專利名稱：一種深海細菌胞外多糖的制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種深海細菌胞外多糖的制備方法與應用，屬于生物技術技術領域。
背景技術：
現代科學技術的飛速發展和廣泛應用給化妝品行業帶來了全新的發展機遇，化妝品已從潔膚、潤膚為目的的基礎護膚品向延緩衰老、美化膚色為目的的功效型化妝品方向發展，化妝品的研發已經歷了化學美容、植物美容，正向著生物美容和基因美容的目標發展。生物活性多糖作為功效性化妝品添加劑在化妝品中的應用，是生物美容的一個重要方向，可產生保濕、延緩衰老、促進上皮纖維成細胞增殖和美化膚色等多種功能，為功效性化妝品的開發注入新的活力。細菌胞外多糖優良的的生物學活性和理化性質為其在化妝品中的應用提供了基礎，將各種細菌胞外多糖應用于化妝品中，能產生保濕、穩定、改善膚色、抗衰老和抗菌等功能，且高分子多糖無毒副作用，與常用化妝品成分配伍性好。因此，細菌胞 外多糖作為功效型化妝品添加劑將有著廣闊的前景。由于年齡的增長和外界環境的影響，皮膚的保濕機構受到損傷，皮膚組織細胞和細胞間的水分含量減少，導致細胞排列緊密，膠原蛋白失水硬化，當角質層中水分降到10%以下時，皮膚就會顯得干燥、失去彈性、起皺，加速皮膚老化。因此，水分對皮膚健康至關重要，保水保濕一直是護膚化妝品最主要的研究課題之一。保濕劑按來源可分為天然保濕劑和合成保濕劑兩種。目前在化妝品中最常用的是合成保濕甘油、丙二醇、山梨醇等，均吸濕性能顯著、保濕性能一般，作為保濕產品還存在一定不足。多糖具有營養和保濕雙重功能，作為功效性添加劑在化妝品中應用，符合保濕劑的發展方向和市場需要。另一方面，皮膚的衰老是一個復雜的生理過程，“自由基學說”認為，過氧化作用是造成人體皮膚衰老的根本原因，而過氧化作用主要是因為氧自由基引起的。氧自由基氧化能力極強，一個自由基往往能產生許多其他的自由基，從而增大破壞作用，導致皮膚衰老、色斑、皺紋和皮膚疾病。因此，清除氧自由基，即抗氧化是延緩衰老最有效的辦法。多糖的抗氧化作用已有較多的研究報道，抗氧化作用機理尚未有明確的解釋，但研究發現，多糖衍生物中隨著取代度的增力口，即糖環上游離羥基數目減少，多糖衍生物捕獲或猝滅自由基的能力降低，這表明，多糖結構中的還原性羥基可捕捉脂質過氧化鏈式反應中產生的活性氧，減少脂質過氧化反應鏈長度，因此，可阻斷或減緩脂質過氧化的進行，起到抗氧化的作用。也有研究認為，多糖環上的羥基可與產生羥自由基等所必需的金屬離子(Fe2+、Cu2+等)絡合，使其不能產生啟動脂質過氧化的羥基自由基或使其不能分解脂質過氧化產生的脂過氧化氫，從而抑制活性氧的產生海洋是生命資源的寶庫，地球上80%的生物存在于海洋，資源總量巨大。海洋微生物因其獨特的生活環境，分泌的胞外多糖具有特殊結構，預示著可能在化妝品領域中將有新的潛在用途。然而，對于海洋微生物分泌的胞外多糖國內外已經有一些研究，但總體來看開發利用程度仍然很低，尤其在化妝品領域還沒有商品化的海洋細菌胞外多糖。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種深海細菌胞外多糖的制備方法與應用。一種深海細菌胞外多糖的制備方法，步驟如下(I)將深海細菌(Zunongwangia profunda)SM_A87菌株接種于液20°C條件下震蕩培養2 3天，然后按3 5% (v/v)的接種量接種于發酵培養基，在15 20°C、溶解氧飽和度高于30%的條件下，培養20 30h，然后調整發酵溫度為8 12°C，繼續培養8 10天，在繼續培養期間補加乳糖溶液，制得發酵液；(2)向步驟(I)制得發酵液中加入I. 5 3倍體積的無水乙醇醇沉，分離取沉淀，無水乙醇洗滌、烘干，制得粗多糖；(3)將步驟(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量體積百分比為0. 5 1%的溶液，單位為g/L ;加入堿性蛋白酶使溶液中堿性蛋白酶的濃度為5 10U/mL，在45 50°C、 180 200rpm的條件下，酶解5 6h ;再加入I. 5 3倍體積的無水乙醇醇沉,分離取沉淀，無水乙醇洗滌、烘干，制得深海細菌胞外多糖。上述步驟(I)中所述深海細菌(Zunongwangia profunda) SM-A87菌株購自中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢市武昌珞珈山武漢大學，菌種保藏號CCTCCN0:AB206139To根據本發明優選的,所述步驟(I)中的深海細菌(Zunongwangia profunda)SM_A87菌株是在溫度為15 20°C條件下，于固體培養基活化培養2. 5 3天后制得的。根據本發明進一步優選的，上述固體培養基組分如下，均為重量份蛋白胨0. 8 I. 0份，酵母粉0. 5 0. 75份、瓊脂I. 0 I. 5份，人工海水100份，pH 為 7. 5 8. 0 ;根據本發明優選的，所述步驟(I)中的液體種子培養基組分如下，均為重量份蛋白胨0.8 1.0份，酵母粉0.5 0.75份，人工海水100份，pH為7. 5 8. O。根據本發明優選的，所述步驟(I)中的發酵培養基組分如下，均為重量份蛋白胨0. 887份，酵母粉0. 5份，乳糖3. 221份，人工海水100份，pH為8. O。根據本發明優選的，所述步驟(I)中補加的乳糖溶液濃度為200g/L，由人工海水和乳糖配制獲得，每次補料的量為發酵培養基體積的10%。根據本發明優選的，所述步驟(I)中的補加乳糖溶液的次數為兩次，補加乳糖溶液的時間為繼續培養的第3天和第5天。根據本發明優選的，所述步驟(2)和步驟(3)中的醇沉，溫度為3 6°C，時間為20 40min。根據本發明優選的，所述步驟(2)和步驟(3)中的烘干，溫度為55 60°C，時間為24 30h。上述深海細菌胞外多糖做為吸濕、保濕和/或抗氧化成分在制備化妝品中的應用。有益效果I、通過本發明所述制備方法獲得的深海細菌SM-A87菌株發酵液中，胞外多糖含量為11. 4g/L，遠高于現有發酵方法獲得的產量；2、通過本方法制得的胞外多糖，在相對濕度為43%和81%的條件下，吸濕率分別為12. 5±0. 5%和28. 8±2% ;在硅膠環境中，胞外多糖保濕率為73. 2±0. 5%，具有良好的吸濕、保濕效果；3、通過本方法制得的胞外多糖具有良好的清除自由基的能力，在濃度為10. Omg/mL的條件下，對有機自由基1，I-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH* )、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率分別達到48. 5±1. 5%,58. 7±0. 8%和27. 2±0. 6%。


圖I、發酵時間與發酵液粘度、深海細菌胞外多糖產量和菌體濃度關系的曲線圖；圖2、在相對濕度為43%的條件下，深海細菌胞外多糖、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉和甘油的吸濕率曲線圖；圖3、在相對濕度為81%的條件下，深海細菌胞外多糖、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉和甘油的吸濕率曲線圖； 圖4、深海細菌胞外多糖、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉和甘油保濕率的曲線圖。圖5、深海細菌胞外多糖、透明質酸和維生素C對有機自由基DPPH 的清除作用的曲線圖；圖6、深海細菌胞外多糖、透明質酸和維生素C對羥自由基的清除作用的曲線圖；圖7、深海細菌胞外多糖、透明質酸和維生素C對超氧陰離子自由基的清除作用的曲線圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的技術方案作進一步說明，但本發明所保護范圍不限于此。實施例中所述深海細菌(Zunongwangia profunda)SM_A87菌株購自中國典型培養物保藏中心，地址中國武漢市武昌珞珈山武漢大學，菌種保藏號CCTCC N0:AB206139To堿性蛋白酶購自丹麥諾維信公司；人工海水為購自美國Sigma公司的海鹽按照產品說明書進行配制獲得；透明質酸購自山東福瑞達生物醫藥有限公司公司、殼聚糖購自蘇州亞科化學試劑有限公司、海藻酸鈉購自天津大茂化學試劑廠、甘油購自天津市登科化學試劑有限公司、維生素C購自美國Sigma公司、DPPH購自美國Sigma公司、鄰苯三酚購自天津市科密歐化學試劑有限公司，其他試劑均為普通市售產品。培養基的配制原料均為本領域常用原料，可市場購得。實施例I :一種深海細菌胞外多糖的制備方法，步驟如下(I)將購買的深海細菌(Zunongwangia profunda) SM-A87菌株劃線接種于固體培養基，在20°C條件下活化培養3天，然后接種于IOOmL液體種子培養基中，在20°C、200rpm的條件下震蕩培養2天，然后按5%( v/v)的接種量接種于5L發酵培養基中，在20°C、溶解氧飽和度8(Tl00%的條件下，培養24h，然后調整發酵溫度為10°C，繼續培養9天，并在繼續培養的第3天和第5天分別補加由乳糖和人工海水配制的濃度為200g/L的乳糖溶液500mL，制得發酵液；上述固體培養基組分如下，均為重量份
蛋白胨I份，酵母粉0. 5份、I. 5份瓊脂，人工海水100份，pH為7. 5 8. 0 ;所述步驟(I)中的液體種子培養基組分如下，均為重量份蛋白胨I份，酵母粉0. 5份，人工海水100份，pH為7. 5 8. 0 ;所述步驟(I)中的發酵培養基組分如下，均為重量份蛋白胨0.887份，酵母粉0.5份，乳糖3. 221份，人工海水100份，pH為8. 0 ;(2)向步驟(I)制得發酵液中加入2倍體積的無水乙醇，在4°C條件下醇沉30min，IOOOOrpm離心IOmin,取沉淀,無水乙醇洗漆、60°C烘干24h,制得粗多糖；(3)將步驟(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量體積百分比為1%的溶液，單位為g/L ;加入堿性蛋白酶使溶液中堿性蛋白酶的濃度為5U/mL的堿性蛋白酶，在50°C、200rpm 的條件下，酶解5h ;再加入2倍體積的無水乙醇，在4°C條件下醇沉30min，IOOOOrpm離心IOmin,取沉淀，無水乙醇洗滌、60 V烘干24h，制得深海細菌胞外多糖。實施例2 :深海細菌胞外多糖的吸濕、保濕性能測定深海細菌胞外多糖的吸濕性能測定具體方法為 將飽和硫酸銨溶液和飽和碳酸鉀溶液分別置于2個干燥器(直徑300mm)內，存放于25°C的恒溫箱中，制成相對濕度分別為81%和43%的環境。將深海細菌胞外多糖、透明質酸、殼寡糖和海藻酸鈉粉碎至80目，和甘油一起置真空干燥器中，以P2O5為干燥劑，40°C下干燥至恒重。分別精確稱取0. 5000g (精確到0. OOOlg)的深海細菌胞外多糖、透明質酸、殼寡糖和海藻酸鈉各兩份，分別放入25 X 25mm的稱量瓶中，然后分別放入相對濕度為81%和43%的干燥器內進行吸濕實驗。于3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h將稱量瓶取出稱重，由測定前后試樣的質量差計算吸濕率，求出各樣品在不同時間下的吸濕率吸濕率=(Wn— W。)/ W0X 100%，其中為干燥樣品質量，Wn為放置一定時間后樣品質量。結果如圖2所示，在相對濕度為43%的環境中，隨時間的增加幾種多糖樣品和甘油的吸濕率逐漸增加，在72h時，各樣品的吸濕性大小順序為甘油>透明質酸>深海細菌胞外多糖>海藻酸鈉>殼聚糖。同時，從圖2可以看出，濕度愈大，樣品的吸濕率愈大。最終，在放置72h、相對濕度為43%時，深海細菌胞外多糖的吸濕率為12. 5±0. 5%。結果如圖3所示，在相對濕度為81%的環境中，隨時間的增加幾種多糖樣品和甘油的吸濕率逐漸增加，在72h時，各樣品的吸濕性大小順序為甘油>透明質酸>深海細菌胞外多糖>海藻酸鈉>殼聚糖。同時，從圖3可以看出，濕度愈大，樣品的吸濕率愈大。最終，在放置72h、相對濕度為43%和81%時，深海細菌胞外多糖的吸濕率為28. 8±2%。在幾種多糖樣品中，透明質酸為目前公認的最佳吸濕保濕天然物質，吸濕率最高，而深海細菌胞外多糖的吸濕率僅次于透明質酸，具有很好的吸濕效果。深海細菌胞外多糖的保濕性能測定具體方法為將在相對濕度43%環境中吸濕達到平衡的樣品取出，放入裝有變色硅膠的干燥器(直徑300mm)中，置于25°C的恒溫箱中。于311、611、1211、2411、3611、4811、6011、7211將稱量瓶取出稱重。由測定前后試樣的質量
差計算保濕率
保濕率=Hn/HQX 100%,其中 為試樣最初含水質量，Hn為放置一段時間后試樣含水質量。在硅膠環境中各樣品的保濕率如圖4所示，幾種多糖與甘油的保濕率大小順序為殼聚糖>透明質酸>海藻酸鈉>深海細菌胞外多糖>甘油。其中甘油的保濕率下降速率遠大于其他多糖，在放置72h后保濕率為50. 3±0. 9%說明甘油雖然具有較好的吸濕性，但保濕性較差；幾種多糖的保濕率非常接近，在放置72h后保濕率能維持在73-77%之間，其中深海細菌胞外多糖保濕率為73. 2±0. 5%，明顯優于甘油，顯示出較好的保濕效果。因此由以上結果可知，深海細菌胞外多糖具有較好的保濕效果，在化妝品領域有很好的應用前景。實施例3 深海細菌胞外多糖的抗氧化性能測定，具體方法如下
I.對有機自由基(DPPH )的清除作用將深海細菌胞外多糖去離子水配成0. 1、0. 25,0. 5、I. 0,2. 0,3. 0,5. 0,7. 5和10. Omg/mL的溶液作為樣品組。維生素C和透明質酸用去離子水配成相同濃度的溶液作為對照組。DPPH用少量無水乙醇溶解，再用50%的乙醇配成濃度100 U M的溶液。取2mL的DPPH溶液加入IOmL離心管中，再加入ImL樣品溶液，充分混勻，室溫避光反應40min，在525nm處測定吸光度Ai。以ImL去離子水代替樣品作為空白對照管，以2mL50%乙醇代替DPPH溶液加入ImL不同濃度的多糖作為樣品參比管，并以等體積去離子水和50%乙醇混合液空白調零，按照同樣的方法測定525nm波長下的吸光值，樣品對DPPH 的清除作用計算公式清除率=[1— (Ai — AjO/A0] X 100%,其中-Ai為樣品管的吸光值*為樣品參比管的吸光值-A為空白對照管的吸光值。結果如圖5所示。維生素C對DPPH 有很強的清除作用在濃度為0. 5mg/mL時基本就可以完全清除反應體系中的DPPH ;深海細菌胞外多糖在所選的濃度范圍內對DPPH 有一定的清除作用，其清除能力隨著多糖加入量的增加，清除率上升，在濃度為10. Omg/mL時清除率達到48. 5±1. 5%。對照組透明質酸對DPPH 的清除效果較差，清除率最高為I. 7±0. 3%。這說明了深海細菌胞外多糖在高濃度時具有較好的DPPH 清除能力。2.對羥自由基( OH)的清除作用將深海細菌胞外多糖去離子水配成0. 1、0. 25,0. 5、I. 0,2. 0,3. 0,5. 0,7. 5和10. Omg/mL的溶液作為樣品組。維生素C和透明質酸用去離子水配成相同濃度的溶液作為對照組。IOmL離心管中加入lmL9mM的FeS04、lmL9mM的水楊酸-乙醇溶液,不同濃度的樣品lmL，最后加lmL8. 8mM的H2O2啟動反應，37°C反應0. 5h，以去離子水為參比，在510nm下測定各濃度的吸光度。用去離子水代替樣品作為空白對照，考慮到樣品本身的吸光值，以lmL9mM的FeS04、lmL9mM水楊酸-乙醇溶液，不同濃度的樣品溶液ImL和ImL去離子水作為樣品的本底吸收值，樣品對 OH的清除作用計算公式 OH 清除率=[I — (Bi — Bj) /B0] X 100%，
其中取為樣品管的吸光值；Bj為樣品的本底吸光值成為空白對照管的吸光值。結果如圖6所示。結果顯示，深海細菌胞外多糖對 OH的清除效果與一定范圍的多糖濃度呈現正相關，在濃度為10. Omg/mL時清除率達到58. 7±0. 8%。然而，維生素C的清除活性明顯高于多糖樣品，在濃度為0. 5mg/mL時，其清除活性即達到100%。而對照組透明質酸的清除作用較弱，在濃度10. Omg/mL時清除率只有15. 2±0. 2%，只有深海細菌胞外多糖的1/4左右。因此，結果表明胞外多糖具有較高的 OH清除活性。3.對超氧陰離子自由基(02_ )的清除將深海細菌胞外多糖去離子水配成0. 1、0. 25,0. 5、I. 0,2. 0,3. 0,5. 0,7. 5和10. Omg/mL的溶液作為樣品組。維生素C和透明質酸用去離子水配成相同濃度的溶液作為 對照組。取50mM、pH8. 2的Tris-HCl緩沖液4. 5mL，置25°C水浴中保溫20min，分別加入ImL樣品溶液和0. 4mL25mM的鄰苯三酚溶液(用IOmM的HCl配制)，混勻后于25°C水浴中反應5min,加入lmL8mM的HCl終止反應，于320nm處測定吸光度，用IOmM的HCl代替鄰苯三酚溶液作為樣品的本底吸收，空白對照組以相同體積去離子水代替樣品，每個試樣做3個平行，取平均值，樣品對O2- 的清除作用計算公式O2 清除率=[I — (Ci — Cj)/C0] X 100%,其中Ci為樣品管的吸光值；Cj為樣品的本底吸光值Kci為空白對照管的吸光值。結果如圖7所示。由圖可知，隨著深海細菌胞外多糖濃度的增加，對O2- 的清除活性逐漸升高，但總體能力稍弱，在濃度為10. Omg/mL時清除率為27. 2±0. 6% ;維生素C對02_ 清除作用很強，在濃度為I. Omg/mL時已能完全清除反應體系中的02_ ;透明質酸也有較弱的02_ 清除能力，清除能力最高達到15. 2±0. 2%。因此，結果表明胞外多糖具有一定的02_ 清除活性。
權利要求
1.ー種深海細菌胞外多糖的制備方法，步驟如下 (1)將深海細菌(Zunongwangiaprofunda) SM-A87菌株接種于液體種子培養基，在15 20°C條件下震蕩培養2 3天，然后按3 5% (v/v)的接種量接種于發酵培養基，在15 20°C、溶解氧飽和度高于30%的條件下，培養20 30h，然后調整發酵溫度為8 12°C，繼續培養8 10天，在繼續培養期間補加乳糖溶液，制得發酵液； (2)向步驟(I)制得發酵液中加入I.5 3倍體積的無水こ醇醇沉，分離取沉淀，無水こ醇洗滌、烘干，制得粗多糖； (3)將步驟(3)制得的粗多糖溶于水中，配成重量體積百分比為O.5 1%的溶液，単位為g/L ;加入堿性蛋白酶使溶液中堿性蛋白酶的濃度為5 10U/mL的堿性蛋白酶，在45 50°C、180 200rpm的條件下,酶解5 6h ;再加入I. 5 3倍體積的無水こ醇醇沉,分離取沉淀，無水こ醇洗滌、烘干，制得深海細菌胞外多糖。
2.如權利要求I所述的制備方法，其特征在干，所述步驟(I)中的深海細菌(Zunongwangia profunda)SM_A87菌株是在溫度為15 20°C條件下,于固體培養基活化培養2. 5 3天后制得的。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在干，所述固體培養基組分如下，均為重量份 蛋白胨O. 8 I. O份，酵母粉O. 5 O. 75份、瓊脂I. O I. 5份，人工海水100份，pH為 7. 5 8. O。
4.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的液體種子培養基組分如下，均為重量份 蛋白胨O. 8 I. O份，酵母粉O. 5 O. 75份，人工海水100份，pH為7. 5 8. O。
5.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的發酵培養基組分如下，均為重量份 蛋白胨O. 887份，酵母粉O. 5份，乳糖3. 221份，人工海水100份，pH為8. O。
6.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中補加的乳糖溶液濃度為200g/L，由人工海水和乳糖配制獲得，每次補料的量為發酵培養基體積的10%。
7.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中的補加乳糖溶液的次數為兩次，補加乳糖溶液的時間為繼續培養的第3天和第5天。
8.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)和步驟(3)中的醇沉，溫度為3 6°C，時間為20 40min。
9.如權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)和步驟(3)中的烘干，溫度為55 60°C，時間為24 30h。
10.權利要求I所述深海細菌胞外多糖做為吸濕、保濕和/或抗氧化成分在制備化妝品中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種深海細菌胞外多糖的制備方法與應用，制備方法如下(1)將深海細菌SM-A87菌株接種于液體種子培養基，震蕩培養2～3天，然后接種于發酵培養基，培養20～30h，然后調整發酵溫度，繼續培養8～10天，制得發酵液；(2)向發酵液中加入無水乙醇醇沉，分離取沉淀，無水乙醇洗滌、烘干，制得粗多糖；(3)將粗多糖溶于水中，加入堿性蛋白酶，酶解5～6h；再加入無水乙醇醇沉，分離取沉淀，無水乙醇洗滌、烘干，制得深海細菌胞外多糖。本發明制得的深海細菌胞外多糖具有很好的吸濕保濕性能和抗氧化性能，在化妝品領域中有很好的應用潛力。
文檔編號C12R1/01GK102732583SQ201210251238
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月19日 優先權日2012年7月19日
發明者劉升波, 周百成, 宋曉妍, 張熙穎, 張玉忠, 石梅, 秦啟龍, 蘇海楠, 解彬彬, 陳秀蘭, 高翔 申請人:山東大學