專利名稱：一種鴨坦布蘇病毒檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種醫學檢測用試劑盒，確切講本發明是一種用于鴨坦布蘇病毒一步法SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒。
背景技術：
由鴨坦布蘇病毒引起的鴨群疾病現已形成大范圍爆發流行，其主要臨床癥狀為采食量突然下降，體溫升高，排綠色稀便，部分鴨癱瘓，個別鴨精神沉郁，發病后不久產蛋量急劇下降可從90%以上下降至10%以下，剖檢可見卵泡破裂出血，卵黃性腹膜炎，脾臟出血，胰腺出血壞死,肝臟腫大出血。該病具有傳染性,一年四季均可發生,發病率高達90%，死亡率可達5%-30%，以冬春季節多發，各個產蛋階段的鴨均可發病。鴨坦布蘇病毒是近年發現的一種新病毒，目前還沒有預防該病毒的疫苗和有效的治療藥物，主要依靠綜合防治措施加以控制。2010年以來該病首先在我國東南部(上海，浙江，江蘇，福建等省份)爆發，之后蔓延到山東，河南，湖北等省份，疫情一旦爆發便迅速蔓延，該病毒導致的疾病給養殖戶和社會帶來了沉重的負擔，造成了極大的經濟損失。所以建立一種能夠快速，敏感，特異的檢測鴨坦布蘇病毒的方法對該病的控制至關重要。這一工作顯得尤為迫切。目前已報道的基因檢測技術主要有RT-PCR、巢式PCR、RT-LAMP, Taqman RT-PCR等，這些檢測技術(除Taqman RT-PCR)敏感性不夠、陽性率低、易污染、需進行后處理，而且不能準確提供病毒在體內含量的高低，對于Taqman RT-PCR檢測技術，其不僅引物探針設計要求高，而且Taqman探針成本高，不易于大量樣品的檢測。SYBR Green熒光染料法，在PCR反應過程中隨著目的片段的擴增，SYBR Green熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光積累信號，而不摻入鏈中的SYBR Green染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步，該法還可通過融解曲線來分析反應的可靠性，不僅如此該方法價格相對較低，適用于大量田間樣品的檢測。

發明內容
本發明的技術任務在于提供一種特異、敏感、快速、方便、廉價的用于定量檢測鴨坦布蘇病毒的方法；本發明的另一技術任務在于提供一種用于該檢測方法的試劑盒。
本發明的鴨坦布蘇病毒SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒內包含有根據鴨坦布蘇病毒E基因保守區設計的兩條特異性引物SEQl和SEQ2。本發明的試劑盒，其特征在于試劑盒內還含有2X定量PCR反應液包括dNTPMixture、Mg2+、SYBR Green I、RNase Inhibitor、反轉錄酶、Ex Taq HS、ROX ReferenceDye II等。本發明的鴨坦布蘇病毒SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒內含有作為陰性對照的不含鴨坦布蘇病毒RNA樣品和作為陽性對照的含有鴨坦布蘇病毒RNA的樣品。當本發明的試劑盒內除含有特異引物SEQl和SEQ2外，還含有其它的附屬物時，如有 dNTP Mixture、Mg2+、SYBR Green I、RNase Inhibitor、反轉錄酶、Ex Taq HS、ROXReference Dye II等，不含鴨坦布蘇病毒的RNA陰性樣品和含鴨坦布蘇病毒的RNA的陽性樣品，這樣可以使檢測過程更為方便簡捷。 本發明所涉及的引物分別為
SEQl : (RT-EF) 5，-3，ccg cta gat tcg tga taa c ；
SEQ2 (RT-ER) 5，-3，cat ggt aag ttg aga tea tg ；
SEQ3 : (PEF) 5’ _3’ cga att cgc cac cat gat age ccc agcgta cag ctt cag ；
SEQ4 (PER) -3’ cat ctc gag cta ctt gtc gtc ate gtc ttt gta gtc ggc attgac att tac tgc cagga。利用本發明試劑盒進行鴨坦布蘇病毒一步法SYBR Green熒光定量PCR檢測，其優點在于，根據鴨坦布蘇病毒E基因保守區設計特異性引物，在該病毒RNA提取的基礎上，對組織樣品進行熒光定量PCR擴增，實現對鴨坦布蘇病毒的定量檢測。本發明中樣品RNA的提取為常規Trizol法提取，將提取的RNA樣品取2μ I直接加入到分裝于8連管中的反應液中(23 μ I),即可直接用于定量檢測。優選的，上述的一步法SYBR Green熒光定量PCR擴增條件為42°C 5min，95°CIOsec, I個循環一95°C 5sec, 60°C lmin, 40個循環；其中突光信號收集設置在每一循環的60°C，Imin 末；融解曲線條件為 95°C lmin，55°C 30 sec, 5°C 30sec。本發明的試劑盒中有在對鴨坦布蘇病毒E基因序列比對后，根據其保守區域優化設計特異性引物。在使用本發明的試劑盒進行檢測時，是對鴨坦布蘇病毒RNA提取后直接進行定量PCR擴增，同時本發明對反應體系及反應條件進行了優化，使檢測中反轉錄及RCR擴增一步完成，簡化了操作步驟，因此可以縮短反應時間，減少污染幾率，并能提高檢測的準確度和速度，一個檢測反應可在2小時內完成。熒光定量PCR在擴增完成后可直接通過標準曲線定量起始病毒拷貝數，能為流行病學調查提供可靠的信息。同時，所提供的熒光定量PCR試劑盒操作簡單快捷，成本相對較低，適于田間樣品檢測的要求。


圖I是鴨坦布蘇病毒E基因目的序列克隆到pBSK質粒中的重組質粒、酶切和PCR檢測核酸電泳圖，其中
M5000bpDNA MarkerlpBSK質粒對照泳道2:E-pBSK重組質粒檢測泳道3:重組質粒酶切檢測泳道4:重組質粒PCR檢測泳道；
圖2是重組質粒線性化核酸電泳圖，其中
M5000bpDNA MarkerlE-pBSK重組質粒對照泳道2:重組質粒線性化檢測泳道；
圖3是一步法定量PCR的擴增曲線，其中縱坐標代表熒光量，橫坐標代表循環數擴增曲線自左到右表示目的RNA的拷貝數分別為5X IO7 — 5X IO2 ；
圖4是擴增曲線對應的標準曲線，其中縱坐標代表Ct值，橫坐標代表樣品的拷貝數，相關系數R2 1. 000，擴增效率Eff 99. 3% ；
圖5是擴增曲線對應的融解曲線；
圖6是檢測方法特異性的擴增曲線；
圖7是檢測方法敏感性的擴增曲線，其中縱坐標代表熒光量，橫坐標代表循環數擴增曲線自左到右表示目的RNA的拷貝數分別為2X IO7 — 2X 10° ；
圖8是圖7對應的融解曲線；
圖9是常規PCR敏感性試驗電泳圖。
具體實施例方式以下結合具體實例和

對本發明做進一步說明實施例I.鴨坦布蘇病毒熒光定量PCR引物的設計與合成
利用已知的鴨坦布蘇病毒序列進行E基因序列比對，找出其保守區域，再利用PrimerExpress 3. O軟件設計熒光定量PCR引物，引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上下游引物分別為
SEQl : (RT-EF) 5’ _3’ ccg cta gat tcg tga taa cSEQ2 (RT-ER) 5，-3，cat ggt aag ttg aga tea tg。實施例2.標準品的制備
(I)擴增E全長基因上下游引物的設計合成
利用Oligo 6設計出擴增全長E基因的上下游引物SEQ3和SEQ4，并在SEQ3上游引物5’端加I酶切位點，SEQ4下游引物5’端加通ο I位點，引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上下游引物分別為
SEQ3 : (PEF) 5’ _3’ cga att cgc cac cat gat age ccc agcgta cag ctt cagSEQ4 (PER) -3’ cat ctc gag cta ctt gtc gtc ate gtc ttt gta gtc ggc attgac att tac tgc cag ga。(2) E基因與pBSK重組質粒的構建和重組質粒的線性化
取臨床確診患有鴨坦布蘇病毒的病理損傷組織，通過Trizol提取RNA并反轉錄為cDNA,經PCR擴增目的片段，利用膠回收試劑盒(OMEGA)回收純化目的片段，用I和Xho I雙酶切目的片段和pBSK質粒(STRATAGENE)，再用T4 DNA連接酶(NEB)將目的片段和pBSK質粒16°C過夜連接，轉化DH5a感受態細胞，挑單克隆斑于LB (Amp+)中擴大培養，用質粒提取試劑盒(OMEGA)提取質粒，通過PCR和雙酶切(AcoR I和通ο I)鑒定陽性質粒，見附圖1，再通過測序鑒定，將成功構建的陽性質粒大量提取后用通ο I單酶切將其線性化，見附圖2。(3)體外轉錄獲得標準品RNA
以前述線性化的質粒為模板，利用體外轉錄試劑盒(TaKaRa)獲得目的RNA。反應體系為10XT7 RNA polymerase buffer 2 μ 1，DTT 2 μ 1，NTP Mixture (each 2. 5mM) 4 μ I,RNase inhibitor(40U/μ I) 0. 5 μ I,Template DNA(50_500ng) 400ng,T7 RNA polymerase(50U/y I) 1μ 1，DEPC H2O to 20 μ 1，反應條件37°C作用Ih。體外轉錄RNA抽提與純化步驟(a)轉錄的RNA以IOU DNase I，37°C作用lOmin。(b)加入30 μ I DEPC水，再加入50 μ I苯酚氯仿:異戊醇(25:24:1)，渦旋混勻，4°C、12000rpm、10min。(c)取上清，加入50 μ I氯仿:異戍醇(24:1),潤旋混勻，41€、12000印111、10111；[11。(d)取上清,加入1/10體積的3M NaAc (pH=5. 2)再加入2. 5倍體積的冰冷無水乙醇，_20°C作用30_60min。(e) 4°C、12000rpm> 15min,棄上清，用70%冰冷無水乙醇洗漆沉淀。(f) 4°C、7000rpm、5min,棄掉乙醇，真空干燥沉淀，最后以適量DEPC水溶解RNA，測定濃度后于-80°C凍存。
利用公式(copies/μ1)=[(耶數父10 _9)X (6. 02X 10 23)] + (堿基數 X340)換算出目的RNA的拷貝數。實施例3.標準曲線的建立
根據定量后得到的拷貝數，將標準樣品作成2. 5X 102—2. 5X 107 (copies/μ I)等6個梯度稀釋的檢測標準品，為降低誤差，提高實驗的可重復性，每一稀釋度樣品都設有三個重復孔，確定Ct值(Ct即cycle threshold,指反應管內的突光信號達到設定的域值時的所經歷的循環數)，從而確定擴增效果最好的標準曲線。(I)熒光定量PCR擴增
擴增體系為 25 μ 1，其中包括 dNTP Mixture、Mg2+、SYBR Green I,RNase Inhibitor、反轉錄酶、Ex Taq HS, ROX Reference Dye II、上下游引物SEQl和SEQ2等，和稀釋好的標準樣品2 μ I οPCR 擴增米用 Agilent Technologies_Mx3005pPCR 擴增儀,程序為
42°C 5min, 95°C IOsec, I 個循環(反轉錄)
950C 5sec, 60°C lmin, 40 個循環(PCR 擴增)
其中熒光信號收集設置在每一循環的60°C，Imin末；95°C lmin, 55°C 30 sec, 5°C30sec (制作融解曲線)。(2)標準曲線的制備
PCR熒光信號的分析采用安捷倫公司MxPio軟件，所得到的熒光定量PCR擴增曲線以及相應的標準曲線和融解曲線分別見附圖3、4、5。實施例4.特異性的檢測
用下述鴨常見疾病病原禽流感病毒H5和H9亞型、新城疫病毒、鴨肝炎病毒、呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、產蛋下降綜合癥病毒，檢測已建立檢測方法的特異性，所得到的熒光定量PCR結果見附圖6。其中設鴨坦布蘇病毒RNA (此處RNA為臨床上已知黃病毒感染鴨肝臟組織，通過Trizol法提取)陽性對照和水為模板的對照。結果顯示該方法只能特異性的擴增出鴨坦布蘇病毒RNA陽性對照，特異性好。實施例5.敏感性的檢測
將標準樣品作成I X IO7— I X 10° (copies/μ I)等8個稀釋度，檢測已建立方法的敏感性，所得到的熒光定量PCR結果見附圖7，敏感性檢測對應的融解曲線見附圖8。同時用常規PCR檢測同樣稀釋度的樣品，結果見附圖9。根據圖8所示在2個拷貝時的融解曲線有雜峰，表示有非特異性擴增，為確保檢測的準確性，將S 36個循環起峰的樣品判為陽性。根據上述原因，此熒光定量檢測方法能準確的檢測到20個拷貝的病原，而普通PCR只能檢測到2 X IO4個拷貝，由些可見本發明的熒光定量PCR的檢測敏感性是普通PCR的IO3倍，敏感性好。
權利要求
1.一種鴨坦布蘇病毒一步法SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于試劑盒內包含有根據鴨坦布蘇病毒E基因保守區設計的兩條特異性引物SEQl和SEQ2。
2.根據權利要求I所述的鴨坦布蘇病毒SYBRGreen熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于試劑盒內還含有2X定量PCR反應液包括dNTP Mixture、Mg2+、SYBR Green I、RNaseInhibitor、反轉錄酶、Ex Taq HS、ROX Reference Dye II 等。
3.根據權利要求I或2所述的鴨坦布蘇病毒SYBRGreen熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于試劑盒內還有作為陰性對照的不含鴨坦布蘇病毒RNA樣品和作為陽性對照的含有鴨坦布蘇病毒RNA樣品。
全文摘要
本發明公開一種用于鴨坦布蘇病毒的一步法SYBRGreen熒光定量PCR檢測試劑盒。本發明的鴨坦布蘇病毒檢測試劑盒內包含有根據鴨坦布蘇病毒E基因保守區設計的兩條特異性引物SEQ1和SEQ2。采用本發明的試劑盒進行檢測，簡化了操作步驟，可以縮短反應時間，減少污染幾率，并能提高檢測的準確度和速度，一個檢測反應可在2小時內完成。熒光定量PCR在擴增完成后可直接通過標準曲線定量起始病毒拷貝數，能為流行病學調查提供可靠的信息。同時，所提供的熒光定量PCR試劑盒操作簡單快捷，成本相對較低，適于田間樣品檢測的要求。
文檔編號C12Q1/70GK102925585SQ20121026734
公開日2013年2月13日 申請日期2012年7月31日 優先權日2012年7月31日
發明者朱啟運, 付鈺廣, 劉宗梁, 吉艷紅, 郭建宏, 才學鵬 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所