專利名稱：防治植物青枯病和根腫病的生防制劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物病害防治領域，尤其涉及一種防治植物青枯病和根腫病的生防制劑及其制備方法和應用。
背景技術：
作物細菌性青枯病是由青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一種系統侵染的毀滅性土傳病害，俗稱“植物瘟病”。青枯勞爾氏菌寄主廣泛，可侵染44個科的數 百種植物。目前，細菌性青枯病的防治是世界公認的一大難題，它廣泛分布于世界各地，在我國南方省市發生嚴重，尤其在浙江，近年來不但茄科、瓜類受害，大面積發生的桑青枯病更對蠶業生產造成嚴重損失。我國從20世紀90年代開始進行青枯病的生物防治制劑研究，何禮遠和康耀衛等利用青枯菌無毒菌株和熒光假單胞菌誘導花生產生抗病性(何禮遠，康耀衛.利用青枯菌無毒菌株和突光假單胞菌誘導花生產生抗病性.植物保護學報，1990,17 (2) :113-116),楊合同等利用芽孢桿菌防治生姜青枯病取得了較好的效果(楊合同，龐定遠，任欣正.姜瘟病生物防治試驗初報.山東科學，1990，3 (4) :42-46)。但國內外現有生防制劑均為單一的活菌體，只針對某一生化型。而Hayward根據青枯菌對乳糖、麥芽糖、纖維二糖和甘露醇、甜醇、山梨醇氧化能力的差異，把青枯菌區分為4個生化型，華靜月和何禮遠認為還存在生化型V(華靜月，何禮遠.我國植物青枯菌的生化型和其它生理差異.植物保護學報，1984，11(1) :43-50)。青枯菌的生化型多樣性給病害防治增加了很大的難度。十字花科作物是我國最重要的油料和蔬菜作物，種植面積3. 75億畝，其中油菜面積I. 02億畝，十字花科蔬菜2. 73億畝。根腫病是十字花科作物上重要的土傳病害，由蕓苔根腫菌(Plasmodiophora brassicae)侵染所致,危害面積約6000萬畝,平均產量損失達20% 30%，嚴重田塊產量損失達60%以上，甚至絕收，每年導致油菜經濟損失約10億元、蔬菜經濟損失約200億，極大地制約了油料和蔬菜產業的持續穩定發展及農民增收。但對于根腫病的防治，尚缺乏高效、低毒、低殘留、低成本的化學藥劑；在農業防治方面，研究不夠全面系統，存在不少弊端。蘇婷等從不同生態環境的植物根際土壤中篩選獲得一株能防治多個青枯病生化型、防效穩定、具有商品競爭力的生防菌(蘇婷，路梅，周青，等.抗不同生化型青枯菌的生防菌篩選鑒定及其活性分析.植物保護學報，2010，37 (5) =431-435)，探討進一步提高該菌株對植物青枯病的生防效果，對其規模化生產應用具有重要意義。同時，探討該生防菌對其它植物病害的防治有利于該菌株的推廣應用。

發明內容
本發明提供了一種生防制劑的制備方法，利用解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008在適宜的發酵培養基和發酵培養條件下通過微生物發酵制備生防制劑，工藝簡單，菌體生長代謝旺盛，產拮抗物質較多。
—種生防制劑的制備方法，包括將經活化的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamy I ο I i quef ac i ens) Z JUB2008 接種到培養液中，于 25_45°C 發酵培養 6_120h。所述的解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008已保藏，保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2009年7月13日，保藏編號為CCTCC NO M209145。蘇婷等公開了該菌株的篩選和鑒定，該菌株為從浙江省杭州市、海南省儋州市、云南省思茅地區鎮源縣、河南省南陽市臥龍區等不同生態環境的植物根際土壤中分離并篩選得到的，經鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌，對不同生化型的青枯菌均具有一定的防治效果(蘇婷，路梅，周青，等.抗不同生化型青枯菌的生防菌篩選鑒定及其活性分析.植物保護學報，2010，37 (5) :431-435)。以體積IL計，所述的培養液含有以下組分蛋白胨3_15g，牛肉浸膏0_3g，葡萄糖0_5g，酵母粉0-5g，NaCl 0_8g，余量為水；培養液的pH為5. 5-9. O。 優選地，以體積IL計，所述的培養液含有以下組分蛋白胨10_15g，牛肉浸膏l_3g，葡萄糖Ο-lg，酵母粉0-3g，NaCl 6_8g，余量為水；培養液的pH為7. 5-8. O。更優選地，以體積IL計，所述的培養液含有以下組分蛋白胨10g，牛肉浸膏lg，酵母粉lg，NaCl 8g，余量為水；培養液的pH為7. 5。不同配方的培養液對微生物的生長、代謝有較大影響，使用常規LB培養基，該菌株能生長，但采用本發明提供的培養液用于解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008的發酵培養，更有利于抑菌物質的產出。蛋白胨作為主要碳源已能滿足菌株生長所需，葡萄糖作為培養基中的另一種碳源，濃度過高反而會使微生物過度生長，影響代謝和次級代謝產物的生成；芽孢桿菌生長時需要含氮物質，特別是需要蛋白質原料和游離氨基酸的參與代謝才能進行(林同香，林益，林尾妹.蘇云金桿菌和培養基氨基酸的比較分析.福建農業大學學報，1995,24(1) 45-48);牛肉浸膏不僅是重要的氮源，而且含有多肽、氨基酸、有機酸、糖類、礦物質營養和維生素等，其含量變化能大大影響發酵液的抑菌活性；酵母粉作為另一種氮源，少量的酵母粉可以豐富氮源來源，但過量的酵母粉會影響菌株對蛋白胨和牛肉浸膏中氮元素的吸收利用；NaCl作為無機鹽，高于常規LB培養基的濃度能促進菌株產生更多的抑菌物質。所述的接種可以為將解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008接種到種子培養液中，培養獲得濃度為108-109CFU/ml的種子液，將種子液接種到所述的培養液中，接種量以體積百分比濃度計優選為O. 1-15%，更優選為1_3%，最優選為3%。搖瓶中裝液量不同會影響發酵時的通氣量。為了提供充足的通氣量，同時保證一定的菌體培養量，以體積百分比濃度計，所述的培養液在搖瓶中的裝液量優選為10-80% ；更優選為60-70% ;最優選為70%。所述的發酵培養溫度優選為35-40°C;更優選為35°C，該溫度下最利于菌體的生長和代謝。所述的發酵培養時間優選為24_48h ;更優選為24h。該培養時間下，菌體生物量較
大，且抑菌物質分泌較多；發酵時間過長，不但抑菌物質無顯著增加，而且還會影響生產效.、
Mo所述的培養液接種后，可以置于搖床中發酵培養，搖床轉速為150_180r/min ;優選為160r/min,這樣更有利于菌體的分散和生長。本發明提供了一種采用上述制備方法制得的生防制劑，該生防制劑含有較高濃度的抑菌物質，可以直接用于澆灌植物，對不同生化型的青枯菌和根腫菌均有較好的防效。本發明還提供了所述的生防制劑在防治植物青枯病中的應用。試驗證明，該生防制劑用于植物青枯病的防治，取得了比已公開文獻更好的效果，防治效果達88%，根莖鮮重比也從O. 11上升至O. 14，且優于目前常用的青枯病防治藥劑。優選地，所述的植物為番茄、茄子、馬鈴薯或生姜，青枯勞爾氏菌常常侵染這些植物，引發青枯病；更優選地，所述的植物為番茄。本發明還提供了所述的生防制劑在防治植物根腫病中的應用。試驗證明，該生防制劑對十字花科植物的根腫病也有良好的防治效果，用于根腫病的防治，能顯著降低根腫病的病情嚴重度(病情指數為40%)，促進植物的增產效果(達到92%)，優于目前常用的根腫病防治藥劑。優選地，所述的植物為十字花科植物；更優選地，所述的植物為大白菜、小白菜、甘藍、蘿卜、薺菜、花椰菜或油菜，蕓苔根腫菌常常侵染這些植物，引發根腫病；最優選地，所述的植物為大白菜。本發明利用解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008在適宜的發酵培養基和發酵培養條件下制備獲得防治植物青枯病、根腫病的生防制劑，具有如下有益效果(I)培養基原料來源廣泛，發酵培養工藝簡單，操作方便；(2)所制得的生防制劑對青枯菌的抑菌圈直徑達到21. 75mm,抑菌效果優于使用常規LB培養基和常規細菌發酵培養條件所制得的生防制劑；用于澆灌被青枯菌侵染的植株，能顯著降低植株青枯病的病害發生率和病情嚴重度；對不同生化型青枯病均有較好防效，防效穩定，適合規模化生產；(3)用于澆灌被根腫菌侵染的植株，能顯著降低植株根腫病的病情嚴重度，延緩根腫病的發生，顯著促進植株的增產效果；防效穩定，適合規模化生產。


圖I為實施例3中不同初始pH對解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008抑菌活性和菌體生長量的影響；圖2為實施例4中不同裝液量對解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008抑菌活性和菌體生長量的影響；圖3為實施例5中不同接種量對解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008抑菌活性和菌體生長量的影響；圖4為實施例6中不同溫度對解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008抑菌活性和菌體生長量的影響；圖5為實施例7中不同發酵時間對解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008抑菌活性和菌體生長量的影響；圖6為實施例8中不同處理下番茄青枯病的病害發生情況；圖7為實施例8中不同處理下番茄青枯病的病情嚴重度。
具體實施例方式實施例I制備種子液用三區劃線法將保藏的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、ZJUB2008(保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M209145)在NA瓊脂平板上劃線，置于30°C下培養24h ;將解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008單菌落接到LB液體培養基中，于30°C，160r/min的搖床中振蕩培養12h，制成種子液，種子液中菌體濃度為IO8CFU/ml ο實施例2發酵培養基的優化選擇蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、酵母粉、NaCl 5個培養基組分因素，每個因素設定4個水平。采用L16 (45)正交表，隨機安排因素和配比水平(見表I)。按正交試驗設計表(見表3)分別配置培養基，pH 7. O左右；滅菌后，向培養基中接入實施例I制得的解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008種子液，接種量為O. 5% (v/v);于30°C，160r/min搖床振蕩培養24h。每個處理設3個重復。采用瓊脂擴散法測定抑菌活性將發酵液加入含有青枯菌的瓊脂平板中，于30°C溫箱培養48h后，測量各處理的抑菌圈直徑。結果顯示，培養基各組成成分蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖、酵母粉、NaCl對解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008發酵液的抑菌活性都有影響，影響大小主次排列為葡萄糖>牛肉浸膏>蛋白胨> NaCl >酵母粉。當葡萄糖濃度較低，牛肉浸膏、蛋白胨或NaCl濃度較高時，解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008發酵液的抑菌活性較強；酵母粉濃度對解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008發酵液的抑菌活性無顯著影響(見表2)。解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008利用10號、9號、14號培養基發酵時，其發酵液的抑菌活性最強，抑菌圈平均直徑分別達到20. 67mm、20. 23mm、20. 13mm。10號培養基為最佳配方，其組成編號為A3B2C4D3E1,即每升培養液中蛋白胨10g、牛肉浸膏lg、葡萄糖0g、酵母粉lg、 NaC18g (見表 3)。表IL16 (45)正交試驗因素水平表

權利要求
1.一種生防制劑的制備方法，包括將經活化的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamy I ο I i quef ac i ens) Z JUB2008 接種到培養液中，于 25_45°C 發酵培養 6_120h ； 其中，所述解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008的保藏號為CCTCCNO M209145 ； 以體積IL計，所述的培養液含有以下組分蛋白胨3-15g，牛肉浸膏0-3g，葡萄糖0_5g，酵母粉0-5g，NaCl 0_8g，余量為水；培養液的pH為5. 5-9. O。
2.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于，以體積IL計，所述的培養液含有以下組分蛋白胨10_15g，牛肉浸膏l_3g，葡萄糖Ο-lg，酵母粉0-3g，NaCl 6_8g，余量為水；培養液的pH為7. 5-8.0。
3.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述的接種為將解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008接種到種子培養液中，培養獲得濃度為108-109CFU/ml的種子液，將種子液接種到所述的培養液中，接種量以體積百分比濃度計為1_3%。
4.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述的發酵培養溫度為35-40°C。
5.根據權利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述的發酵培養時間為24-48h。
6.一種采用如權利要求1-5任一所述的制備方法制得的生防制劑。
7.如權利要求6所述的生防制劑在防治植物青枯病中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的植物為番茄、茄子、馬鈴薯或生姜。
9.如權利要求6所述的生防制劑在防治植物根腫病中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的植物為十字花科植物。
全文摘要
本發明公開了一種防治植物青枯病和根腫病的生防制劑及其制備方法和應用。該生防制劑的制備方法包括將經活化的解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008接種到培養液中，于25-45℃發酵培養6-120h；其中，以體積1L計，所述的培養液含有以下組分蛋白胨3-15g，牛肉浸膏0-3g，葡萄糖0-5g，酵母粉0-5g，NaCl 0-8g，余量為水；培養液的pH為5.5-9.0。本發明利用解淀粉芽孢桿菌ZJUB2008在適宜發酵培養基和培養條件下通過微生物發酵制備生防制劑，所制得的生防制劑對不同生化型的青枯菌和根腫菌均有較好防效，能顯著降低青枯病和根腫病的病害發生率和病情嚴重度，適合規模化生產。
文檔編號C12R1/07GK102757917SQ20121025482
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月20日 優先權日2011年12月28日
發明者劉寶平, 周青, 朱勃, 李斌, 蘇婷, 謝關林 申請人:浙江大學