專利名稱：一種同時鑒別食品中豬牛羊雞四種成分的試劑盒及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于食品質量安全檢測技術領域，具體涉及ー種同時鑒別食品中豬牛羊雞四種成分的試劑盒及應用。應用兩步法半巢式-多重PCR技木，設計用于深加工食品中雞、牛、羊、豬同時檢測的試劑盒，將其靈敏度相比現有的PCR和熒光定量PCR技術提高1-3個數量級，可用于DNA嚴重降解的深加工食品中肉類種屬的檢測。
ニ.
背景技術：
肉制品的摻雜摻假是我國食品質量控制面臨的重要挑戰之一。近 年來，不法企業在利益的驅使下，使用相對廉價的豬肉、雞肉等肉類原料，冒充牛肉、羊肉等價格相對較高的肉制品進行銷售，嚴重侵犯了消費者的合法權益。“牛肉膏”事件的曝光使得肉類摻假進ー步成為公眾關注的焦點。近期，河南等地又出現了使用雞肉、鴨肉等冒充羊肉串的事件。肉類食品摻假已成為我國食品質量安全的又一“潛規則”。以聚合酶鏈反應(PCR)為基礎的技術已成為食品中肉類種屬鑒定的核心方法。根據不同物種基因序列的差異位點設計特異性引物，利用PCR反應實現食品中特征基因片段的指數級擴增，繼而通過電泳檢測鑒別食品中可能的物種來源。近年來，實時熒光PCR技術的飛速發展大大提高了食品中物種鑒別的效率和靈敏度，并使得肉類含量的定量溯源成為可能。如今，根據線粒體基因組DNA序列差異設計物種特異性引物，建立PCR與實時熒光PCR方法已見大量報道，且進入了國內權威的檢測技術標準(SN/T 2051-2008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實時PCR法、GB/T 21101-2007動物源性飼料中豬源性成分定性檢測方法PCR方法)，市場上也出現了相關的商品化試劑盒(Takara RealTime PCR Porcine DNA Detection Kit)，在對肉制品摻假進行控制與監管中發揮了重要作用。本實驗室也研發了對四種肉類進行同時快速鑒別的應用多重PCR方法(專利申請號201210099651. 1)，可對食品中豬牛羊雞成分進行高通量的同時快速鑒別。然而，在我們(國家農副產品質檢中心)對肉類樣品種屬的實際檢測中，無論使用上述標準中的PCR或熒光定量PCR方法，還是使用商品化的PCR試劑盒，對ー些經過深加工的肉制品中提取的DNA進行檢測時，常常無法得到擴增條帶或熒光信號。這些深加工肉制品主要包括肉松、火腿腸及紅腸、熟制面制品中的肉餡等。據統計，在我們近期檢測的108份深加工食品中，使用已有方法未能鑒別的有27份，占25. 0%。我們推測，這些食品中的肉類DNA經過深加工已經嚴重降解并片段化，導致作為檢測模板的完整目標DNA片段極少，カロ之有可能存在一定的PCR反應抑制劑，現有的PCR或熒光定量PCR方法的靈敏度已經不能滿足檢測的需要。為了解決這ー問題，我們嘗試了優化反應條件、使用兩步法半巢式-多重PCR技術、截短引物等多種策略，經過試驗，使用半巢式-多重PCR在確保特異性的前提下顯著提升了檢測靈敏度，在此基礎上，我們開發了同時鑒別食品中豬牛羊雞四種成分的高靈敏度試劑盒，可有效地對深加エ食品進行種屬鑒別。
三.發明內容本發明需要解決的問題是針對目前對DNA嚴重降解的深加工食品中肉類種屬鑒定缺乏有效方法的現狀，應用兩步法半巢式-多重PCR技術，開發ー種同時鑒別食品中豬牛羊雞四種成分的高靈敏度試劑盒，優化并確定試劑盒的使用方法，可對應用現有標準方法和試劑盒方法無法檢測的深加工肉類食品進行種屬鑒別。本發明的總體技術路線是以深加工食品中提取的總DNA為模板，首先使用ー對通用引物進行第一輪擴增，擴增目標為豬、牛、羊(包括山羊和綿羊)、雞4個物種線粒體基因組上490bp的同源片段；然后將第一輪擴增產物作為第二輪擴增的模板，正向引物仍使用第一輪擴增的正向引物，反向引物使用豬、牛、羊、雞4個物種的特異性引物，進行第二輪多重PCR擴增，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據條帶分子量不同對肉類種屬進行鑒別。基于上述兩步法半巢式-多重PCR技木，對實驗流程中的關鍵反應條件、試劑成分及濃度進行優化，將半巢式-多重PCR中兩輪PCR反應所需試劑分別配制為預混液I和預混液2，開發出同時鑒別食品中豬、牛、羊、雞四種成分的高靈敏度試劑盒。使用者只需將深加工食品中提取的總DNA與預混液I混合后進行第一輪PCR反應，繼而將第一輪PCR產物與預混液2混合后進行第二輪PCR反應，大大筒化了操作步驟，降低了對操作者的專業要求，3-4小時即可對深加工食品中的4種肉類種屬進行準確鑒別。 使用本發明研制的試劑盒對豬、牛、羊、雞四種目標DNA及其組合、大豆、魚、鵝、馬、驢等物種DNA進行檢測，結果表明本試劑盒的特異性良好，未有交叉反應和非特異性擴增；分別使用10倍梯度稀釋的DNA模板，對本試劑盒對四種目標物種的檢測靈敏度、Takara公司檢測食品中豬源性成分的熒光定量試劑盒(Real Time PCR Porcine DNA DetectionKU)、出入境行業標準中SN/T 2051-2008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法-實時PCR法、本實驗室研制的多重PCR方法(專利申請號201210099651. I)的靈敏度進行驗證并比較，本試劑盒方法的檢測靈敏度比多重PCR方法提高了 2-3個數量級，比標準和商品化熒光定量試劑盒方法提高了 1-2個數量級。如“背景技木”中所述，在國家農副產品質檢中心近期檢測的108份深加工食品中，使用已有的標準方法和試劑盒未能鑒別的有27份，占25. 0%。應用本發明研制的試劑盒方法，成功地對這27份樣品進行了種屬鑒別，發現了 12例肉類摻假，驗證了本試劑盒在深加工食品肉類種屬鑒別方面的獨特優勢和實際應用價值。本發明的技術方案包括1.根據豬、牛、羊、雞4個物種線粒體同源序列設計兩步法半巢式-多重PCR的引物序列。2.應用兩步法半巢式-多重PCR對各目標物種DNA和對照物種DNA進行檢測，驗證方法的特異性。3.優化反應條件和試劑濃度，設計構建鑒別食品中豬、牛、羊、雞4種成分的試劑盒，確定試劑盒的使用方法。4.使用梯度稀釋的目標物種DNA，驗證本發明試劑盒的檢測靈敏度，并與標準方法及商品化試劑盒的靈敏度作比較。5.使用本發明試劑盒方法，對應用現有方法未能鑒別的食品樣品進行種屬檢測。詳述如下
I.根據豬、牛、羊、雞4個物種線粒體同源序列設計兩步法半巢式-多重PCR的引物序列。本發明使用的引物包括第一輪PCR所使用的正向通用引物SMl和反向通用引物SM2，第二輪多重PCR使用的正向引物仍為SM1，反向引物為C(雞)、M (羊)、B (牛)、P(豬)。本發明中，SIMl和C、M、B、P均采用本實驗室研發的同時鑒別食品中這4種目標肉類成分的多重PCR技術的相同引物(專利申請號201210099651. I), SIM2為本發明根據4種目標物種線粒體基因組的高度同源序列設計的反向通用引物，與正向通用引物SIMl配對使用進行第一輪PCR反應，可以同時擴增出4個目標物種490 bp的同源序列作為第二輪多重PCR的模板。引物序列見表1，引物與各物種線粒體基因組的結合位點見附圖I。表I.半巢式-多重PCR試劑盒所用引物序列
用途序 I (5’-3”
第一輪KR的IElSl aw切物
SM ICCCATC AAACATCTC ATCTTG ATGAAA
第二輪靈靈PCE 正fiM號Mfi
SIM2第一蛇 PCR 的反向 53用引物AAGTGGAAGGCGAAG AATCG
C第二輪多重FCR的S幽辨持異性引 物AAG ATACAG ATOAAGAAGAATG AGGCG
B* ニIfe多重 PCR 的 SfimiMi 引翁CTAGAAAAOTGTAACtACCCGTAATATAA
M第二輪多重 KR 的 S__ 辭お I.GCCTATC AATGCTGTCOCTATTGTCGC
P第二較多重 PCR SS_Stt5l )G CTGATAGTAG ATTTGTG ATG ACCGTA
2.應用兩步法半巢式-多重PCR對各目標物種DNA和對照物種DNA進行檢測，驗證方法的特異性。分別使用100 pg XI、牛、羊、豬4種目標物種的基因組總DNA及其各100 pg兩兩組合的混合DNA、以及100 pg大豆、魚、馬、驢四種對照物種DNA作為模板，首先使用SMl和SIM2作為引物進行20個循環的第一輪PCR反應，再取I UL反應產物作為模板，使用SIMl、C、B、M、P混合引物進行第二輪多重PCR反應，取10 ii L產物進行瓊脂糖凝膠電泳，圖譜(附圖2)表明，各反應管均未發生交叉反應和非特異性擴增，作為對照的其他物種DNA也均未發生擴增，表明應用兩步法半巢式-多重PCR檢測個目標物種及其混合DNA特異性良好。3.優化反應條件和試劑濃度，設計構建鑒別食品中豬、牛、羊、雞4種成分的高靈敏度試劑盒，確定其使用方法。在驗證了兩步法半巢式-多重PCR同時鑒別目標物種的特異性基礎上，我們對第ー輪PCR和第二輪多重PCR的反應體系組成、PCR反應條件進行了優化，以設計高靈敏度試劑盒。優化的指標包括引物濃度、多重PCR引物配比、退火溫度、反應循環數、延伸時間。在優化的條件下，我們將第一輪PCR和第二輪多重PCR的反應體系中除模板外的所有成分分別配制為試劑盒的預混液I和預混液2，制作試劑盒，其成分分別為
(I)預混液 I :其中包含引物 SMl 0.40.4 iiM，Taq_1.25 U，dNTP 各
0.2 uM, PH8. 5 的 Tris-HCl 10 mM, KCl 50mM, MgCl2 I. 5 mM，預混液 I 儲藏條件為 4 0C,保質期半年。(2)預混液 2 :其中包含引物 SMl 0. M，引物 P 0.4 iiMj_C0.4 y M，引物 B 0.4 iiM，Taq_1.25 U，dNTP 各 0.2 y M，PH8. 5 的 Tris-HCl 10 mM,KCl 50mM, MgCl2 I. 5 mM，溴酚藍5% (v/v)預混液I儲藏條件為4° C，保質期半年。將優化的兩步法半巢式-多重PCR反應條件作為該試劑盒的說明書，詳述如下
(I)將從肉松、火腿腸等深加工食品中提取的總DNA I ii L與19 UL本試劑盒中的預混液I在冰上混合均勻后，于普通PCR儀上進行擴增反應，反應條件如下95 0C預變性3min，20 個循環的 95 0C 30 s、54 0C 30 s、72 0C 40 s，最后 72 0C 延伸 7 min。(2)取2 UL反應產物，與48 U L本試劑盒中的預混液2在冰上混合均勻后，于普通PCR儀上進行擴增反應，反應條件如下95 °C預變性3 min，30個循環的95 °C 30 S、52 °C 30 s、72 °C 40 s，最后 72 °C 延伸 7 min。(3)取10 u L反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，使用100 bp至1000 bp的DNA分子量標準作為對照。將凝膠在紫外燈下觀察、拍照，根據特異性條帶的分子量大小對食品中四種肉類的種屬進行同時鑒定，雞、牛、羊、豬的特異性條帶大小分別為216 bp, 263 bp,322 bp 和 387 bp。4.使用梯度稀釋的目標物種DNA，驗證本發明試劑盒的檢測靈敏度，并與標準方法及商品化試劑盒的靈敏度作比較。分別使用10倍梯度稀釋的4種目標物種DNA為模板，應用本發明試劑盒進行檢 測，在反應體系中僅加入I Pg模板DNA吋，仍可觀察到目標條帶(附圖3)，表明本試劑盒對于目標物種的檢測靈敏度達到Ipg/反應。同樣使用10倍梯度稀釋的4種目標物種DNA為模板，應用本實驗室開發的多重PCR方法(專利申請號201210099651. I)對4種目標物種進行檢測，其檢測限為100-1000pg/反應；應用我國出入境行業標準SN/T 2051-2008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法和Takara公司豬源性檢測試劑盒提供的實時熒光PCR法對豬的基因組DNA進行檢測，按照Ct值小于35的模板量進行靈敏度確認，其檢測限為10-100 pg/反應。綜上，本發明試劑盒對食品中雞牛羊豬四種物種鑒別的靈敏度較多重PCR法高2-3個數量級，較市售試劑盒和標準中提供的實時熒光PCR法提高1-2個數量級。5.使用本發明試劑盒方法，對應用現有方法未能鑒別的食品樣品進行種屬檢測。在國豕農副廣品質檢中心近期檢測的108份深加工肉制品中，使用已有的標準方法和試劑盒未能對其種屬進行鑒別的有27份，占25. 0%，包括25份肉松、I份火腿腸和I份炒制肉餡，使用Takara種屬鑒定試劑盒和出入境行業標準的Real-time PCR法鑒定時均未有任何熒光信號。應用本發明研制的半巢式-多重PCR試劑盒方法，成功地對這27份樣品進行了種屬鑒別，其中12份均存在著實際種屬與標注的肉類種類不符的情況，均為使用豬肉冒充牛肉松或羊肉餡，證明了本試劑盒適用于現有方法不能鑒別的深加工食品中肉類種屬的鑒定。本發明的有益效果是盡管現有檢測標準、商品化試劑盒PCR和實時熒光PCR法已經為肉制品種屬鑒定提供了快速、靈敏的檢測技木，但在實際檢測中，仍有部分深加工肉制品由于DNA嚴重降解及PCR反應抑制劑的存在，使得上述方法的靈敏度無法達到種屬鑒定的要求。未解決這ー問題，本發明開發了基于半巢式-多重PCR的食品中豬、牛、羊、雞四種肉類成分同時檢測的高靈敏度試劑盒，其靈敏度較現有PCR方法提高了 2-3各數量級，較實時熒光PCR法提高了 1-2個數量級，可達到Ipg/反應。在保證檢測特異性和準確性的前提下，可對應用現有技術無法檢測的深加工食品實現種屬鑒定，是現有技術中靈敏度最聞的種屬檢測方法。應用本試劑盒，可成功地對現有方法不能鑒別的深加工食品進行肉類種屬的鑒定，對深加工食品中肉類摻假進行控制。此外，本試劑盒分別將半巢式PCR兩步反應的試劑進行集成，操作簡便，降低了人員要求。因此，本發明提供的試劑盒是目前唯一專門針對深加工食品中多種肉類鑒別的方法，方法的靈敏度優于現有技術，可用于政府食品安全檢測部門、大型食品銷售企業對深加工肉制品摻假的監管與控制，具有顯著的實用價值。
四.


圖I各目標物種線粒體基因組中的半巢式-多重PCR引物結合序列。C:X| ;B:牛；P 豬；M:羊(包括綿羊S和山羊G);SM1 :正向通用引物；S頂2 :反向通用引物。方框內的序列為引物結合位置。圖2半巢式-多重PCR試劑盒法對各目標物種和對照物種的檢測特異性。泳道 1-15分別將雞、牛、羊、豬、雞加牛、雞加羊、雞加豬、牛加羊、牛加豬、羊加豬、4種目標肉類的混合物、魚、馬、驢、大豆的總DNA作為模板，使用半巢式-多重PCR試劑盒進行物種檢測。姆種目標物種的模板DNA為100 pg/反應。M:DNA分子量標準。圖3半巢式-多重PCR試劑盒法對各目標物種的靈敏度驗證。各泳道代表的每反應中的模板量分別為泳道1-3 :雞總DNA 10 pgU pg和0.1 pg ;泳道4-6 :牛總DNA 10pg、l pg 和 0.1 pg ;泳道 7-9 :羊總 DNA 10 pgU pg 和 0.1 pg ;泳道 10-12 :豬總 DNA 10pg、l pg和0.1 pgo M:DNA分子量標準。
五.
具體實施例方式 I.材料與試劑
Ex Taq DNA聚合酶及反應緩沖液、dNTP、MgCl2、DNA分子量標準DL 1000、電泳上樣緩沖液、Tris-HCl等試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司；電泳級瓊脂糖購自南京生興生物公司；引物及探針委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。2.儀器與設備
PCR 儀(Veritee96-well，美國 ABI 公司)；核酸電泳儀(SUB-cell GT，美國 Bio-Rad 公司);凝膠成像系統(Universal Hood II,美國Bio-Rad公司);高速冷凍離心機(3-18K,美國Sigma公司)；熒光定量PCR儀(7500，美國ABI公司)。 3.兩步法半巢式-多重PCR對各目標物種DNA檢測特異性驗證
兩步法半巢式-多重PCR的引物設計見圖1，方法設計策略見“發明內容”。測定試劑盒法或氛-氯仿抽提法提取的目標肉類的總DNA濃度，調整濃度至100 pg/yl，作為方法特異性驗證的模板。分別將100 pg雞、牛、羊、豬4種目標物種的基因組總DNA及其各100Pg兩兩組合的混合DNA、以及100 pg大豆、魚、馬、驢四種對照物種DNA作為模板，首先使用SIMl和SM2作為引物進行20個循環的第一輪PCR反應，反應體系20 u L，反應條件為95 °C 預變性 3 min，20 個循環的 95 °C 30 s、54 °C 30 s、72 °C 40 s，最后 72 °C 延伸7 min。再取I U L反應產物作為模板，使用SMI、C、B、M、P混合引物進行第二輪多重PCR反應，反應體系50 yL，反應條件為95 °C預變性3 min，30個循環的95 °C 30 s、52 °C30 s、72 °C 40 s，最后72 °C延伸7 min。取10 U L產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否出現交叉反應與非特異性擴增，判斷半巢式-多重PCR方法的特異性。4.半巢式-多重PCR反應條件優化與試劑盒設計
分別調整兩步反應中的引物濃度、多重PCR引物配比、退火溫度、反應循環數、延伸時間，通過對條帶亮度和反應特異性的比較，以獲得最佳的反應條件。
在優化的條件下，將第一輪PCR和第二輪多重PCR的反應體系中除模板外的所有成分配制為試劑盒的預混液I和預混液2，分別直接用于半巢式-多重PCR的第一輪和第二輪反應。5.半巢式-多重PCR試劑盒靈敏度確認以及與現有標準、試劑盒方法的比較 將上述目標物種的總DNAlO倍梯度稀釋，分別應用本發明試劑盒、多重PCR法(專利申請號201210099651. I)、熒光定量PCR法(出入境行業標準SN/T2051-2008、Takara試劑盒)進行物種檢測，通過觀察電泳條帶確定半巢式-多重PCR和多重PCR的檢測靈敏度，通過Ct值為35的模板量確定熒光定量PCR的靈敏度并進行比較。
權利要求
1.一種基于半巢式-多重PCR的同時鑒別食品中豬牛羊雞四種肉類成分的試劑盒，其特征是由以下試劑構成 (1)預混液I :含引物 SMl 0.4 iiM，引物 SM2 0.4 y M，Taq 酶 I. 25 U，dNTP 各 0. 2U M, PH8. 5 的 Tris-HCl 10 mM, KCl 50mM, MgCl2 I. 5 mM，預混液 I 儲藏條件為 4 °C，保質期半年； (2)預混液2:含引物SMl 0. 4u M，引物P 0. 4 PM，引物C 0. 4 PM，引物B 0. 4 u M,引物 S 0. 4 u M, Taq 酶 I. 25 U，dNTP 各 0. 2 u M, PH8. 5 的 Tris-HCl 10 mM, KCl 50mM,MgCl2 I. 5 mM,溴酹藍5%v/v,預混液2儲藏條件為4° C,保質期半年。
2.權利要求I所述試劑盒用于深加工食品中肉類成分的種屬鑒定方法，其特征是由以下步驟構成 (1)將從肉松、火腿腸深加工食品中提取的總DNAI ii L與19 UL本試劑盒中的預混液I在冰上混合均勻后，于普通PCR儀上進行第一輪擴增反應，反應條件如下95 0C預變性 3 min，20 個循環的 95 0C 30 s、54 0C 30 s、72 0C 40 s，最后 72 0C 延伸 7 min ； (2)取2UL反應產物，與48 UL本試劑盒中的預混液2在冰上混合均勻后，于普通PCR儀上進行第二輪擴增反應，反應條件如下95 °C預變性3 min，30個循環的95 °C 30s、52 °C 30 s、72 °C 40 s，最后 72 °C 延伸 7 min ； (3)取10U L反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，使用100 bp至1000 bp的DNA分子量標準作為對照，將凝膠在紫外燈下觀察、拍照，根據特異性條帶的分子量大小對食品中四種肉類的種屬進行同時鑒定，雞、牛、羊、豬的特異性條帶大小分別為216 bp, 263 bp, 322 bp和 387 bp。
3.權利要求I所述試劑盒在現有PCR、熒光定量PCR方法無法鑒別肉類種屬的深加工食品進行檢測或肉類摻假鑒別中的應用。
全文摘要
本發明屬于食品質量安全檢測技術領域，具體涉及一種同時鑒別食品中豬牛羊雞四種成分的試劑盒及應用。基于兩步法半巢式-多重PCR技術，設計了一種用于深加工食品中豬、牛、羊、雞四種肉類成分同時鑒別的高靈敏度試劑盒。經驗證，本試劑盒通過使用半巢式-多重PCR技術，在保證檢測特異性的前提下，極大地提高了現有以PCR技術為基礎的食品物種檢測方法的檢測靈敏度，其靈敏度相比于普通PCR方法提高了2-3個數量級，比熒光定量PCR方法提高了1-2個數量級。本試劑盒可成功地對PCR、熒光定量PCR不能有效鑒別的肉松、肉丸等深加工食品中的肉類成分進行準確鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK102776289SQ20121028103
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月9日 優先權日2012年8月9日
發明者張弛 申請人:南京市產品質量監督檢驗院