一種花生青枯病菌巢式pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種花生青枯病菌的巢式PCR檢測方法，以樣品DNA為模板，利用細(xì)菌16S-23SrDNAITS序列通用引物L(fēng)1/L2進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，通過設(shè)計的一對鑒別花生青枯病菌的特異性引物W1/W2，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，如果出現(xiàn)374bp的特異條帶，則確定所檢測的病原菌為花生青枯病菌。本發(fā)明的花生青枯病菌巢式PCR檢測方法，對病菌基因組DNA的檢測靈敏度為10fg，且能克服生物學(xué)鑒定、酶聯(lián)免疫技術(shù)和常規(guī)PCR等方法的缺點(diǎn)，提供了一種快速、靈敏、特異的花生青枯病菌檢測方法，可用于田間花生青枯病菌的早期診斷，對該病害的早期檢測和及時防治具有十分重要的意義。
【專利說明】—種花生青枯病菌巢式PCR檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種花生青枯病菌巢式PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]花生青枯病是由SoJaflacearw引起的一種細(xì)菌性維管束病害。該病害于1905年在印度尼西亞首次報道，隨后在20多個國家和地區(qū)相繼發(fā)生或出現(xiàn)報道。目前，主要以中國、印度尼西亞和越南危害較重。我國關(guān)于花生青枯病的報道始見于30年代后期，現(xiàn)在主要分布于中部和南方地區(qū)，每年全國實(shí)際病地面積在40萬hm2以上，受危害程度居世界首位。花生青枯病發(fā)病率一般在10% - 30%左右，減產(chǎn)20%以上；重病區(qū)發(fā)病率可在50%以上，甚至導(dǎo)致完全絕收。近年來有報道顯示，花生青枯病表現(xiàn)出向北蔓延的趨勢，給花生生產(chǎn)帶來更大威脅。除引起減產(chǎn)外，青枯病的發(fā)生還會降低花生品質(zhì)，并增加黃曲霉毒素的污染。同時，花生青枯病是一種土傳病害，可經(jīng)雨水、土壤、病殘體等從發(fā)病區(qū)向未發(fā)病區(qū)傳播，且其侵染能力強(qiáng)，在較短的時間內(nèi)可造成植株枯萎死亡。隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的高度集約化生產(chǎn)，復(fù)種指數(shù)高，品種單一，導(dǎo)致該類病害的發(fā)生越來越嚴(yán)重。因此，開展花生青枯病菌的快速檢測，對該病害的早期診斷和及時防治具有十分重要的意義。
[0003]目前，關(guān)于花生青枯病菌的檢測方法包括傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法、血清學(xué)和分子生物學(xué)等方法。青枯病菌的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法是采用選擇性培養(yǎng)基對病原物進(jìn)行分離純化，然后進(jìn)行一系列的生理生化實(shí)驗進(jìn)行診斷，該方法易受外界因素的影響且靈敏度較低。而應(yīng)用血清學(xué)方法時血清的制備過程耗時耗力，且可能存在交叉反應(yīng)，造成檢測結(jié)果的假陽性。基于PCR原理的分子生物學(xué)技術(shù)是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的快速檢測技術(shù)，已在多種植物病害的檢測中得到廣泛應(yīng)用。在細(xì)菌基因組中，16S-23S rDNA ITS序列在物種進(jìn)化過程中具有高度的保守性，目前很多病原細(xì)菌分子檢測方法的建立都是基于這一位點(diǎn)。本發(fā)明通過比較花生青枯病菌和同屬近緣種的16S-23S rDNA ITS序列選擇差異位點(diǎn)設(shè)計特異引物，采用巢式PCR對花生青枯病菌進(jìn)行檢測，靈敏度高，特異性強(qiáng)，國內(nèi)外尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種花生青枯病菌的巢式PCR檢測方法，其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可用于田間花生青枯病的早期診斷，對花生青枯病菌引起病害顯癥之前的早期監(jiān)測和及時防治具有十分重要的意義。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上 述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
一種花生青枯病菌的巢式PCR檢測方法，其特征在于:包括以下步驟:
步驟I)、基因組DNA提取:采用CTAB法提取花生青枯病菌基因組DNA或發(fā)病植物組織
DNA ；
步驟2)、第一輪PCR擴(kuò)增:以步驟I)得到的DNA樣品為模板，采用細(xì)菌16S-23S rDNAITS序列通用引物L(fēng)1/L2經(jīng)PCR擴(kuò)增得到第一輪PCR產(chǎn)物；
引物序列:L1:5’ -AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3’ (SEQ ID NO:1)；L2:5’ -GTGCCAAGGCATCCACC-3’ (SEQ ID N0:2)；
PCR 反應(yīng)體系 25 μ I:DNA 模板 I μ 1，IOXPCR 反應(yīng)緩沖液 2.5 μ 1，2.5 mmol/L dNTPs混合液 2μ1，5υ/μ1 DNA 聚合酶 0.5 μ 1，10 μ mol/L 的 LI 引物 I μ 1，10 μ mol/L 的L2引物I μ I，滅菌超純水補(bǔ)足至25 μ I ;
PCR 擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性 4min，94°C變性 I min，60°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;4°C保存；
步驟3)、第二輪PCR擴(kuò)增:以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋液為模板，采用花生青枯病菌特異引物W1/W2經(jīng)PCR擴(kuò)增得到第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
引物序列:W1:5’ -TCCTACCAGACCCACCAAG TTACGG-3’ (SEQ ID NO:3)；
W2:5’ -GTATGTCTCGCTATAGGCTGAGTTC-3’ (SEQ ID N0:4)；
PCR反應(yīng)體系25 μ 1:第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋液I μ 1，10 XPCR反應(yīng)緩沖液 2.5μ 1,2.5 mmol/L dNTPs 混合液 2 μ 1，5U/μ I DNA 聚合酶 0.5 μ 1，10 μ mol/L的Wl引物I μ 1，10 μ mol/L的W2引物I μ 1，滅菌超純水補(bǔ)足至25 μ I ；
PCR 擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性 4min，94°C變性 30sec，60°C退火 30 sec，72°C延伸 40sec,共30個循環(huán)；72°C延伸8min ;4°C保存；
步驟4)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測:取5 μ I第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用1%瓊脂糖凝膠，在110V電壓下電泳30min，之后置于EB內(nèi)染色20min，取出，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照，如果存在374bp的特異條帶，則確定所檢測的病菌為花生青枯病菌；
所述的PCR反應(yīng)緩沖液中均含有Mg2+。
[0006]本發(fā)明具有以下技術(shù)優(yōu)勢和積極效果
1、靈敏度高:本發(fā)明檢測靈敏度為10fg，較常規(guī)PCR靈敏度提高了 100倍。
[0007]2、特異性強(qiáng):本發(fā)明針對性的檢測花生青枯病菌，能從花生青枯病菌基因組中擴(kuò)增出374bp的單一目的條帶，受其他菌類干擾小，準(zhǔn)確率高。
[0008]3、實(shí)用性好:本發(fā)明可用于花生青枯病潛伏期或者感病初期時的病害檢測，對花生枯病病害的早期診斷和及時防治具有十分重要的意義。
[0009]4、操作簡便快速:應(yīng)用本發(fā)明方法，對帶花生青枯病菌的植物組織進(jìn)行病菌DNA提取、PCR擴(kuò)增和常規(guī)的瓊脂糖電泳后即可判定結(jié)果，無需對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，整個檢測過程一般可在8小時內(nèi)完成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是花生青枯病菌特異性檢測擴(kuò)增結(jié)果。
[0011]圖2是花生青枯病菌常規(guī)PCR靈敏性檢測擴(kuò)增結(jié)果。
[0012]圖3是花生青枯病菌巢式PCR靈敏度檢測擴(kuò)增結(jié)果。
[0013]圖4是人工接種花生青枯病菌植物組織的檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1花生青枯病菌的巢式PCR檢測 1.樣品DNA提取
1.1提取菌體DNA將花生青枯病菌接種于NA液體培養(yǎng)基，28°C、200rpm過夜培養(yǎng)，用CTAB法提取細(xì)菌基因組DNA,具體操作如下:
1)取1.5ml培養(yǎng)物于2.0ml離心管中，12000rpm離心2min ;
2)棄上清液，加入567μ I TE緩沖液重新懸浮菌體，加入30 μ I 10%SDS溶液和3 μ I20mg/ml的蛋白酶K,輕輕混勻，于37°C溫育Ih;
3)加入100μ I 5mol/L NaCl溶液，充分混勻，再加入80 μ I CTAB/NaCl溶液，混勻后65°C溫育 IOmin ；
4)加入800μ I的酚/氯仿/異戊醇溶液(三者體積比為25:24:1)，混勻后12000rpm離心5min ；
5)取上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA 沉淀，12000rpm 離心 15 min ；
6)棄上清液,加入1000μ I無水乙醇,混勻，12000 rpm離心5 min ；
7)棄上清液，在超凈工作臺上自然晾干，加入60μ I ddH20溶解DNA，于一 20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0015]1.2提取待檢 植物組織樣品DNA
1)稱取花生莖部組織lO Omg，加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移入2.0ml離心管中；
2)加入1000 μ I CTAB/NaCl 溶液，于 65°C水浴 30min,每各 IOmin 混勻一次，12000rpm離心IOmin ；
3)取上清液800μ I于2.0ml離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇溶液(三者體積比為25:24:1),混勻后12000rpm離心5min ；
4)取上清液750μI于2.0ml離心管中，加入等體積的氯仿/異丙醇溶液(體積比為24:1),混勻，12000rpm 離心 5min ；
5)取上清液500μ I于2.0ml離心管中，加入50 μ I預(yù)冷的3mol/L NaAC溶液(pH=5.2)，混勻，加入50 μ I預(yù)冷的異丙醇，混勻，于一 20°C放置30min ；
6)4°C 1000Orpm離心5min，棄上清液，加入1000 μ I預(yù)冷的75%無水乙醇洗滌沉淀2次，再用無水乙醇洗滌I次，在超凈工作臺上自然晾干，加入60 μ I ddH20溶解DNA，于一20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0016]2.第一輪PCR擴(kuò)增
以提取的菌體DNA和植物組織DNA樣品為模板，采用細(xì)菌16S-23S rDNA ITS序列通用引物L(fēng)1/L2進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。
[0017]引物序列:L1: 5’-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3’ (SEQ ID NO:1)；
L2: 5’ -GTGCCAAGGCATCCACC-3’ (SEQ ID N0:2)；
PCR反應(yīng)體系 25 μ 1:DNA模板 I μ 1，10XPCR反應(yīng)緩沖液(含Mg2+) 2.5 μ 1,2.5 mmol/L dNTPs 混合液 2μ1，5υ/μ1 DNA 聚合酶 0.5 μ 1，10 μ mol/L 的 LI 引物 I μ 1，10 μmol/L的L2引物I μ I，滅菌超純水補(bǔ)足至25 μ I ;
PCR 擴(kuò)增程序:951:預(yù)變性31^11，941:變性 lmin，60°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;4°C保存；
3.第二輪PCR擴(kuò)增
將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍，取I μ I作為DNA模板，采用花生青枯病菌特異引物W1/W2進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。
[0018]引物序列:W1:5’ -TCCTACCAGACCCACCAAG TTACGG-3’ (SEQ ID N0:3)；
W2:5’ -GTATGTCTCGCTATAGGCTGAGTTC-3’ (SEQ ID N0:4)；
PCR反應(yīng)體系25 μ 1:第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋液I μ 1，10 XPCR反應(yīng)緩沖液(含 Mg2+) 2.5 μ I，2.5 mmol/L dNTPs 混合液 2 μ I，5U/ μ I DNA Taq 聚合酶 0.5 μ I，10 μ mol/L的Wl引物I μ 1，10 μ mol/L的W2引物1μ 1，滅菌超純水補(bǔ)足至25μ I ;
PCR 擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性 4min，94°C變性 30sec，60°C退火 30 sec，72°C延伸 40sec,共30個循環(huán)；72°C延伸8min ;4°C保存；
4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測
取5 μ I第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用1%瓊脂糖凝膠，在IlOV電壓下電泳30min，之后置于EB內(nèi)染色20min,取出，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照,如果存在374bp的特異條帶,則確定所檢測的病菌為花生青枯病菌。
[0019]圖1是花生青枯病菌特異性檢測擴(kuò)增結(jié)果。其中，M為2000 bp DNA分子量marker, I為花生青枯病菌，2_13為部分參試菌株，14為陰性對照。
[0020]巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，只有泳道I即花生青枯病菌擴(kuò)增出374bp的特異條帶，而陰性對照和2-13泳道的其他菌株均無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。
[0021]實(shí)施例2花生青枯病菌的常規(guī)PCR靈敏度試驗
將花生青枯病菌基因組DNA分別稀釋為I`Ong/μ 1、Ing/μ 1、IOOpg/μ 1、IOpg/μ 1、lpg/μ lUOOfg/μ 1、10 fg / μ I和I fg / μ I 8個濃度梯度。取各濃度的DNA I μ I作為模板，只用特異性引物W1/W2分別進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，經(jīng)3次重復(fù)后均得到相同的結(jié)果。
[0022]圖2是花生青枯病菌常規(guī)PCR靈敏性檢測擴(kuò)增結(jié)果。其中，M為2000 bp DNA分子量marker, 1-8為不同濃度的花生青枯病菌DNA,其濃度依次為10 ng、lng、100 pg、10 pg、lpg、100 fgUO fg、l fg/μ 1，9 為陰性對照。
[0023]圖2結(jié)果顯示，單獨(dú)使用特異性引物W1/W2進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，泳道1_5均擴(kuò)增出374bp特異條帶，表明病原菌DNA的最低檢測濃度為lpg/μ I。
[0024]實(shí)施例3花生青枯病菌的巢式PCR靈敏度試驗
同實(shí)施例2，將花生青枯病菌基因組DNA分別稀釋為IOng/μ 1、Ing/μ 1、IOOpg/μ 1、IOpg/ μ l、lpg/ μ l、100fg/ μ 1、10 fg / μ I 和 I fg / μ I 8 個濃度梯度。取各濃度的 DNAI μ I作為模板，按實(shí)施例1的步驟2和步驟3，分別依次進(jìn)行第一輪和第二輪PCR擴(kuò)增。
[0025]經(jīng)兩輪PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖3。圖中，M是2000bp DNA分子量marker, 1-8為不同濃度的花生青枯病菌DNA,其濃度依次為10ng、lng、100 pg、10 pg、lpg、100 fgUO fg、l fg/ μ1，9 是陰性對照。
[0026]圖3結(jié)果顯示，經(jīng)過兩輪PCR擴(kuò)增，泳道1-7均擴(kuò)增出374bp的特異條帶，表明病原菌DNA的最低檢測濃度為lOfg/μ I。與實(shí)施例2的結(jié)果相比，本發(fā)明的巢式PCR檢測靈敏度是單獨(dú)使用特異性引物W1/W2進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增檢測靈敏度的100倍。
[0027]實(shí)施例4人工接種花生青枯病菌植物組織的檢測
采用浸種法接種花生青枯病菌。隨機(jī)選取2株發(fā)病植株和3株尚未顯癥植株進(jìn)行檢測，同時以花生青枯病菌基因組DNA為陽性對照，健康花生植株作為陰性對照。提取花生莖部組織DNA，按實(shí)施例1的步驟2和步驟3依次進(jìn)行第一輪和第二輪PCR擴(kuò)增。[0028]兩輪擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖4。其中，M為2000 bp DNA分子量marker，I為陽性對照，2-3分別為發(fā)病植物組織，4-6分別為發(fā)病潛伏期植物組織，7為健康植物組織，8為陰性對照。
[0029]圖4結(jié)果可見，利用巢式PCR對5個樣品進(jìn)行檢測時，泳道2-6均擴(kuò)增出374bp的特異條帶，健康花生植物組織和陰性對照均無擴(kuò)增產(chǎn)物。這表明，本發(fā)明可用于花生青枯病潛伏期或感病初期時的病害檢測。
[0030]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋 范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種花生青枯病菌的巢式PCR檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟I)、基因組DNA提取:采用CTAB法提取花生青枯病菌基因組DNA或發(fā)病植物組織DNA ； 步驟2)、第一輪PCR擴(kuò)增:以步驟I)得到的DNA樣品為模板，采用細(xì)菌16S-23S rDNAITS序列通用引物L(fēng)1/L2經(jīng)PCR擴(kuò)增得到第一輪PCR產(chǎn)物；L1序列為SEQ ID N0:1，L2序列為 SEQ ID NO:2 ； PCR 反應(yīng)體系 25 μ 1:DNA 模板 I μ 1，IOXPCR 反應(yīng)緩沖液 2.5 μ 1，2.5 mmol/L dNTPs混合液 2μ1，5υ/μ1 DNA 聚合酶 0.5 μ 1，10 μ mol/L 的 LI 引物 I μ 1，10 μ mol/L的L2引物I μ I，滅菌超純水補(bǔ)足至25 μ I ; PCR 擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性 4min，94°C變性 I min，60°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;4°C保存； 步驟3)、第二輪PCR擴(kuò)增:以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋液為模板，采用花生青枯病菌特異引物W1/W2經(jīng)PCR擴(kuò)增得到第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；W1序列為SEQ ID N0:3,W2 序列為 SEQ ID NO:4 ； PCR反應(yīng)體系25 μ 1:第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋液I μ 1，10 XPCR反應(yīng)緩沖液 2.5μ 1,2.5 mmol/L dNTPs 混合液 2 μ 1，5U/μ I DNA 聚合酶 0.5 μ 1，10 μ mol/L的Wl弓丨物I μ 1，10 μ mol/L的W2弓丨物1μ 1，滅菌超純水補(bǔ)足至25μ I ; PCR 擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性 4min，94°C變性 30sec，60°C退火 30 sec，72°C延伸 40sec,共30個循環(huán)；72 °C延伸8min ;4°C保存； 步驟4)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測:取5 μ I第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用1%瓊脂糖凝膠，在110V電壓下電泳30min，之后置于EB內(nèi)染色20min，取出，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照，如果存在374bp的特異條帶，則確定所檢測的病菌為花生青枯病菌； 所述的PCR反應(yīng)緩沖液中均含有Mg2+。
【文檔編號】C12Q1/04GK103614475SQ201310609847
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】游泳, 謝世勇, 李本金, 陳慶河, 丁雪玲, 劉裴清 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所