專利名稱：一種藤黃微球菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種藤黃微球菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
石油污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)，近十幾年來(lái)在國(guó)外得到了較大發(fā)展，但是石油烴類污染物降解速度緩慢，致使治理過(guò)程延續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，一直是這項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)突出難點(diǎn)，因此尋找高效石油降解菌是當(dāng)前石油污染土壤微生物修復(fù)技術(shù)的研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可用于降解 石油污染物的藤黃微球菌。該菌株是以原油為唯一碳源篩選出來(lái)的優(yōu)勢(shì)菌株，菌株在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可改變?cè)偷男再|(zhì)，使原油的組分發(fā)生變化，起到乳化、潤(rùn)濕和分散原油的作用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種藤黃微球菌，其特征在于，所述藤黃微球菌為Micrococcus luteus4006，保藏編號(hào)CGMCC No. 6072，保藏日為2012年5月3日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。I、該菌株具有如下的性質(zhì)形態(tài)特征球狀，菌落呈亮黃色，濕潤(rùn)，直徑Imm 2mm，細(xì)胞直徑彡2 u m。生理生化特征革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。2、該菌株的篩選方法為步驟一、富集將從西安市未央?yún)^(qū)長(zhǎng)安大學(xué)渭水校區(qū)陜西省地下水與生態(tài)環(huán)境工程研究中心試驗(yàn)場(chǎng)土壤石油污染10000mg/kg修復(fù)區(qū)IOcm左右紅三葉草根際修復(fù)區(qū)采集的土樣以無(wú)菌方式稱取10. Og,接入100. OmL石油/無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，置于28土1°C、130r/min恒溫?fù)u床富集培養(yǎng)7d ;然后吸取5mL培養(yǎng)液重新轉(zhuǎn)接入新鮮的石油/無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，再進(jìn)行3次富集、馴化，每次7d ;所述石油/無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的組成為NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%,CaCl2O. 0002%,蒸餾水lOOOmL，原油(延長(zhǎng)石油脫水原油)0. 5%，以上均為質(zhì)量百分比，培養(yǎng)基 pH 值 7. 0 7. 5，105KPa 滅菌 20min 25min ；步驟二、篩選和純化將步驟一中富集培養(yǎng)后的富集培養(yǎng)液按十倍稀釋法稀釋，取10_4、10_5、10_63個(gè)稀釋度的培養(yǎng)液各0. ImL涂布于石油/無(wú)機(jī)鹽固體平板培養(yǎng)基上，置于37土 TC恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，選取不同顏色及形態(tài)的優(yōu)勢(shì)單菌落，在石油/無(wú)機(jī)鹽固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行多次劃線分離，以純化得到形態(tài)一致的純化菌株，將純化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步篩選、活化，得到菌株，待用；所述石油/無(wú)機(jī)鹽固體平板培養(yǎng)基的組成為=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%,KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，瓊脂 2%，蒸餾水 lOOOmL，原油(延長(zhǎng)石油脫水原油)0. 5%，以上均為質(zhì)量百分比，培養(yǎng)基pH值7. 0 7. 5，105KPa滅菌20min 25min ；
步驟三、復(fù)篩將步驟二中活化好的菌株分別接種于IOOmL含有l(wèi)wt%正十二烷和lwt%環(huán)己烷的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，28 土 1°C、130r/min搖床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液明顯渾濁后，取ImL培養(yǎng)液接種到含lwt%正十二烷和lwt%環(huán)己烷的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再將培養(yǎng)的菌株接種于IOOmL含有l(wèi)wt%正十二烷和lwt%環(huán)己烷的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如此重復(fù)3次，保存最終仍能使含有正十二烷和環(huán)己烷的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基變渾濁的菌株。3、該菌株的鑒定方法為步驟一、提取總DNA 101、取過(guò)夜培養(yǎng)菌株(至多2X109個(gè))，10000r/min離心Imin收集菌體，加入180 u L 溶菌溶液(20mg/mL 溶菌酶，20mMTris_HCl pH8，2. 5mMEDTA, l%TritonX-100),重懸菌液，37 °C水浴30min 60min ;然后向重懸菌液中添加20 y L蛋白酶K溶液(10mg/mL)，充分振蕩混勻，56°C水浴30min至細(xì)胞完全裂解，接著加入200 u L溶液BD，充分振蕩混勻， 70°C水浴lOmin，再加入200 u L無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻；102、將吸附柱放入收集管中，用移液器將101中振蕩混勻后的菌液全部加入吸附柱中，靜置2min, 12000r/min離心3min,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 u L溶液PW,10000r/min離心Imin,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 u L漂洗溶液Wash buffer, IOOOOr/min離心lmin，倒掉濾液；將吸附柱放入收集管中，于12000r/min離心2min，除去殘留的漂洗液 Wash buffer ；103、取出吸附柱，放入一個(gè)新的1.5mL的離心管，加入50iiL預(yù)熱(60°C)的洗脫液Elution buffer,靜置3min, 10000r/min室溫離心lmin,收集DNA溶液；采用濃度為2%瓊脂糖對(duì)提取的總DNA進(jìn)行檢測(cè)，片段大小在13kb左右；步驟二、16SrDNA的PCR擴(kuò)增以步驟一中提取的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)±曾，PCR反應(yīng)體系DNA模板lOpmol，上游引物(IOiiM)IiU,下游引物(IOiiM)IiU ；dNTP (IOMm) I U I ; 10 X Taq reaction Buffer5 U I ；Taq (5U/ U I) 0. 25 U I ;加水至 50 U I ;PCR 反應(yīng)條件預(yù)變性 98°C 5min ;循環(huán) 95°C 35s，55°C 35s，72°C 30s，35 個(gè)循環(huán)，最后 72 V延伸8min，4°C保存；所述PCR擴(kuò)增的引物序列為上游引物(SEQID NO. I) :5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’ ；下游引物(SEQID NO. 2) :5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ ；步驟三、菌株16SrDNA序列分析及比對(duì)對(duì)步驟二中PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物(片段大小I. 4kb左右)進(jìn)行測(cè)序(由生工生物工程(上海)有限公司協(xié)助完成)，得到的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO. 3)與GenBank中已發(fā)表的藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較，相似度達(dá)99. 0%。綜合生理生化鑒定、16SrDNA序列分析鑒定結(jié)果，鑒定本發(fā)明的菌株為藤黃微球菌。本發(fā)明還提供了上述用于藤黃微球菌在降解石油污染物中的應(yīng)用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明的藤黃微球菌源于土壤，因此該菌株進(jìn)入土壤后很快成為優(yōu)勢(shì)菌群，占據(jù)一定生態(tài)位，有效促進(jìn)石油烴類的降解，優(yōu)化土壤微生物體系，改善土壤的物理性狀，增強(qiáng)土壤的生物活性，修復(fù)板結(jié)退化的土壤。
2、本發(fā)明的藤黃微球菌是以原油為唯一碳源篩選出來(lái)的優(yōu)勢(shì)菌株，菌株在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可改變?cè)偷男再|(zhì)，使原油的組分發(fā)生變化，起到乳化、潤(rùn)濕和分散原油的作用。3、本發(fā)明的藤黃微球菌可在短時(shí)間內(nèi)降解土壤中的石油污染物。下面通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
具體實(shí)施例方式菌株的篩選步驟一、富集將從西安市未央?yún)^(qū)長(zhǎng)安大學(xué)渭水校區(qū)陜西省地下水與生態(tài)環(huán)境工程研究中心試驗(yàn)場(chǎng)土壤石油污染10000mg/kg修復(fù)區(qū)IOcm左右紅三葉草根際修復(fù)區(qū)采集的土樣以無(wú)菌方式稱取10. Og,接入100. OmL石油/無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，置于28土1°C、130r/min恒溫?fù)u床富集培養(yǎng)7d ;然后吸取5mL培養(yǎng)液重新轉(zhuǎn)接入新鮮的石油/無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，再進(jìn)行3次富集、馴化，每次7d ;所述石油/無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的組成為 NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%,CaCl2O. 0002%,蒸餾水lOOOmL，原油(延長(zhǎng)石油脫水原油)0. 5%，以上均為質(zhì)量百分比，培養(yǎng)基 pH 值 7. 0 7. 5，105KPa 滅菌 20min 25min ；步驟二、篩選和純化將步驟一中富集培養(yǎng)后的富集培養(yǎng)液按十倍稀釋法稀釋，取10_4、10_5、10_63個(gè)稀釋度的培養(yǎng)液各0. ImL涂布于石油/無(wú)機(jī)鹽固體平板培養(yǎng)基上，置于37土 TC恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，選取不同顏色及形態(tài)的優(yōu)勢(shì)單菌落，在石油/無(wú)機(jī)鹽固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行多次劃線分離，以純化得到形態(tài)一致的純化菌株，將純化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步篩選、活化，得到菌株，待用；所述石油/無(wú)機(jī)鹽固體平板培養(yǎng)基的組成為=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%,KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，瓊脂 2%，蒸餾水 lOOOmL，原油(延長(zhǎng)石油脫水原油)0. 5%，以上均為質(zhì)量百分比，培養(yǎng)基pH值7. 0 7. 5，105KPa滅菌20min 25min ；步驟三、復(fù)篩將步驟二中活化好的菌株分別接種于IOOmL含有l(wèi)wt%正十二烷和lwt%環(huán)己烷的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，28 土 1°C、130r/min搖床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液明顯渾濁后，取ImL培養(yǎng)液接種到含lwt%正十二烷和lwt%環(huán)己烷的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后再將培養(yǎng)的菌株接種于IOOmL含有l(wèi)wt%正十二烷和lwt%環(huán)己烷的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如此重復(fù)3次，保存最終仍能使含有正十二烷和環(huán)己烷的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基變渾濁的菌株。菌株的鑒定步驟一、提取總DNA 101、取過(guò)夜培養(yǎng)菌株(至多2X109個(gè))，10000r/min離心Imin收集菌體，加入180 u L 溶菌溶液(20mg/mL 溶菌酶，20mMTris_HCl pH8，2. 5mMEDTA, l%TritonX-100),重懸菌液，37 °C水浴30min 60min ;然后向重懸菌液中添加20 y L蛋白酶K溶液(10mg/mL)，充分振蕩混勻，56°C水浴30min至細(xì)胞完全裂解，接著加入200 u L溶液BD，充分振蕩混勻，70°C水浴lOmin，再加入200 u L無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻；102、將吸附柱放入收集管中，用移液器將101中振蕩混勻后的菌液全部加入吸附柱中，靜置2min, 12000r/min離心3min,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 u L溶液PW,10000r/min離心lmin,倒掉濾液；向吸附柱中加入500 u L漂洗溶液Wash buffer, 10000r/min離心lmin，倒掉濾液；將吸附柱放入收集管中，于12000r/min離心2min，離去殘留的漂洗液 Wash buffer ；103、取出吸附柱，放入一個(gè)新的1.5mL的離心管，加入50iiL預(yù)熱(60°C)的洗脫液Elution buffer,靜置3min, 10000r/min室溫離心lmin,收集DNA溶液；采用濃度為2%瓊脂糖對(duì)提取的總DNA進(jìn)行檢測(cè)，片段大小在13kb左右；步驟二、16SrDNA的PCR擴(kuò)增以步驟一中提取的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)±曾，PCR反應(yīng)體系DNA模板lOpmol，上游引物(IOiiM)IiU,下游引物(IOiiM)IiU ；dNTP (IOMm) I U I ; 10 X Taq reaction Buffer5 U I ；Taq (5U/ U I) 0. 25 U I ;加水至 50 U I ;PCR 反應(yīng)條件預(yù)變性 98°C 5min ;循環(huán) 95°C 35s，55°C 35s，72°C 30s，35 個(gè)循環(huán)，最后 72 V延伸8min，4°C保存；所述PCR擴(kuò)增的引物序列為上游引物(SEQID NO. I) :5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’ ；
下游引物(SEQID NO. 2) :5，-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，；步驟三、菌株16SrDNA序列分析及比對(duì)對(duì)步驟二中PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物(片段大小
I.4kb左右)進(jìn)行測(cè)序(由生工生物工程(上海)有限公司協(xié)助完成)，得到的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO. 3)與GenBank中已發(fā)表的藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較，相似度達(dá)99. 0%。綜合生理生化鑒定、16SrDNA序列分析鑒定結(jié)果，鑒定本發(fā)明的菌株為藤黃微球菌,并命名為藤黃微球菌Micrococcus luteus4006，保藏編號(hào)CGMCC No. 6072。本發(fā)明的藤黃微球菌的應(yīng)用效果試驗(yàn)I、藤黃微球菌對(duì)原油的降解能力試驗(yàn)將本發(fā)明的藤黃微球菌接種于含有原油的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于28±1°C,130rpm 發(fā)酵培養(yǎng) 7 天，培養(yǎng)基組成NaN030. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，原油 1%，蒸餾水 IOOOmL,以上均為質(zhì)量百分比，PH7. 0 7. 5，滅菌20min 25min ;與未接種藤黃微球菌的培養(yǎng)基相比，發(fā)酵液的顏色明顯加深，而且，接種藤黃微球菌的發(fā)酵液中的原油具有不掛瓶的特點(diǎn)。這說(shuō)明，本發(fā)明的藤黃微球菌以原油為唯一碳源生長(zhǎng)，改變了原油的性質(zhì)，使原油的組分發(fā)生了變化。將接種藤黃微球菌發(fā)酵后的原油在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)原油中有菌液存在，細(xì)菌存在在油水界面上，并以油為碳源，適應(yīng)環(huán)境產(chǎn)生趨油物質(zhì)，從而起到乳化、潤(rùn)濕和分散原油的作用。2、藤黃微球菌對(duì)培養(yǎng)基中石油的降解試驗(yàn)將本發(fā)明的藤黃微球菌接種于含有原油的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于28±1°C,130rpm發(fā)酵培養(yǎng)7天，含有原油的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基組成=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%g, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，原油 1%，蒸餾水IOOOmL,以上均為質(zhì)量百分比，pH7. 0 7. 5，滅菌20min 25min ;然后分別取IOmL發(fā)酵液接種于IOOmL新鮮的含有原油的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成同上)、含有正十二烷的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基和含有環(huán)己烷的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于28土 TC，130rpm發(fā)酵培養(yǎng)7天，含有正十二烷的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基組成=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%g, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%,正十二烷 1%，蒸餾水IOOOmL,以上均為質(zhì)量百分比，pH7. 0 7. 5，滅菌20min 25min ;含有環(huán)己烷的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基組成=NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%g,FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%,環(huán)己烷1%,蒸餾水IOOOmL,以上均為質(zhì)量百分比，pH7. 0 7. 5，滅菌20min 25min ;以未接種的三種液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，于28 土 1°C，130rpm發(fā)酵培養(yǎng)7天進(jìn)行取樣，分別檢測(cè)接種藤黃微球菌的發(fā)酵液和空白對(duì)照的總石油烴(TPH)降解率、直鏈烷烴降解率和環(huán)烷烴降解率，結(jié)果見(jiàn)表I。表I菌株的石油降解率及其功能
權(quán)利要求
1.一種藤黃微球菌，其特征在于，所述藤黃微球菌為Micrococcus Iuteus 4006,保藏編號(hào) CGMCC No. 6072 o
2.一種如權(quán)利要求I所述藤黃微球菌在降解石油污染物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種藤黃微球菌Micrococcus luteus4006，保藏編號(hào)CGMCC No.6072。另外，本發(fā)明還公開(kāi)了該藤黃微球菌在降解石油污染物中的應(yīng)用。本發(fā)明的藤黃微球菌源于土壤，因此該菌株進(jìn)入土壤后很快成為優(yōu)勢(shì)菌群，占據(jù)一定生態(tài)位，有效促進(jìn)石油烴類的降解，優(yōu)化土壤微生物體系，改善土壤的物理性狀，增強(qiáng)土壤的生物活性，修復(fù)板結(jié)退化的土壤。該藤黃微球菌是以原油為唯一碳源篩選出來(lái)的優(yōu)勢(shì)菌株，菌株在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可改變?cè)偷男再|(zhì)，使原油的組分發(fā)生變化，起到乳化、潤(rùn)濕和分散原油的作用，可在短時(shí)間內(nèi)降解土壤中的石油污染物。
文檔編號(hào)C12R1/265GK102747023SQ201210264209
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者李春榮, 王周峰, 王文科, 申圓圓 申請(qǐng)人:長(zhǎng)安大學(xué)