專利名稱：：抑制hiv的短小多肽及藥物用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物醫藥領域，涉及用于抑制HIV的多肽、其藥物組合物及其用途。
背景技術：
：艾滋病(AIDS)主要由人類免疫缺陷病毒I型(HIV-I)引起。自1981年發現艾滋病以來，全球已有超過6000萬人感染艾滋病病毒，其中約2500萬已經死亡。據WHO統計，現在每年新增HIV感染者約200萬，嚴重威脅人類健康。疫苗是預防艾滋病的最好的手段，但有效的艾滋病疫苗近期恐難有重大突破。因此，研發阻斷病毒不同復制階段的藥物是目前防控艾滋病的重點策略。HIV-I的包膜糖蛋白(ENV)介導病毒進入靶細胞的過程。該蛋白由表面亞基gpl20和跨膜亞基gp41通過非共價鍵連接而成。在天然狀態下，ENV為三聚體，其中gpl20形成一個球狀復合物，而gp41則插入病毒包膜內(I)。gpl20的主要功能是與受體CD4和輔助受體(趨化因子受體CCR5或CXCR4等)結合，而gp41主要介導病毒和細胞的膜融合。研究發現，gp41膜外區包含幾個重要的功能區，包括疏水性融合肽(FP)、N-末端螺旋重復序列(NHR或HRl),C-末端螺旋重復序列(CHR或HR2)。早在1997年，通過解析來源于NHR和CHR的多肽復合物的晶體結構，發現gp41的核心結構為六股α-螺旋束(sixhelixbundle,6_HB),其中三個NHR組成的N-螺旋通過在a和d位置的氨基酸殘基相互作用形成位于中心的螺旋三聚體，其e和g位置的氨基酸殘基則暴露于中心螺旋體的外圍，并與三個CHR組成的C-螺旋的a和d位置相互作用(2-4)。C-螺旋以反向平行的方式分別結合在三個N-螺旋形成的溝槽中。基于gp41的三維結構信息提出了HIV-I膜融合機制當gpl20與靶細胞上的受體結合后發生顯著的構象變化，gp41的融合肽(FP)被暴露出來并插入靶細胞膜內，CHR與NHR發生反向結合，形成穩定的6-HB結構，將病毒膜與靶細胞膜拉近而發生融合，從而介導HIV進入靶細胞內(5)。晶體結構揭示NHR含有明顯的疏水口袋狀結構(hydrophobicpocket),被認為是抗HIV藥物的新靶點。十余年來，針對NHR口袋篩選或設計HIV藥物的研究一直是熱點之一。研究表明，CHR包含三個功能區，即位于N端的NHR疏水袋結合區(PBDpocket-bindingdomain,aa628_635)、NHR結合區(NBD:aa628_666)和脂膜結合區(LBDlipid-bindingdomain,aa666_673)。NHR和CHR螺旋間的相互作用對gp41核心結構的穩定性以及病毒的感染活性起著決定性的作用。在6-HB核心結構形成過程中，CHR上PBD的三個氨基酸(Trp628、Trp631和Ile635)以高親和力插入NHR疏水口袋，對穩定六螺旋束結構至關重要(6-7)。然而，以前報道的6-HB結構CHR都起始于Trp628，對其上游序列的結構沒有得到解析(2，4，8)，導致大多研究基于SIVgp41的結構而推測CHR疏水袋結合區上游序列621QIWNNMt627也可能呈現α-螺旋結構(9)。然而，He,Y.等發現含有621QIWNNMt627的多肽CP621-652可以和NHR多肽形成極其穩定的6_HB(Tm=82°C)，遠遠高于被認為gp41核心結構的N36和C34復合體的穩定性(Tm=64°C)。同時，CP621-652具有顯著的抗病毒活性(10)。這些結果提示，CHR上游的621QIWNNMt627位點在gp41介導的膜融合過程有重要影響。為此，He,Y.等對gp41功能性核心結構的概念提出了修正。最近，Chong,H.等對基于CP621-652的6-HB進行了結構解析，發現621QIWNNMt627序列并非螺旋結構(11)。令人興奮的重要發現是，緊鄰CHR的氨基酸殘基Met626和Thr627形成一個獨特的“鉤子”樣結構(命名為M-T鉤子)，通過緊緊“鉤住”NHR上的疏水口袋而穩定6-HB核心結構。實驗結果揭示M-T鉤子對HIV的感染性起著至關重要的作用。該發現為深入研發基于M-T鉤子的HIV融合抑制劑奠定了理論基礎。于2003年獲得美國FDA“快通道”批準的艾滋病治療藥物T20(Enfuvirtide,Fuzeon)即是來源于gp41CHR的含有36個氨基酸殘基的多肽，它主要通過阻斷6-HB的形成過程而發揮作用(12)J20是第一個也是目前唯一的用于臨床治療的HIV膜融合抑制劑，但由于耐藥問題而限制了它的廣泛應用。過去十余年來，靶向gp41的抗病毒多肽一直是HIV藥物研究的熱點(13)。研究發現，衍生于gp41CHR的多肽C34比T20具有更高的抗病毒活性。結構上T20和C34都包含NHR結合區，可以和NHR序列相互作用，但C34包含疏水袋結合區(PBD)而T20缺乏這個基序。C34水溶性較差，很難被發展成為藥物，但由于其代表著CHR的核心序列，所以被廣泛作為新型抗病毒多肽的設計模板(13)。T1249是T20的第二代產品，具有較高的抑制HIV能力，對T20耐藥株也非常有效，但由于劑型問題而停止了臨床試驗(14)。研發第三代或稱下一代高效的融合抑制多肽具有重要的理論意義和應用價值。基于C34的序列，國內設計了抗HIV多肽西夫韋肽(Sifuvirtide),已進行II期臨床試驗(15)。然而令人擔憂的是，基于C34設計的抑制劑容易誘導病毒耐藥的產生(16-17)。同時令人關注的是，以前報道的HIV融合抑制多肽大都具有較長的氨基酸序列，如T20和西夫韋肽含有36個氨基酸殘基，C34含有34個氨基酸殘基，而T1249和T2635均具有39個氨基酸殘基。無疑，多肽的長度與其制備的難度和成本密切相關。最近，日本學者報道了一個具有29個氨基酸的多肽(SC29EK)，具有類似于C34的抗HIV活性，但進一步的截短(如22個氨基酸的SC22EK)則極大地降低多肽的抗病毒活性及與靶點結合的穩定性(18-19)。最近，何玉先等根據對gp41結構與功能的深入研究，設計了一個含有32個氨基酸的多肽P32(中國發明專利申請號201110112709.7)，其抗病毒活性顯著提高，尤其對T20耐藥病毒顯示極強的優勢。參考文獻:I.ZhujP.，LiujJ.，Bess,J.，Jr.，ChertovajE.，LifsonjJ.D.，GrisejH.，OfekjG.A.,TaylorjK.A.,andRouxjK.H.(2006)Distributionandthree-dimensionalstructureofAIDSvirusenvelopespikes.Nature441，847-8522.Chan,D.C.，FassjD.，Berger,J.M.，andKimjP.S.(1997)Corestructureofgp41fromtheHIVenvelopeglycoprotein.Cell89，263-2733.Lu，M.，Blacklow，S.C.，andKimjP.S.(1995)AtrimericstructuraldomainoftheHIV-Itransmembraneglycoprotein.NatStructBiol2，1075—10824.WeissenhornjW.，DessenjA.，Harrison,S.C.，SkeheljJ.J.，andWiley,D.C.(1997)AtomicstructureoftheectodomainfromHIV-Igp41.Nature387，426-4305.Eckert,D.M.,andKimjP.S.(2001)Mechanismsofviralmembranefusionanditsinhibition.AnnuRevBiochem70，777-8106.Chan,D.C.，ChutkowskijC.Τ·，andKimjP.S.(1998)EvidencethataprominentcavityinthecoiledcoilofHIVtypeIgp41isanattractivedrugtarget.ProcNatlAcadSciUSA95，15613-156177.Chan，D.C.，andKimjP.S.(1998)HIVentryanditsinhibition.Cell93,681-6848.Tan,K.,LiujJ.,Wang,J.,ShenjS.,andLu，M.(1997)AtomicstructureofathermostablesubdomainofHIV-Igp41.ProcNatlAcadSciUSA94，12303-123089.Caffrey,M.，CaijM.，Kaufman,J.，Stahl,S.J.，Wingfield,P.T.，CovelljD.G.,GronenbornjA.M.,andClorejG.M.(1998)Three-dimensionalsolutionstructureofthe44kDaectodomainofSIVgp41.EMBOJ17，4572-458410.He，Y.，Cheng,J.，Li,J.，QijZ.，Lu,H.，Dong,M.，Jiang,S.，andDaijQ.(2008)IdentificationofacriticalmotifforthehumanimmunodeficiencyvirustypeI(HIV-1)gp41corestructure:implicationsfordesigningnovelanti-HIVfusioninhibitors.JVirol82,6349-635811.Chong,H.，YaojX.，QiujZ.，QinjB.，HanjR.，WalterspergerjS.，Wang,M.，CuijS.,andHe,Y.(2012)DiscoveryofCriticalResiduesforViralEntryandInhibitionthroughStructuralInsightofHIV-IFusionInhibitorCP621-652.JBiolChem287，20281-2028912.LalezarijJ.P.，Henry,K.，01Hearn,M.，MontanerjJ.S.，PilierojP.J.，TrottierjB.，Walmsley，S.，Cohen,C.，KuritzkesjD.R.，EronjJ.J.，Jr.，Chung,J.，DeMasijR.，DonataccijL，DrobnesjC.，Delehanty,J.，andSalgojM.(2003)EnfuvirtidejanHIV-Ifusioninhibitor,fordrug-resistantHIVinfectioninNorthandSouthAmerica.NEnglJMed348,2175-218513.Steffen，I.，andPohlmannjS.(2010)Peptide-basedinhibitorsoftheHIVenvelopeproteinandotherclassIviralfusionproteins.CurrPharmDes16，1143-115814.EgginkjD.，Baldwin,C.E.，Deng,Y.，Langedijk，J.P.，Lu,M.，Sanders,R.W.,andBerkhoutjB.(2008)SelectionofT1249_resistanthumanimmunodeficiencyvirustypeIvariants.JVirol82，6678-668815.He，Y.，Xiao,Y.，Song,H.，Liang,Q.，JujD.，Chen,X.，Lu,H.，JingjW.，Jiang,S.,andZhang,L.(2008)Designandevaluationofsifuvirtide,anovelHIV-Ifusioninhibitor.JBiolChem283，11126-1113416.ShimurajK.，NamekijD.，KajiwarajK.，Watanab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發明內容本發明所要解決的技術問題是提供具有抗HIV活性的長度在21-30個氨基酸殘基的多肽、其藥用鹽、或其衍生物。本發明所提供的多肽、其藥用鹽、或其衍生物，其中，所述多肽為下述a)或b)或c)a)序列表中序列14所示的多肽HP25-N2；b)在序列表中序列19所示多肽的氨基末端和/或羧基末端添加一個以上氨基酸殘基得到的具有抗HIV活性的衍生多肽，所述衍生多肽由21-30個氨基酸殘基組成；c)在序列表中序列19所示多肽除氨基末端和羧基末端在內的任何位點添加或替代I個以上氨基酸得到的由21-30個氨基酸殘基組成的衍生多肽，所述衍生多肽具有抗HIV活性。其中，序列表中的序列14由23個氨基酸殘基組成；序列表中的序列19由18個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列是序列表中序列14的第3-20位所示的氨基酸序列。在本發明的實施方式中，b)所示的衍生多肽具體為下述bl)_bl7)中的任一種多肽bl)氨基酸序列是序列表中序列18的多肽ELT23；b2)氨基酸序列是序列表中序列9的多肽HP25；b3)氨基酸序列是序列表中序列6的多肽HP28；b4)氨基酸序列是序列表中序列10的多肽HP24；b5)氨基酸序列是序列表中序列5的多肽HP30；b6)氨基酸序列是序列表中序列8的多肽HP26；b7)氨基酸序列是序列表中序列7的多肽HP27；b8)氨基酸序列是序列表中序列15的多肽HP25-N3；b9)氨基酸序列是序列表中序列12的多肽HP24-N2；blO)氨基酸序列是序列表中序列17的多肽HP27-N3；blI)氨基酸序列是序列表中序列16的多肽HP26-N3；bl2)氨基酸序列是序列表中序列13的多肽HP24-N3；bl3)氨基酸序列是序列表中序列11的多肽HP24-N1；bl4)氨基酸序列是序列表中序列I的多肽MT-SC22EK；bl5)氨基酸序列是序列表中序列2的多肽MT-SC21EK；bl6)氨基酸序列是序列表中序列3的多肽MT-SC20EK；bl7)氨基酸序列是序列表中序列4的多肽MT-SC19EK。本發明具體實施方式中所列出的18種多肽的序列如表I所示。表I.多肽序列權利要求1.多肽、其藥用鹽、或其衍生物，其特征在于所述多肽為下述a)或b)或c):a)序列表中序列14所示的多肽HP25-N2；b)在序列表中序列19所示多肽的氨基末端和/或羧基末端添加一個以上氨基酸殘基得到的具有抗HIV活性的衍生多肽，所述衍生多肽由21-30個氨基酸殘基組成；c)在序列表中序列19所示多肽除氨基末端和羧基末端在內的任何位點添加或替代I個以上氨基酸得到的由21-30個氨基酸殘基組成的衍生多肽，所述衍生多肽具有抗HIV活性。2.根據權利要求I所述的多肽、其藥用鹽或其衍生物，其特征在于b)所示的衍生多肽為下述bl)-bl7)中的任一種多肽bl)氨基酸序列是序列表中序列18的多肽ELT23；b2)氨基酸序列是序列表中序列9的多肽HP25；b3)氨基酸序列是序列表中序列6的多肽HP28；b4)氨基酸序列是序列表中序列10的多肽HP24；b5)氨基酸序列是序列表中序列5的多肽HP30；b6)氨基酸序列是序列表中序列8的多肽HP26；b7)氨基酸序列是序列表中序列7的多肽HP27；b8)氨基酸序列是序列表中序列15的多肽HP25-N3；b9)氨基酸序列是序列表中序列12的多肽HP24-N2；blO)氨基酸序列是序列表中序列17的多肽HP27-N3；bll)氨基酸序列是序列表中序列16的多肽HP26-N3；bl2)氨基酸序列是序列表中序列13的多肽HP24-N3；bl3)氨基酸序列是序列表中序列11的多肽HP24-N1；bl4)氨基酸序列是序列表中序列I的多肽MT-SC22EK；bl5)氨基酸序列是序列表中序列2的多肽MT-SC21EK；bl6)氨基酸序列是序列表中序列3的多肽MT-SC20EK；bl7)氨基酸序列是序列表中序列4的多肽MT-SC19EK。3.根據權利要求I或2所述的多肽、其藥用鹽或其衍生物，其特征在于權利要求I或2所述的多肽衍生物為下述I)-5)中的至少一種1)權利要求I或2所述的多肽的氨基端連接氨基端保護基和/或權利要求I或2所述的多肽的羧基端連接羧基端保護基得到的連接物；2)權利要求I或2所述的多肽的羧基端連接寡肽或親脂性基團或膽固醇得到的連接物；3)權利要求I或2所述的多肽的氨基端連接寡肽或親脂性基團或膽固醇得到的連接物；4)權利要求I或2所述的多肽的氨基端和羧基端均連接寡肽或親脂性基團或膽固醇得到的連接物；5)權利要求I或2所述的多肽被蛋白質、聚乙二醇、馬來酰亞胺修飾得到的修飾物。4.根據權利要求3所述的多肽、其藥用鹽或其衍生物，其特征在于權利要求I或2所述的多肽衍生物為權利要求I或2所述的多肽的氨基端連接乙酰基和權利要求I或2所述的多肽的羧基端連接酰胺基得到的連接物。5.由權利要求1-4中任一所述的多肽和/或其藥用鹽和/或其衍生物形成的多聚體。6.一種組合物，其包含Cl)和C2):C1)權利要求1-4中任一所述的多肽、其衍生物、或其可藥用鹽，和/或權利要求5所述的多聚體；C2)藥學上可接受的載體或輔料；所述組合物具有下述Dl)-D5)中的至少一種功能Dl)抗HIV；D2)治療和/或預防和/或輔助治療HIV感染所致疾病(如艾滋病)；D3)抑制HIV進行細胞融合；D4)抑制HIV侵入細胞；D5)抑制HIV復制。7.權利要求1-4中任一所述的多肽、其衍生物、或其可藥用鹽，或權利要求5所述的多聚體，或權利要求6所述的組合物在制備如下至少一種產品中的應用Dl)抗HIV的產品，如藥物或疫苗；D2)治療和/或預防和/或輔助治療HIV感染所致疾病的產品，如藥物或疫苗；D3)抑制HIV進行細胞融合的產品；D4)抑制HIV侵入細胞的產品；D5)抑制HIV復制的產品。8.編碼權利要求I至4中任一項所述多肽的核酸分子。9.產品的制備方法，包括el)或e2)的步驟el)化學合成權利要求1-4中任一所述的多肽的步驟；e2)生物表達權利要求1-4中任一所述的多肽的步驟；所述產品為fl)、f2)或f3)Π)權利要求1-4中任一所述的多肽、其藥用鹽、或其衍生物；f2)權利要求5所述的多聚體；f3)權利要求6所述的組合物。[10.gl)或g2)的生物材料gl)含有權利要求8所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組細胞或重組病毒；g2)表達權利要求1-4中任一所述多肽的重組表達載體或重組細胞。全文摘要本發明公開了抑制HIV的短小多肽及藥物用途。該多肽為下述a)或b)或c)a)序列表中序列14所示的多肽HP25-N2；b)在序列表中序列19所示多肽的氨基末端和/或羧基末端添加一個以上氨基酸殘基得到的具有抗HIV活性的衍生多肽，所述衍生多肽由21-30個氨基酸殘基組成；c)在序列表中序列19所示多肽除氨基末端和羧基末端在內的任何位點添加或替代1個以上氨基酸得到的由21-30個氨基酸殘基組成的衍生多肽，所述衍生多肽具有抗HIV活性。本發明的多肽與其他多肽相比雖然明顯短小但卻具有極強的抗病毒活性，具有易于合成、成本低廉的優點。文檔編號C12N1/21GK102816215SQ20121028005公開日2012年12月12日申請日期2012年8月8日優先權日2012年8月8日發明者何玉先,種輝輝申請人:中國醫學科學院病原生物學研究所