一株高抗逆性屎腸球菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株高抗逆性屎腸球菌及其應用。屎腸球菌(Enterococcus?faecium)WEI-9?CGMCC?No.7455分離自60日齡仔豬糞便，能夠耐受低pH環境和高濃度豬膽鹽，可以在胃腸消化液中長時間保持活性。本發明的屎腸球菌(Enterococcus?faecium)WEI-9?CGMCC?No.7455對大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直徑達到30-40mm。借此開發的微生態活菌制劑具有顯著的益生特性，可以用于調節畜禽腸道微生態平衡，并在預防或輔助治療畜禽細菌性腹瀉有著廣闊的應用前景。
【專利說明】一株高抗逆性屎腸球菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種屎腸球菌，特別是涉及一株高抗逆性屎腸球菌及其應用。
[0002]背景介紹
[0003]食品安全已是人們越來越關注的問題。飼料作為動物的食品和人類的間接食品，成為食品安全工程的重要一環。我國已啟動“飼料安全工程”，并禁用了一批毒性和殘留較大的飼料添加劑產品。加快安全性較高的新型飼料添加劑產品的開發與生產，對于實現健康養殖及養殖業可持續發展具有重大的現實意義。微生態制劑作為一種綠色、安全的飼料添加劑受到人們的廣泛關注，對于動物健康和養殖業的促進作用正在逐漸的顯現出來。
[0004]然而，目前市售微生態制劑產品質量參差不齊，很多產品所用菌種對胃腸消化液、膽鹽耐受能力差，真正能夠到達小腸發揮功效的菌種很少。為了提高產品效果，不少企業推出微囊化的微生態制劑產品，雖然提高了進入小腸的活菌數，但也大幅增加了生產成本。開發對胃腸消化液、膽鹽有高耐受性的益生菌菌株能大大簡化生產工藝，降低生產成本。
[0005]屎腸球菌是農業部《飼料添加劑品種目錄》所列菌種，可以在微生態制劑中安全使用。屎腸球菌具有 很強的產酸能力，是動物體內天然存在的有益乳酸菌之一，能夠維持宿主腸道微生態平衡，抑制腸道病原菌的大量增殖，能夠刺激腸道粘膜免疫，提高機體的抗病能力，產生有益的代謝產物，防止有害物質產生，改善機體健康水平。
[0006]因此，開發一種能夠耐受胃腸消化液和膽鹽，并對病原微生物有較強抑菌活性的屎腸球菌菌株，對于降低微生態制劑生產成本，強化微生態制劑功效具有重要的意義。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一株可用于調節畜禽腸道微生態平衡及預防畜禽細菌性腹?寫的高抗逆性屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745。
[0008]從健康仔豬糞便中分離、篩選得到一株乳酸菌，經16S rDNA測序鑒定為屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-9,并于2013年6月19日送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC N0.7745，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所郵編:100101電話:86-10-64807596。
[0009]屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745 屬革蘭氏陽性細菌，圓形或橢圓形，呈鏈狀排列，無芽孢，無鞭毛。生長溫度范圍在30-40°C，適宜pH值的范圍
6.0-7.5，是兼性厭氧乳酸菌。該菌株在常規和改良MRS培養基中生長良好，繁殖速度快，在改良MRS培養基中的生長曲線如圖1所示，2h后進入對數期，14h菌數增殖達到最高，穩定期活菌數為0.98X IO9-L 2X IO9CFU / mL。所述改良MRS配方為:每1000mL水中加入蛋白胨 10g，牛肉粉 5g，酵母粉 5g，葡萄糖 20g,吐溫 801mL, K2HPO4.7H202g, NaAC.3H205g，檸檬酸銨 2g, MgSO4.7Η200.58g, MnSO4.H2O0.25g, pH6.8。
[0010]屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-9CGMCC N0.7745 在 pH 為 2-3 的人工胃液中保持3h，存活率80%;在人工胃腸消化液中保持26h，活菌數可以維持在IO7CFU / mL，這個時間符合腸道生理周期，能夠保證菌體發揮益生作用；在豬膽鹽濃度為20g / L的人工豬膽鹽溶液中，保持3h，存活率為51%，這個膽鹽濃度遠遠高于動物體內的0.3g / L的平均膽鹽濃度。
[0011]上述特性評價試驗中，所述人工胃液包括如下成分:每1000mL水中含有胃蛋白酶3g，NaC12g，調pH至2-3 ;所述人工胃腸消化液包括如下成分:人工胃液pH調至3，人工腸液包括如下成分:每1000mL水中含有胰蛋白酶10g，KH2P047gJ pH至7.5，測試過程中，菌體在人工胃液中保持2h，然后接入人工腸液中保持24h ;所述人工豬膽鹽溶液成分包括:每1000mL水中含有胰蛋白酶lg，豬膽鹽20g，NaC15g，調pH至7.0。
[0012]屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-9CGMCC N0.7745 對大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直徑達到30-40mm。
[0013]基于上述特性，本發明提供的屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCCN0.7745具有顯著的益生特性，可以在畜禽腸道定殖，調節畜禽腸道微生態平衡，并在預防或輔助治療畜禽細菌性腹瀉有著廣闊的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1 為屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745 在改良 MRS 培養基中的生長曲線。
[0015]圖2 為尿腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745 對人工胃腸消化液的耐受性。圖中前2h是菌株在人工胃液中的存活曲線，隨后的24h是菌株從人工胃液轉接至人工腸液后的存活曲線。
[0016]圖3 為屎腸球菌(Enterococcus faecium) WE1-9CGMCC N0.7745 對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，圖中是兩個相同劑量實驗組。
【具體實施方式】
[0017]實施例一:屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745 的分離和鑒定
[0018]稱取60日齡健康仔豬的糞便lg，放入盛有99mL滅菌的0.85%生理鹽水的三角瓶中(三角瓶中預先放入20粒無菌玻璃珠)，37°C，180rpm震蕩30min，吸取ImL懸濁液做十倍遞增梯度稀釋，選取2-3個適宜稀釋度，吸取ImL稀釋液于無菌培養皿中，每個稀釋度做兩個平行；向加有稀釋液的培養皿中加入融化后冷卻至46°C的MRS瓊脂培養基，小心轉動培養皿使試樣與培養基充分混合，37°C培養48-72h。從培養皿上挑選不同形態的菌落劃線純化，分別保藏并進行16S rDNA的測序鑒定。
[0019]實施例二:屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-9CGMCC N0.7745 耐受低 pH 胃液、人工胃腸消化液和豬膽鹽
[0020]從屎腸球菌(Enterococcusfaecium) WE1-9CGMCC N0.7745 的保藏斜面(常規MRS培養基)挑一環菌苔接于裝有IOOmL改良MRS培養基的250mL三角瓶中，于37°C，180rpm振蕩培養14h，將菌液在6000rpm的條件下離心10min，棄去上清，用滅菌的0.85%的生理鹽水洗滌一次，再用同體積生理鹽水懸浮。吸取IOmL懸浮菌液分別接于裝有90mL pH分別為1、2、3、4、5的人工胃液和90mL人工豬膽鹽溶液的250mL三角瓶中，豬膽鹽濃度分別為3g/L、5g / LUOg / L、15g / L、20g/L，以不加膽鹽的樣品為對照。然后在37°C，靜置培養180min,分別于初始接種、30min、60min、120min、180min對培養物進行活菌計數,繪制活菌數變化曲線，計算菌株在不同PH人工胃液和不同濃度人工膽鹽中保溫180min時的存活率。菌液在人工胃液中保溫2h后吸取IOmL菌懸液接于裝有90mL人工腸液的250mL三角瓶中，同樣在371:，靜置培養，分別于初始接種、311、611、2111、2411對培養物進行活菌計數，繪制活菌數變化曲線。測定結果顯不，屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745在pH高于 I的人工胃液中保持180min(3h)，存活率達到80%以上；在濃度為20g/L的人工豬膽鹽溶液中保持180min(3h)，存活率超過50% ;在人工胃腸消化液中保持26h，活菌數可以維持在IO7CFU / mL，這個時間符合腸道生理周期，能夠保證菌體發揮益生作用。上述結果表明，屎腸球菌(Enterococcus faecium)WE1-9CGMCC N0.7745能夠耐受酸性環境,耐受高濃度豬膽鹽，并且能夠在消化液中保持足夠長的存活時間，說明屎腸球菌(EnterococcusFaecium)WE1-9CGMCC N0.7745是一株高抗逆性益生乳酸菌，可以經過畜禽的胃、十二指腸后保持活性，并最終進入小腸定殖。
[0021]實施例三:屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745 的抑菌活性
[0022]1.培養液上清的制備
[0023]從屎腸球菌(EnterococcusFaecium) WE1-9CGMCC N0.7745 的保藏斜面(常規MRS培養基)挑一環菌苔接種于液體改良MRS培養基中，37°C，180rpm培養14h，取ImL菌液12000rpm離心Imin,取上清液。
[0024]2.抑菌活性檢測平板的制備
[0025]將15mL完全熔化的LB瓊脂培養基倒入培養皿中，待其凝固后垂直放上牛津杯；另取完全熔化的LB瓊脂培養基，待其冷卻到55°C時加入指示菌混勻，取IOmL混有指示菌的培養基倒入放有牛津杯的培養皿中，待完全凝固后拔出牛津杯，制成檢測平板。所述指示菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌。
[0026]3.抑菌活性的測定
[0027]取200 μ L培養液上清加入檢測平板的孔中，4°C放置24h后放入37°C培養箱中培養20h，測量抑菌圈直徑大小為30-40mm。
【權利要求】
1.一株高抗逆性屎腸球菌及其應用，其特征在于,所述的屎腸球菌(Enterococcusfaecium)為 WE1-9，保藏編號為 CGMCC N0.7745。
2.權利要求1所述的一株高抗逆性屎腸球菌及其應用，其特征在于所述的屎腸球菌WE1-9能夠耐受pH為2-3的人工胃液，并在人工胃液中存活。
3.根據權利要求2所述人工胃液，其特征在于:所述人工胃液包括如下成分:每1000mL水中含有胃蛋白酶3g，NaC12g，調pH至2-3。
4.權利要求1所述的一株高抗逆性屎腸球菌及其應用，其特征在所述的屎腸球菌WE1-9能夠在人工腸消液中存活。
5.根據權利要求4所述人工腸液，其特征在于:所述人工腸液包括如下成分:每1000mL水中含有胰蛋白酶10g，KH2P047g，調pH至7.5。
6.權利要求1所述的屎腸球菌(Enterococcusfaecium)WE1-9CGMCC N0.7745能夠耐受的豬膽鹽濃度達到20g / L0
7.根據權利要求6所述豬膽鹽，其特征在于:配制的豬膽鹽溶液成分包括:每1000mL水中含有胰蛋白酶lg，豬膽鹽20g，NaC15g，調pH至7.0。
8.權利要求1所述的一株高抗逆性屎腸球菌及其應用，其特征在于，屎腸球菌WE1-9對大腸桿菌、沙門氏菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直徑達到30-40mmo
9.權利要求1所述的一株高抗逆性屎腸球菌及其應用，其特征在于，屎腸球菌WE1-9在調節畜禽腸道微生態平衡中的應用。
10.權利要求1所述的一株高抗逆性屎腸球菌及其應用，其特征在于，屎腸球菌WE1-9在預防或輔助治療畜禽細菌性腹瀉中的應用。
【文檔編號】A61P31/04GK103981115SQ201310719804
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2013年12月24日 優先權日:2013年12月24日
【發明者】喬琳, 姚宏明, 高長斌, 劉蕊, 金忠輝 申請人:北京偉嘉人生物技術有限公司, 沈陽偉嘉牧業技術有限公司