuǎn)端透皮地插管。為了確認(rèn)放置，將血液吸出到IOcc注射器的系統(tǒng)中。然后用IOcc鹽水沖洗系統(tǒng)。然后在研究動物的頸部上放置C-臂熒光鏡，從而可以顯現(xiàn)靜脈-移植物接合點和靜脈流出道。在連續(xù)的熒光檢查之下，注射10 — 15cc的含碘造影劑(Renograffin,全強(qiáng)度)。在PTFE移植物的0°和90°角處記錄電影血管造影片。通過將尸檢血管造影片的盲讀數(shù)與放置后的血管造影片成對比較，測定移植物開通率和靜脈流出道的狹窄程度。取決于血管造影片中觀察的狹窄程度，在0 — 5的尺度上分級血管造影片。分級方案采用以下的0=0%狹窄，1=20%狹窄，2=40%狹窄，3=60%狹窄，4=80%狹窄和5=100%狹窄。預(yù)料的是，在檢查血管造影片時，與對照物相比，用本發(fā)明的可植入材料處理的移植物將展現(xiàn)降低的狹窄百分比。組織學(xué)。一半的動物測試受試者(5例細(xì)胞移接的植入物受試者；5例對照植入物受試者；3例沒有植入物的受試者)在手術(shù)后3天被執(zhí)行安樂死。其余的動物測試受試者(5例細(xì)胞移接的植入物受試者；5例對照植入物受試者；3例沒有植入物的受試者)在手術(shù)后ー個月被執(zhí)行安樂死。在所有測試受試者上進(jìn)行有限的尸檢，被定義為施用位置的宏觀檢查，包括所有接合點和近端靜脈位置、和周圍組織，包括導(dǎo)液淋巴結(jié)。對于在手術(shù)后ー個月被執(zhí)行安樂死的所有測試受試者，收集來自主要器官，包括腦、肺、腎臟、肝臟、心臟和脾臟的組織，并保存。僅當(dāng)從身體外表面的宏觀檢查或從施用位置和周圍組織的顯微鏡檢查產(chǎn)生異常發(fā)現(xiàn)時，器官才被分析。沒有出現(xiàn)異常的發(fā)現(xiàn)，這保證了對被編入這項研究中的任何動物中主要器官進(jìn)行進(jìn)一步檢查。所有的AV移植物接合位置和周圍組織，包括每個接合的靜脈和動脈的5cm段，被修整、固定在10%福爾馬林(或等效物)中，并包埋在こニ醇甲基丙烯酸酯(或等效物)中。使用C-形不銹鋼刀(或等效物)切下的大約3 u m厚切片，從至少三個區(qū)域制備切片靜脈移植物接合點、移植物-動脈接合點和靜脈流出道。橫斷靜脈移植物接合點地制作三個切片。穿過靜脈流出道制作五個切片(因而覆蓋I. 5cm的流出靜脈)。以Imm的間隔穿過移植物-動脈接合點制作三個切片。這些切片固定在明膠包被的(或等效物)玻璃載片上，用蘇木素和曙紅或Verhoeffs彈性蛋白著色劑來染色。急性地(3天的受試者)和長期地(I個月的受試者)測定血管周炎癥和管腔炎癥。急性炎癥標(biāo)志是粒細(xì)胞、主要是嗜中性粒細(xì)胞，而慢性炎癥標(biāo)志是巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。另夕卜，切片也可以用于以下特異性標(biāo)記物染色抗CD45來鑒定白細(xì)胞，抗CD3來鑒定T細(xì)胞，⑶79a來鑒定B細(xì)胞，以及MAC387來鑒定單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。檢查并記錄染色的載玻片上平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的存在，以及動脈或靜脈接合點與人工移植物材料之間的整合指標(biāo)。分離的組織的所有切片，包括每個靜脈移植物接合點、移植物-動脈接合點、靜脈流出道的移植物材料、內(nèi)膜/偽內(nèi)膜、近管腔的血管中層的內(nèi)部部分、近外膜的血管中層的外部部分以及外膜，將被評估和計分。每ー個組織區(qū)室，例如內(nèi)膜、血管中層和外膜的大小，將按微米來計量。將評估每個切片的每種以下標(biāo)志的存在和/或程度。將評估炎癥的標(biāo)志，包括但不限于，嗜中性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、巨細(xì)胞和漿細(xì)胞的存在和程度。將評估移植物切片是否存在成纖維細(xì)胞、新血管形成、 丐化、出血、充血、血纖蛋白、移植物纖維化和移植物浸潤(graft infiItration)。另外將評估組織切片的退化標(biāo)志，包括但不限于退化、弾性蛋白損失和/或組織部分的缺失、平滑肌肌纖維的空泡化和/或組織的鈣化。還將評估組織切片的內(nèi)皮細(xì)胞増殖、內(nèi)膜下細(xì)胞増殖，包括但不限于新血管形成以及平滑肌肌纖維、成纖維細(xì)胞和纖維化的存在。還將評估每個測量的組織切片的組織壞死和外來物質(zhì)的存在。為每個變量按0到4的標(biāo)度分配分值(0=沒有顯著的變化；1=最小的；2=輕微的；3=中度的；4=嚴(yán)重的)。僅僅來自I個月動物試驗受試者的動靜脈移植物接合位置的其他切片將被固定在玻璃載片并染色(Verhoeff ’ s弾性蛋白)用于形態(tài)學(xué)分析。對每個切片使用具有圖象顯微鏡的計算機(jī)化的數(shù)字面積法和定制的軟件來進(jìn)行腔、中層、內(nèi)膜和總血管體積的測量。將對每個切片測定內(nèi)膜增生的程度。定量內(nèi)膜增生的ー種方法是通過總血管壁面積來標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)膜面積[(內(nèi)膜，mm2) / (內(nèi)膜+血管中層，_2)]，或通過測定殘余管腔來標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)膜面積[(管腔，mm2) /管腔+內(nèi)膜，mm2)]。 AV移植物動物受試者的結(jié)果。如上所述用本發(fā)明的可植入材料處理的受試者顯示了臨床上功能性AV移植物形成的ー種或多種標(biāo)志。根據(jù)在此公開的材料和方法處理的AV移植物支持了足以允許透滲析的血流速度。有效的透滲析需要略大于透滲析機(jī)器的泵速度的血流量，或至少足夠防止透滲析期間的再循環(huán)的血液速度。并且，處理的受試者分別顯示了降低的開裂發(fā)生率，所述開裂被定義為接合的靜脈或動脈從PTFE移植物分離，以及顯示了改善的修復(fù)性橋整合，所述整合被定義為平滑肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入修復(fù)性橋的管腔或在其內(nèi)的増殖和/或遷移。靜脈流出位置處AV移植物的血液流量與進(jìn)入移植物位置的血液流量是可比較的。如在此使用的，可比較的意思是對于臨床目的基本上是相似的。例如，期望的血流速度是約150 — 500mL/分鐘，優(yōu)選約300 — 500mL/分鐘，更優(yōu)選約350 —400mL/ 分鐘。另外，平滑肌細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入修復(fù)性橋或在之內(nèi)的遷移將作為整合的標(biāo)志來測量。預(yù)期的是，本發(fā)明的可植入材料將促進(jìn)平滑肌細(xì)胞増殖和內(nèi)皮細(xì)胞増殖，以及兩者向橋內(nèi)的遷移。可以獲得整個PTFE移植物上的三個五微米切片并對SMC肌動蛋白染色，進(jìn)行評估來鑒定SMC和因子VIII (von Willebrands因子)和/或PECAM-1，以鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞將使用顯微鏡檢查/形態(tài)測定法和定制軟件來測定。功能性A/V移植物的又ー個標(biāo)志是充足的管腔直徑。通過降低血管狹窄，本發(fā)明的植入物將允許維持充足的管腔直徑，從而允許血液以適合于有效透滲析的速度不受阻礙地流動，即，有效的透滲析需要略大于透滲析機(jī)器的泵速度的血流量，或至少足以防止透滲析期間的再循環(huán)的血流速度。在動靜脈移植物建成當(dāng)天和即將30天處死之前，使用對動靜脈移植物接合點的血管造影來監(jiān)視管腔直徑和狹窄百分比。利用標(biāo)準(zhǔn)的多普勒超聲方案，將手術(shù)后管腔的變窄與血流速度相關(guān)聯(lián)。與對照植入物相比，本發(fā)明的可植入材料降低了處理的接合點的狹窄的存在和程度。對于研究中的每個測試受試者通過血管造影確定的狹窄百分比在以下表I中顯示。平均起來，可植入材料降低了狹窄百分之九十五，從對照動物的46%降低到接受包含細(xì)胞的移植物的動物的2. 5% ([46 - 2. 5]/46X 100)。結(jié)果將組織學(xué)地確認(rèn)。這些研究說明了，本發(fā)明阻止或延遲了變窄，從提高了 A/V移植物接合點的功能，所述變窄阻擋血流使其低于適合于透滲析的速度。表IAV移植物研究的總結(jié)
狹窄百分比狹窄百分比動籍# 組 (與移植物呈(與移植物呈平均狹窄百分比__0° 角)_90° 角)__
1656230 %20%25 %
1657280%80%80%
1664260%80%フ0 /
166720%20%10%
16243ND0%Oo
165930%0%0%
166630%20%10%
1670 _3 _0%_0% _0%_
組2:接受單獨的生物相容性基質(zhì)的對照植入物。 組3:接受包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的柔性平面形式可植入材料。實施例3 :人AV移植物臨床研究這個實施例提供了實驗方案，用于測試和使用本發(fā)明來促進(jìn)人臨床測試受試者中形成功能性AV移植物。使用標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)操作，在期望的解剖位置創(chuàng)建AV移植物接合點，在動脈和靜脈接合點之間放置ePTFE修復(fù)性橋。然后將可植入材料放置在每個手術(shù)創(chuàng)建的AV移植物接合點鄰近的血管周圍間隙中；以下列出了一個示范性操作的細(xì)節(jié)。如較早描述的，可植入材料的放置和構(gòu)型可以由熟練醫(yī)師按照常規(guī)方式改變。具體地，該研究包括經(jīng)歷了 AV移植手術(shù)的人測試受試者。常規(guī)的AV移植手術(shù)操作將根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作技術(shù)進(jìn)行。在移植手術(shù)完成以及確認(rèn)移植物通暢之后，本發(fā)明的可植入材料將被應(yīng)用到AV移植物接合點和周圍，如以下描述的。人臨床受試者將在手術(shù)當(dāng)天接受可植入材料的ー個或多個部分。兩到三個這種部分將應(yīng)用于每個測試受試者。可植入材料的ー個部分卷繞每個接合點位置。然后將一端移至接合段下部，直到纏繞物的中部處在血管和移植物的匯合點上。然后將植入物兩端卷繞縫合線，保持植入物中心在縫合線上。末端可以疊蓋來固定材料就位。對于每個測試受試者，可植入材料的其他單個部分將置于動靜脈移植物的近端靜脈段，從接合點處開始沿著靜脈的長度縱向地放置。可植入材料不需要完全地卷繞靜脈的圓周。
接合點位置將用優(yōu)選的植入物處理，例如，如在圖4A、圖4B和圖4C中，或在圖5中說明的。另外，在某些患者中，通過從接合位置開始將優(yōu)選的植入物縱向地沿靜脈的長度放置，處理近端靜脈段(遠(yuǎn)離靜脈-動脈接合點)。預(yù)期的是，基于體重的總細(xì)胞載荷將是大約
2.0X104個細(xì)胞每kg到大約6. 0X104個細(xì)胞每kg。在第5天、2周和在1、3和6個月時將進(jìn)行臨床跟蹤。將在手術(shù)后第5天需要使用彩色流動多普勒超聲進(jìn)行通路流量測定，來確定基線水平，隨后在手術(shù)后2周、I個月、3個月和6個月測定流量。對展現(xiàn)了低于約350mL/分鐘的絕對流量、或在早先測量中展現(xiàn)了超過25%的流量降低、或展現(xiàn)大于50%區(qū)域狹窄(如多普勒超聲所測量的)的測試受試者進(jìn)行血管造影。對于血管造影所測定的大于50%的狹窄病變，允許補(bǔ)救性臨床介入，例如血管成形木。
在基線處，在3個月時，進(jìn)行移植物以及動脈和靜脈接合位置的血管造影對比。對每個區(qū)域計算管腔直徑，測量峰值收縮速度。人AV移植物臨床研究的預(yù)期結(jié)果。預(yù)期的是，如上所述用本發(fā)明的可植入材料處理的受試者將顯示臨床上功能性AV移植物形成的ー種或多種標(biāo)志。特別地，治療的受試者將分別顯示，例如，改善的血流，高達(dá)至少足夠透滲析的流量(例如，35 — 500mL/分鐘范圍內(nèi)的血流，和優(yōu)選至少350mL/分鐘)，降低的開裂發(fā)生率，所述開裂被定義為接合靜脈或動脈從PTFE移植物的分離，降低的移植物周圍血清集中(serous perigraft collection)以及假動脈瘤的發(fā)生率，和/或改善的修復(fù)性橋整合，所述整合被定義為平滑肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入修復(fù)性橋的管腔或在其內(nèi)的増殖和/或遷移。靜脈流出位置處AV移植物的血液流量與進(jìn)入移植物位置的血液流量是可比較的。可比較的意思是對于臨床目的基本上是相似的。例如，期望的血流速度是約150 — 500mL/分鐘，優(yōu)選約300 — 500mL/分鐘，更優(yōu)選約 350 — 400mL/ 分鐘。另外，進(jìn)入修復(fù)性橋或在其內(nèi)的平滑肌細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞遷移將作為整合的標(biāo)志通過血管內(nèi)超聲來測量。預(yù)期的是，當(dāng)如在此描述的使用時，本發(fā)明的可植入材料將促進(jìn)平滑肌細(xì)胞増殖和/或內(nèi)皮細(xì)胞増殖，以及兩者向橋內(nèi)的遷移。功能性AV移植物的又ー個標(biāo)志是充足的管腔直徑。預(yù)期的是，本發(fā)明的植入物將允許維持充足的管腔直徑，從而允許血液以適合于有效透滲析的速度不受阻礙地流動，即，有效的透滲析需要略大于透滲析機(jī)器的泵速度的血流量，或至少足以防止透滲析期間的再循環(huán)的血流速度。在基線處(動靜脈移植物建成后大約5天)和此后的手術(shù)后至少3個月，使用對動靜脈移植物接合點的血管造影監(jiān)視管腔直徑。利用標(biāo)準(zhǔn)的多普勒超聲方案，將手術(shù)后管腔的狹窄與血流速度相關(guān)聯(lián)。預(yù)期的是，當(dāng)如在此描述的使用時，本發(fā)明將防止或延遲變窄，所述變窄阻擋血流，使其低于在此描述的適合透滲析的速度。對于AV移植物來說，預(yù)期的是，本發(fā)明的可植入材料將防止或降低開裂的發(fā)生率。作為整體，處理的受試者預(yù)計在至少ー種這些前述的功能標(biāo)志方面與對照相比至少顯示了増加的差異。實施例4 :外周移植物研究這個實施例提供了實驗方案，用于測試和使用本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式來促進(jìn)測試受試者中形成功能性外周移植物。使用標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)操作，在期望的解剖位置創(chuàng)建外周移植物接合點，在接合點之間放置ePTFE修復(fù)性橋。然后將可植入材料放置在每個手術(shù)創(chuàng)建的外周移植物接合點鄰近的血管周圍間隙中；以下列出了一個示范性操作的細(xì)節(jié)。如較早描述的，可植入材料的放置和結(jié)構(gòu)可以改變。具體地，該研究包括經(jīng)歷了外周移植手術(shù)的測試受試者。常規(guī)的外周移植物手術(shù)操作將根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作技術(shù)進(jìn)行。在移植手術(shù)完成以及確認(rèn)移植物通暢之后，可植入材料將被應(yīng)用到外周移植物接合點和周圍，如以下描述的。測試受試者將在手術(shù)當(dāng)天接受一個或多個優(yōu)選的可植入材料。兩到三個這種植入物將應(yīng)用于每個測試受試者。ー個這種植入物卷繞每個接合點位置。然后將可植入材料的一端移至接合段下部，直到纏繞物的中部處在血管和移植物的匯合點上。然后將植入物兩端卷繞縫合線，保持植入物中心在縫合線上。末端可以相互疊蓋來固定材料就位。對于每個測試受試者，其他的單個植入物可以置于外周移植物的近端靜脈段，從接合點處開始沿著靜脈的長度縱向地放置。植入物不需要完全地卷繞靜脈的圓周。
接合點位置將用可植入材料纏繞，例如，如在圖4A、圖4B和圖4C中，或在圖5中說明的。另外，通過從接合位置開始將可植入材料縱向地沿血管的長度放置，處理近端血管段(遠(yuǎn)離接合點)。基于體重的總細(xì)胞載荷將是大約2. 0 X 104個細(xì)胞每kg到大約6. 0 X IO4個細(xì)胞每kg。在第5天、2周和在1、3和6個月時將進(jìn)行臨床跟蹤。將在手術(shù)后第5天需要使用彩色流動多普勒超聲進(jìn)行血流量測量，來確定基線水平，隨后在手術(shù)后2周、I個月、3個月和6個月進(jìn)行血流量測量。對展現(xiàn)了低于約350mL/分鐘的絕對流量、或在早先測量中展現(xiàn)了超過25%的流量降低、或展現(xiàn)大于50%區(qū)域狹窄(如多普勒超聲所測量的)的測試受試者進(jìn)行血管造影。對于血管造影所測定的大于50%的狹窄病變，允許補(bǔ)救性臨床介入，例如血管成形木。將進(jìn)行移植物以及接合位置的血管造影對比。對每個區(qū)域計算管腔直徑，測量峰值收縮速度。外周移植物受試者的預(yù)期結(jié)果。預(yù)期的是，如上所述用本發(fā)明的可植入材料處理的受試者將顯示臨床上功能性外周移植物形成的ー種或多種標(biāo)志。根據(jù)在此公開的材料和方法處理的外周移植物將支持足以恢復(fù)或維持臨床上可接受的血液循環(huán)的血流量。并且，處理的受試者將分別顯示，例如，降低的開裂發(fā)生率，所述開裂被定義為接合的靜脈從PTFE移植物分離，和/或顯示改善的修復(fù)性橋整合，所述整合被定義為平滑肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入修復(fù)性橋的管腔或在其內(nèi)的増殖和/或遷移。流出位置處外周移植物的血液流量與進(jìn)入移植物位置的血液流量是可比較的。如在此使用的，可比較的意思是對于臨床目的基本上是相似的。例如，期望的血流速度是約150 — 500mL/分鐘，優(yōu)選約300 — 500mL/分鐘，更優(yōu)選約350 — 400mL/分鐘。另外，進(jìn)入修復(fù)性橋或在其內(nèi)的平滑肌細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞遷移將作為整合的標(biāo)志來測量。預(yù)期的是，本發(fā)明的可植入材料將促進(jìn)平滑肌細(xì)胞増殖和/或內(nèi)皮細(xì)胞増殖，以及兩者向橋內(nèi)的遷移。功能性外周移植物的又ー個標(biāo)志是充足的管腔直徑。預(yù)期的是，本發(fā)明的植入物將允許維持足夠的管腔直徑，從而允許血液以足夠維持外周循環(huán)的速度不受阻礙地流動。在基線處，在移植物建成后至少3個月，使用外周移植物的血管造影監(jiān)視管腔直徑。利用標(biāo)準(zhǔn)的多普勒超聲方案，將手術(shù)后管腔的狹窄與血流速度相關(guān)聯(lián)。預(yù)期的是，本發(fā)明的可植入材料將防止或延遲變窄，所述變窄阻擋血流，使其低于在此描述的適合于外周循環(huán)的速度。對于外周旁路移植物來說，預(yù)期的是，使用本發(fā)明的可植入材料處理將產(chǎn)生允許臨床上可接受的循環(huán)的血流速度、或近似正常的速度。移植物的流入和留出將是可比較的。可比較的意思是對于臨床目的基本上是相似的。例如，期望的血流速度是約150 — 500mL/分鐘，優(yōu)選約300 — 500mL/分鐘，更優(yōu)選約350 — 400mL/分鐘。另外，預(yù)期的是，所述處理將促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞的増殖和遷移進(jìn)入修復(fù)性移植物或天然移植物。對于外周旁路移植物來說，預(yù)期的是，本發(fā)明的可植入材料將防止或降低開裂的發(fā)生率。作為整體，處理的受試者預(yù)計在至少ー種這些前述的功能標(biāo)志方面與對照相比至少顯不了增加的差異。本發(fā)明可以以其他特定的形式體現(xiàn)而不背離其精神和基本特征。當(dāng)前的實施方式 因而被認(rèn)為是說明性的而非限制性的，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求書而不是由上述說明書來表明，因而本發(fā)明包括處在權(quán)利要求書的含義和等效范圍內(nèi)的所有改變。
權(quán)利要求
1.一種可植入材料，包含 (a)細(xì)胞群體，所述細(xì)胞群體具有抑制性表型，使得它們能夠抑制或干擾血管平滑肌細(xì)胞增殖，其中，所述細(xì)胞群體通過細(xì)胞-基質(zhì)相互作用連接到柔性平面的或可流動的生物相容性基質(zhì)，并且其中所述細(xì)胞群體是近融合的、融合的或融合后的細(xì)胞的群體；和 一定體積的低溫保存介質(zhì)，所述低溫保存介質(zhì)包含低溫保存劑、多糖和血清，其中所述體積的低溫保存介質(zhì)足以維持細(xì)胞活力、所述抑制性表型和基質(zhì)完整性，同時所述可植入材料處于冷凍狀態(tài)。
2.權(quán)利要求I的可植入材料，其中所述材料處于冷凍狀態(tài)至少約2個月。
3.權(quán)利要求I的可植入材料，其中所述材料處于冷凍狀態(tài)至少約6個月。
4.權(quán)利要求I的可植入材料，其中所述材料處于冷凍狀態(tài)至少約I年。
5.權(quán)利要求I一 4任一項的可植入材料，其中所述細(xì)胞群體的細(xì)胞活力是至少約80%。
6.權(quán)利要求I一 4任一項的可植入材料，其中所述細(xì)胞群體作為非冷凍保藏的相似的細(xì)胞群體表達(dá)相同的產(chǎn)物，其中所述產(chǎn)物選自硫酸乙酰肝素、TGF-P、b-FGF和NO。
7.權(quán)利要求6的可植入材料，其中由所述細(xì)胞群體表達(dá)的產(chǎn)物包括至少約1.0微克/IO6個細(xì)胞/天的硫酸乙酰肝素。
8.權(quán)利要求7的可植入材料，其中由所述細(xì)胞群體表達(dá)的產(chǎn)物包括至少約300pg/ml/天的TGF-3。
9.權(quán)利要求8的可植入材料，其中由所述細(xì)胞群體表達(dá)的產(chǎn)物包括不大于約400pg/ml/ 天的 b-FGF。
10.權(quán)利要求I的可植入材料，其中所述材料轉(zhuǎn)變至非冷凍狀態(tài)。
11.權(quán)利要求10的可植入材料，其中所述材料處于室溫至少約7天。
12.權(quán)利要求10的可植入材料，其中所述材料處于室溫至少約21天。
13.權(quán)利要求10的可植入材料，其中所述材料處于室溫至少約28天。
14.權(quán)利要求11- 13任一項的可植入材料，其中所述細(xì)胞群體作為非早期低溫保存的相似的細(xì)胞群體表達(dá)相同的產(chǎn)物，其中所述產(chǎn)物選自硫酸乙酰肝素、TGF-P、b-FGF和NO。
15.權(quán)利要求14的可植入材料，其中由所述細(xì)胞群體表達(dá)的產(chǎn)物包括至少約I.0微克/IO6個細(xì)胞/天的硫酸乙酰肝素。
16.權(quán)利要求15的可植入材料，其中由所述細(xì)胞群體表達(dá)的產(chǎn)物包括至少約300pg/ml/ 天的 TGF-3。
17.權(quán)利要求16的可植入材料，其中由所述細(xì)胞群體表達(dá)的產(chǎn)物包括不大于約400pg/ml/ 天的 b-FGF。
18.權(quán)利要求11- 14任一項的可植入材料，其中所述細(xì)胞群體的活力是至少約80%。
19.權(quán)利要求11- 14任一項的可植入材料，其中所述材料在低于約37°C的溫度下保存。
20.權(quán)利要求11- 14任一項的可植入材料，其中所述材料在約15 - 25°C的溫度下保存。
21.權(quán)利要求I或10的可植入材料，其中所述細(xì)胞群體不是永生的。
22.權(quán)利要求I的可植入材料，其中所述生物相容性基質(zhì)呈固體、半固體或可流動形式。
23.權(quán)利要求10的可植入材料，其中所述材料保持在冷凍狀態(tài)下放置時的形式和抑制性表型。
24.權(quán)利要求I的可植入材料，其中所述細(xì)胞群體選自內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮樣細(xì)胞、非內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞和前述任一種的功能等同物。
25.—種可植入材料，包含細(xì)胞群體，所述細(xì)胞群體通過細(xì)胞-基質(zhì)相互作用連接到柔性平面的或可流動的生物相容性基質(zhì)，其中所述細(xì)胞群體表現(xiàn)抑制性表型，其中所述抑制性表型選自至少約I. 0微克/IO6個細(xì)胞/天的硫酸乙酰肝素的表達(dá)，至少約300pg/mL/天的TGF-0的表達(dá)，以及不大于約400pg/mL/天的b_FGF的表達(dá),且其中所述可植入材料處于冷凍狀態(tài)。
26.權(quán)利要求I的可植入材料在制備用于治療血管通路失效的材料中的用途。
27.低溫保存的可植入材料，包括 移接有近融合、融合或融合后細(xì)胞群體的生物相容性基質(zhì)；以及 一定體積的低溫保存介質(zhì)，足以維持 基質(zhì)完整性， 至少約80%的細(xì)胞活力，和 抑制性表型，包含至少約1.0微克/IO6個細(xì)胞/天的硫酸乙酰肝素產(chǎn)量、至少約300pg/ml/天的TGF-0 !產(chǎn)量，以及不大于約300pg/ml/天的b_FGF產(chǎn)量，同時低溫保存在不高于約一 4°C的溫度下達(dá)約I個月至I年的長時間。
28.權(quán)利要求27的低溫保存的可植入材料，其中所述材料在約一20°C至約一 160°C的溫度下低溫保存。
29.權(quán)利要求27的低溫保存的可植入材料，其中所述材料在約一80°C至約一 160°C的溫度下低溫保存。
30.權(quán)利要求27的低溫保存的可植入材料，其中所述材料在約一140°C至約一 160°C的溫度下低溫保存。
31.權(quán)利要求27的低溫保存的可植入材料，其中所述材料低溫保存至少約2個月的長時間。
32.權(quán)利要求27的低溫保存的可植入材料，其中所述材料低溫保存至少約6個月的長時間。
33.權(quán)利要求27的低溫保存的可植入材料，其中所述材料低溫保存至少約I年的長時間。
34.權(quán)利要求27的低溫保存的可植入材料，其中所述細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮樣細(xì)胞或其類似物。
35.權(quán)利要求27的低溫保存的可植入材料，其中所述細(xì)胞包括干細(xì)胞。
36.一種生產(chǎn)包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料的方法，所述方法包括步驟 使用適合的試劑和條件用所述細(xì)胞接觸所述生物相容性基質(zhì)；其中所述細(xì)胞具有足夠增殖所述基質(zhì)的數(shù)量，并生長成為融合、近融合或融合后群體，以及進(jìn)一步地，其中所述基質(zhì)用與細(xì)胞類型無關(guān)的、未經(jīng)兼容性測試的、未匹配的細(xì)胞增殖。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法生產(chǎn)的可植入材料在制備用于治療血管通路失效的材料中的用途。
38.一種根據(jù)權(quán)利要求36的方法生產(chǎn)的、包含細(xì)胞和生物相容性基質(zhì)的可植入材料。
39.一種低溫保存組合物，包含移接有融合的、近融合的或融合后的內(nèi)皮細(xì)胞群體的生物相容性基質(zhì)和低溫保存介質(zhì)。
40.權(quán)利要求39的組合物，其中所述低溫保存介質(zhì)包括低溫保存劑、多糖和血清。
41.權(quán)利要求39的組合物，其中所述低溫保存介質(zhì)是CryoStorCS-IO溶液。
42.權(quán)利要求40的組合物，其中所述多糖是葡聚糖。
43.權(quán)利要求40的組合物，其中所述血清是胎兒牛血清(FBS)。
44.權(quán)利要求39的組合物，其中所述生物相容性基質(zhì)是凝膠、泡沫、懸浮液、顆粒、微載體、微囊或纖維結(jié)構(gòu)。
45.權(quán)利要求39的組合物，其是包含顆粒狀生物相容性基質(zhì)的可流動組合物。
46.權(quán)利要求39的組合物，其中所述生物相容性基質(zhì)呈柔性平面形式。
47.權(quán)利要求46的組合物，其中所述柔性平面形式的尺寸是1X4X0.3cm (I. 2cm3)。
48.權(quán)利要求39的組合物，其中所述生物相容性基質(zhì)包括血纖蛋白凝膠、藻酸鹽、聚苯乙烯磺酸鈉微載體、膠原包被的葡聚糖微載體、PLA/PGA和pHEMA/MMA共聚物、膠原或明膠。
49.權(quán)利要求48的組合物，其中所述明膠具有Gelfoam 顆粒、Geifoam 粉末或粉碎的Gelfoam 的形式。
50.權(quán)利要求39的組合物，其中所述細(xì)胞選自近融合的、融合的或融合后的細(xì)胞群體。
51.權(quán)利要求39的組合物，其中所述細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞。
52.權(quán)利要求39的組合物，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
53.權(quán)利要求39的組合物，其中使用鹽水沖洗掉低溫保存溶液。
54.權(quán)利要求39的組合物，其中所述細(xì)胞在培養(yǎng)期間產(chǎn)生合適水平的硫酸乙酰肝素、轉(zhuǎn)化生長因子i (TGF-P1)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
55.權(quán)利要求39的組合物，其容納在冷凍小瓶中。
56.權(quán)利要求39的組合物，其保持在約一4°C至一 160°C的溫度下。
57.權(quán)利要求39的組合物，其保持在約一20°C至一 80°C的溫度下。
全文摘要
公開的是一種包含生物相容性基質(zhì)和細(xì)胞的可植入材料，當(dāng)向血管通路結(jié)構(gòu)提供時，其可以一般地提高功能。例如，本發(fā)明的可植入材料可以增強(qiáng)動靜脈的天然瘺的熟化以及延長所述瘺處于適合于透滲析的成熟的、功能性狀態(tài)。另外，本發(fā)明可以促進(jìn)適合于透滲析的功能性動靜脈移植物的形成，以及促進(jìn)功能性外周旁路移植物的形成。可植入材料可以被配置為柔性平面形式或具有形狀保持性質(zhì)的可流動組合物，適合于在接合點或動靜脈移植物處、鄰近或附近植入。根據(jù)在此公開的方法，向血管的外表面提供所述可植入材料。柔性平面形式的某些實施方式限定了槽隙。本發(fā)明的材料和方法包含細(xì)胞，優(yōu)選內(nèi)皮細(xì)胞或具有內(nèi)皮樣表型的細(xì)胞。
文檔編號C12N5/07GK102743792SQ201210246619
公開日2012年10月24日 申請日期2006年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月21日
發(fā)明者史蒂夫·博林杰, 埃拉扎爾·埃德爾曼, 斯科特·埃珀利, 海倫·瑪麗·紐金特, 阿努帕姆·達(dá)拉爾 申請人:滲透治療有限公司